蛋白质的分离纯化及双向电泳

蛋白质的分离纯化及双向电泳本章主要内容蛋白质的性质蛋白质分离和纯化蛋白质的分离步骤蛋白质的纯化方法蛋白质含量的测定蛋白质纯度等的测定第2页,共66页，2024年2月25日，星期天蛋白质的两性离解和电泳现象蛋白质的胶体性质蛋白质的沉淀作用蛋白质的变性蛋白质的紫外吸收一、蛋白质的性质第3页,共66页，2024年2月25日，星期天一、蛋白质的性质蛋白质与多肽一样，能够发生两性离解，也有等电点。在等电点时(IsoelectricpointpI)，蛋白质的溶解度最小，在电场中不移动。在不同的pH环境下，蛋白质的电学性质不同。在等电点偏酸性溶液中，蛋白质粒子带负电荷，在电场中向正极移动；在等电点偏碱性溶液中，蛋白质粒子带正电荷，在电场中向负极移动。这种现象称为蛋白质电泳(Electrophoresis)。1蛋白质的两性离解和电泳现象第4页,共66页，2024年2月25日，星期天电泳蛋白质在等电点pH条件下，不发生电泳现象。利用蛋白质的电泳现象，可以将蛋白质进行分离纯化。第5页,共66页，2024年2月25日，星期天由于蛋白质的分子量很大，它在水中能够形成胶体溶液。蛋白质溶液具有胶体溶液的典型性质，如丁达尔现象、布郎运动等。由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，因此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。2蛋白质的胶体性质第6页,共66页，2024年2月25日，星期天蛋白质胶体溶液的稳定性与它的分子量大小、所带的电荷和水化作用有关。改变溶液的条件，将影响蛋白质的溶解性质在适当的条件下，蛋白质能够从溶液中沉淀出来。3蛋白质的沉淀作用第7页,共66页，2024年2月25日，星期天在温和条件下，通过改变溶液的pH或电荷状况，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变化，在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液，所以这种沉淀又称为非变性沉淀。可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法，如等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等。3蛋白质的沉淀作用可逆沉淀第8页,共66页，2024年2月25日，星期天在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水。由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变化，所以又称为变性沉淀。如加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐沉淀和生物碱沉淀等都属于不可逆沉淀。3蛋白质的沉淀作用不可逆沉淀第9页,共66页，2024年2月25日，星期天蛋白质的性质与它们的结构密切相关。某些物理或化学因素，能够破坏蛋白质的结构状态，引起蛋白质理化性质改变并导致其生理活性丧失。这种现象称为蛋白质的变性(denaturation)。4蛋白质的变性第10页,共66页，2024年2月25日，星期天蛋白质的变性变性蛋白质通常都是固体状态物质，不溶于水和其它溶剂，也不可能恢复原有蛋白质所具有的性质。所以，蛋白质的变性通常都伴随着不可逆沉淀。引起变性的主要因素是热、紫外光、激烈的搅拌以及强酸和强碱等。第11页,共66页，2024年2月25日，星期天大部分蛋白质均含有带芳香环的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。这三种氨基酸的在280nm附近有最大吸收。因此，大多数蛋白质在280nm附近显示强的吸收。利用这个性质，可以对蛋白质进行定性鉴定。5蛋白质的紫外吸收第12页,共66页，2024年2月25日，星期天二、蛋白质分离和纯化研究蛋白质的结构、性质和功能，首先需要得到纯的蛋白质样品。(1)蛋白质来源：微生物细胞、动物细胞和植物细胞；(2)随时测定蛋白质活性并检测蛋白质含量。(3)分离和纯化过程都必须在温和的条件下进行。第13页,共66页，2024年2月25日，星期天1．蛋白质的分离步骤(1)生物组织的机械破碎。常用的方法有研磨法、超声波法、冻融法和酶解法等。(2)根据蛋白质的特性，选择不同的溶剂进行抽提。水溶性蛋白用中性缓冲溶液抽提，酸性蛋白用稀碱性溶液抽提，脂溶性蛋白用表面活性剂抽提等。(3)粗提:离心除去固体杂质后，可通过沉淀法、超滤法、萃取法等处理，得到蛋白质粗制品。(4)精制：可用层析法、电泳法等进行精制。(5)成品加工：测定蛋白质的性质并干燥成成品。第14页,共66页，2024年2月25日，星期天2．蛋白质的纯化方法根据蛋白质的亲水胶体性质，当其环境发生改变时，蛋白质会发生沉淀作用(Precipitation)。因为蛋白质分子量大小不同、表面所代电荷不同、表面的亲水和疏水区域不同，所以可以通过可逆沉淀法将蛋白质分离出来。沉淀法具有部分纯化、浓缩特点。(1)沉淀法第15页,共66页，2024年2月25日，星期天沉淀法膜分离法萃取法层析法电泳法2．蛋白质的纯化方法第16页,共66页，2024年2月25日，星期天2．蛋白质的纯化方法蛋白质在高浓度的中性盐溶液中，由于水化层被破坏和表面电荷被中和，容易发生沉淀阴离子化合物的效果是：NH4+>K+>Na+阳离子化合物的效果是：PO43->SO42->Cl-常用的盐为硫酸铵。不同的蛋白质由于所带的电荷和水化程度不同，盐析时所需的盐的浓度也不相同，因而可以将不同的蛋白质加以分离。(1)沉淀法盐析第17页,共66页，2024年2月25日，星期天2．蛋白质的纯化方法在蛋白质溶液中，加入一定量的与水互溶的有机溶剂，由于这些溶剂与水的亲和力强，能够破坏蛋白质的水化层，使蛋白质的溶解度降低而沉淀。常用的有机溶剂有乙醇、甲醇和丙酮等。为了防止蛋白质在分离过程中发生变性，有机溶剂浓度不能太高(30%-50%)，而且需要在低温条件下进行。(1)沉淀法

有机溶剂沉淀法第18页,共66页，2024年2月25日，星期天2．蛋白质的纯化方法蛋白质分子在等电点时，净电荷为零，分子之间的静电排斥力最小，因而容易聚集形成沉淀。当蛋白质混合物溶液的pH被调到某一成分的等电点时，则该蛋白质大部或全部将沉淀出来。而那些等电点高于或低于该pH的蛋白质仍然留在溶液中。该法适用于在等电点pH稳定的蛋白质。(1)沉淀法

等电点沉淀法第19页,共66页，2024年2月25日，星期天2．蛋白质的纯化方法Dialysis此法是利用蛋白质分子不能透过半透膜，而使它与其它小分子化合物，如无机盐、单糖、双糖、氨基酸、小肽以及表面活性剂等分离。常用的半透膜有玻璃纸或高分子合成材料，截止分子量一般为一万。（2）膜分离法

透析法第20页,共66页，2024年2月25日，星期天2．蛋白质的纯化方法透析是将待纯化的蛋白质溶液装在用半透膜制成的透析袋内，再将透析袋放入透析液（通常是蒸馏水或缓冲液）中进行透析。通透动力为半透膜两侧的物质浓度差。（2）膜分离法

透析法第21页,共66页，2024年2月25日，星期天2．蛋白质的纯化方法超过滤技术是在一定的密封容器，施加一定压力使一定分子量的物质透过超滤膜。其中包括有：中空纤维超滤器、圆筒式超滤器、板式超滤器。超滤膜的截止分子量有100万、50万、30万、10万、5万、1万、5千和1千（2）膜分离法超过滤法第22页,共66页，2024年2月25日，星期天2．蛋白质的纯化方法超过滤法第23页,共66页，2024年2月25日，星期天2．蛋白质的纯化方法两种亲水性高分子或一种高分子聚合物与一种盐溶液混合后，因疏水性差异而分层。不同的蛋白质在疏水层的溶解能力不同而被萃取。目前主要采用两种体系聚乙二醇－葡聚糖聚乙二醇－磷酸钾（3）萃取法双水相萃取法第24页,共66页，2024年2月25日，星期天2．蛋白质的纯化方法由于蛋白质表面电荷性质、疏水性质不同，用有机溶剂、表面活性剂、水构成的反相胶束提取某些蛋白质。将表面活性剂溶解于有机溶剂中，等体积加入到蛋白质水溶液内，混合后可使某些蛋白质萃取到反相胶束内。（3）萃取法反相胶束萃取法第25页,共66页，2024年2月25日，星期天2．蛋白质的纯化方法最常用的是二氧化碳，在78.3Mpa压力下，CO2处于液体状态，温度为31.1°C，当压力或温度发生改变时，CO2处于气－液中间态，具有溶剂性能，可以使许多蛋白质及有机物质溶解在某一状态。经过泵出、升温等步骤即可分离出来。（3）萃取法超临界流体萃取法第26页,共66页，2024年2月25日，星期天2．蛋白质的纯化方法（3）萃取法超临界流体萃取法第27页,共66页，2024年2月25日，星期天2．蛋白质的纯化方法此法是利用离子交换树脂作为柱层析支持物，将带有不同电荷的蛋白质进行分离的方法。离子交换树脂可以分为阳离子交换树脂（如羧甲基纤维素等），阴离子交换树脂（如二乙基氨基乙基纤维素等）。带正电荷多的蛋白质与树脂结合较强，而带正电荷少的蛋白质与树脂结合则较弱。用不同浓度的阳离子洗脱液，如NaCl溶液进行梯度洗脱，通过Na+的离子交换作用，可以将带有不同正电荷的蛋白质进行分离。（4）层析法

离子交换层析法第28页,共66页，2024年2月25日，星期天2．蛋白质的纯化方法（4）层析法

离子交换层析法第29页,共66页，2024年2月25日，星期天2．蛋白质的纯化方法此法又称为分子筛层析。凝胶过滤所用的介质是由交联葡萄糖、琼脂糖或聚丙烯酰胺形成的凝胶珠。凝胶珠的内部是多孔的网状结构。Sephadex-葡聚糖凝胶G10-G200Sepharose-琼脂糖凝胶2B,4B,6BSephacryl-丙烯酰胺葡聚糖凝胶S100,S200,S300,S400（4）层析法

凝胶过滤法第30页,共66页，2024年2月25日，星期天2．蛋白质的纯化方法（4）层析法

凝胶过滤法第31页,共66页，2024年2月25日，星期天2．蛋白质的纯化方法利用蛋白质表面存在的疏水区域的强度、大小不同，而被吸附到连接有疏水基团的层析介质上。离子强度增大可增强吸附能力，因此常常在2mol/L或3mol/LNaCl溶解样品，洗脱时可通过降低盐浓度、增加乙二醇浓度进行梯度洗脱。正丁基-Sepharose、正辛基-Sepharose苯基-Sepharose（4）层析法疏水层析第32页,共66页，2024年2月25日，星期天2．蛋白质的纯化方法这是一种高效分离纯化蛋白的方法。其原理是不同的蛋白质分子对于固定化在载体上的特殊配基具有不同的识别和结合能力。选择与待纯化蛋白质具有特殊识别和结合作用的配基，然后应用化学方法将该配基与载体共价连接。将这种连接有配基的载体装入层析柱中，当含有待纯化的蛋白质溶液通过层析柱时，该蛋白质即与配基发生特异性结合而被吸附在层析柱上，而其它蛋白质则流出柱外。被特异性结合在层析柱上的蛋白质，可以用适当的配体洗脱液洗脱。（4）层析法亲和层析法第33页,共66页，2024年2月25日，星期天2．蛋白质的纯化方法

常用的配基有抗体、抗原、激素或受体蛋白、酶的底物和抑制剂等。层析柱载体为琼脂糖凝胶等。（4）层析法亲和层析法第34页,共66页，2024年2月25日，星期天2．蛋白质的纯化方法在外电场的作用下，带电颗粒将向着与其电性相反的电极移动，这种现象称为电泳。蛋白质溶液的pH值不等于等电点时，蛋白质颗粒均带有不同的电荷。由于不同蛋白质的分子量不同，所带的电荷不同，因而在电场中移动的速度也不相同。在外加电场作用下，带电的蛋白质颗粒在电场中移动的速度（v）取决于电场强度(E)，所带的净电荷(q)以及与介质的摩擦系数(f)。（5）电泳法第35页,共66页，2024年2月25日，星期天2．蛋白质的纯化方法SDS（十二烷基磺酸钠）是一种阴离子型表面活性剂，它能够与蛋白质多肽链中的氨基酸残基按大约1

2比例结合。这样，每一个蛋白质分子都因为结合了许多的SDS而带有大量的负电荷，而蛋白质分子原有的电荷则可以忽略。由于所有的蛋白质颗粒都带有大量的负电荷，而且它们的电荷密度也大体相同，因此，E

q值接近一个常数。所以该法主要利用了蛋白质分子量大小不同而分离蛋白质。用已知分子量的蛋白质作为标准，则可以估算出不同蛋白质的分子量。（5）电泳法

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法第36页,共66页，2024年2月25日，星期天2．蛋白质的纯化方法将两性电解质(pH3-9,或其它范围的如pH5-7)同蛋白质样品一起加入到已经铺好的凝胶上，在电场下，两性电解质首先达到它的等电点而平衡，蛋白质样品根据它自身的等电点分别向两极移动，最后也达到平衡。（5）电泳法

等电聚焦第37页,共66页，2024年2月25日，星期天3.蛋白质含量的测定定氮法：灵敏度较低双羧脲法：样品量0.2-1.7mg/LFolin-Lowry法：在碱性条件下磷钼酸、磷钨酸混合试剂与酪氨酸上的酚发生反应，生成蓝色化合物，将其与双羧脲法结合起来，蛋白质形成两种颜色的混合物老绿色，在650nm具有特定的吸收。灵敏度较高25

g-250g/ml.第38页,共66页，2024年2月25日，星期天考马斯亮蓝法（Bradford法）

考马斯亮蓝G250是一种带有负电荷的染料，在酸性条件下，可与蛋白质上的正电荷结合，形成蓝色化合物，在595nm具有特定吸收，反应简便、快速、灵敏度高，5-50

g/ml.紫外吸收法由于核酸在260nm具有光吸收，对测定干扰较大，可采用280nm、260nm同测法。蛋白质浓度mg/ml＝1.45A280-0.74A260第39页,共66页，2024年2月25日，星期天4.蛋白质纯度等的测定纯度和分子量的测定：采用电泳（如聚丙烯酰胺凝胶电泳，梯度凝胶电泳等）、高速离心、分子筛层析、高效液相色谱等技术测定。等电点的测定：利用等电聚焦方法测定。亚基个数的测定：采用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳方法测定。第40页,共66页，2024年2月25日，星期天双向电泳简介及其在园艺学中的应用第41页,共66页，2024年2月25日，星期天第42页,共66页，2024年2月25日，星期天第43页,共66页，2024年2月25日，星期天第44页,共66页，2024年2月25日，星期天第45页,共66页，2024年2月25日，星期天第46页,共66页，2024年2月25日，星期天第47页,共66页，2024年2月25日，星期天第48页,共66页，2024年2月25日，星期天第49页,共66页，2024年2月25日，星期天生物学问题的提出实验模型的设计实验组和对照组样品的制备蛋白样品的IEF和PAGE电泳分离图像扫描和初步分析感兴趣蛋白点的切取胰酶对脱色后蛋白质的消化质谱的多肽指纹图、微测序分析质谱结果的生物信息学分析和比对新蛋白质的发现其它实验的进一步验证蛋白信息的初步获得蛋白质组分析流程第50页,共66页，2024年2月25日，星期天蛋白质组研究的基本技术路线蛋白质样品的制备双向电泳图像分析转印至膜上的蛋白凝胶中的蛋白溶液中的蛋白混合肽蛋白质质量N端测序肽序列质谱数据肽指纹图数据搜索新的或已知蛋白蛋白转录后修饰的鉴定第51页,共66页，2024年2月25日，星期天第52页,共66页，2024年2月25日，星期天第53页,共66页，2024年2月25日，星期天第54页,共66页，2024年2月25日，星期天第55页,共66页，2024年2月25日，星期天第56页,共66页，2024年2月25日，星期天第57页,共66页，2024年2月25日，星期天第58页,共66页，2024年2月25日，星期天第59页,共66页，2024年