遗传重组转座敲除

遗传重组转座敲除重组的定义遗传重组的类型同源重组的分子机制重组和酶位点特异性重组转座转座的机制遗传重组的应用第2页,共88页，2024年2月25日，星期天6.0重组DNA分子的断裂和重新连接导致遗传信息的重新组合，称为重组（recombination）。重组的产物称为重组DNA（recombinantDNA），所有的DNA都是重组DNA。由于重组，一个DNA分子的遗传信息可以和另一个DNA分子的遗传信息结合在一起，也可以改变一条DNA分子上遗传信息的排列方式。DNA重组广泛存在于各类生物中，说明重组对物种生存具有重要意义。通过重组实现基因的重新组合使物种能够更快地适应环境，加快进化的过程。此外，DNA重组还参与许多重要的生物学过程，比如重组在DNA损伤修复和突变中发挥重要作用。第3页,共88页，2024年2月25日，星期天6.1遗传重组的类型

根据对DNA序列和所需蛋白因子的要求，可有三种类型的重组。其共同点是这些过程都涉及双链DNA之间的物质交换，但其发生的情况有所不同。第4页,共88页，2024年2月25日，星期天遗传重组的三种类型（1）同源重组

它的发生是依赖大范围的DNA同源序列的联会。在重组过程中，两个染色体或DNA分子交换对等的部分。⒈需要重组的蛋白质参与，eg.大肠杆菌中的RecA蛋白、RecBCD蛋白；⒉蛋白质因子对DNA碱基序列的特异性要求不高；（存在重组热点和序列长度的影响）⒊真核生物染色质的状态影响重组的频率。特点：第5页,共88页，2024年2月25日，星期天同源重组可能发生在两条同源的DNA的任意位点第6页,共88页，2024年2月25日，星期天(3)异常重组

完全不依赖于序列间的同源性而使一段DNA序列插入另一段中，但在形成重组分子时往往是依赖于DNA复制而完成重组过程。eg.转座作用，需要转座酶和对转座区域DNA的复制。(2)位点专一性重组

重组依赖于小范围同源序列的联会，发生精确的断裂、连接，DNA分子并不对等交换

eg.λ-phageDNA对E.coli的整合(attP→attB)，需要有15bp的同源序列和专一性的蛋白质因子参与。

第7页,共88页，2024年2月25日，星期天位点专一重组发生在两条特定的序列，两条重组DNA的其他序列则是不同的。第8页,共88页，2024年2月25日，星期天位点专一重组能使二聚体环状DNA分子产生两个单体环状DNA分子第9页,共88页，2024年2月25日，星期天6.2同源重组的分子机制同源重组（homologousrecombination）发生在两个同源DNA分子之间。真核细胞减数分裂过程中，同源染色体彼此配对，同源染色体DNA片段发生交叉与互换。DarlingtonD.C.于1936年提出：减数分裂同源染色体联会时，非姊妹染色单体由于缠绕而产生张力，两个染色单体在同一位置断裂、重接，以消除张力，从而产生重组。6.2.1断裂与重接模型第10页,共88页，2024年2月25日，星期天FirstMeioticInterphase

(cellscontain4NDNAcontent)

Bivalentsisterchromatidsalignwitheachother,thisactistermedsynapsis.Synapsedsisterchromatidsaretermedasynaptonemalcomplex)

Figure5-55,page185第11页,共88页，2024年2月25日，星期天两条同源DNA分子彼此并排对齐，相互配对DNA中两个方向相同的单链在DNA内切酶的作用下,在相同位置上同时切开。在切口处发生链的交换，形成所谓的连接分子（jointmolecule），也称Holliday结构（Hollidaystructure）。分支点可以发生移动，称为分支迁移（branchmigration），分支迁移的结果是在两个DNA分子中形成异源双链区（heteroduplex）。1.Hollidaymodel第12页,共88页，2024年2月25日，星期天Synapsedchromatids第13页,共88页，2024年2月25日，星期天RecombinationjointHeteroduplexDNA第14页,共88页，2024年2月25日，星期天第15页,共88页，2024年2月25日，星期天第16页,共88页，2024年2月25日，星期天

链交换所形成的连接分子必须进行拆分，才能形成两个独立的双链分子。这需要再产生两个切口。反应结果要看切开的是哪一对链，如果切口发生在当初未切的两条链上，那么原来的4个链就全被切开，就会释放出剪接重组DNA(splicerecombinantDNA)分子。第17页,共88页，2024年2月25日，星期天ABB’A’ABA’B’ABB’A’HollidayintermediatesABB’A’ABA’B’AB’A’BEndonucleasesaka.resolvases(e.g.RuvC)ProductsbeforeDNArepairHollidayIntermediate(seePhotoinLehningerpg962)第18页,共88页，2024年2月25日，星期天第19页,共88页，2024年2月25日，星期天

如果切口发生在当初被切的两条链上，连接分子拆分后将形成补丁重组体（patchrecombinant）。分开的两个DNA分子除保留了一段异源双链DNA外，均完整无缺。因此，连接DNA分子无论如何拆分，所形成的两个独立的DNA分子总有一段异源双链区，但是异源双链区两侧的重组未必同时发生。第20页,共88页，2024年2月25日，星期天Termed“patchrecombinants”第21页,共88页，2024年2月25日，星期天两条双链体DNA分子间的重组关键是单链的交换。当双链体DNA的单链与相对应的另一双链体中的单链发生置换时，会产生一个分叉结构。交换产生异源双链体DNA片断，两条单链分别来自父本和母本。联合分子可以通过切开相接的链从而形成两条分开的双链体分子。第22页,共88页，2024年2月25日，星期天DNA双链体配对同源链被切出缺口在双链体之间，断裂链交换靠分叉迁移，使交叉点移动在双链体间第二链交叉，切口被封闭两条配对双链体DNA的重组包括相互的单链交换、分叉交换和缺口的切出。第23页,共88页，2024年2月25日，星期天Holliday模型HollidayR.于1964年提出第24页,共88页，2024年2月25日，星期天旋转显示Holliday接头结构

切口控制结果根据链被切出缺口的位置,Holliday结构的结果可产生亲本双链体或重组双链体.两种类型的产物都有一段异源双链体DNA.第25页,共88页，2024年2月25日，星期天

Holliday模型能够较好解释同源重组现象，但也存在问题。该模型认为进行重组的两个DNA分子在开始时需要在对应链相同位置上发生断裂。DNA分子单链断裂是经常发生的事，但很难设想两个分子何以能在同一位置发生断裂。第26页,共88页，2024年2月25日，星期天6.2.3Meselson-Radding模型Holliday模型中为对称的杂合双链，而实际情况有不均等分离现象。1975年，MatthewMeselson和CharlesRadding对Holliday模型进行了修改。第27页,共88页，2024年2月25日，星期天Holliday模型要求在两个并排对齐的同源DNA分子的对应位点形成单链切口，从而产生游离的单链末端。然而，在Meselson-Radding遗传重组模型中，仅在一个双螺旋上产生单链切口。利用切口处3’-OH合成的新链把原有的链逐步置换出来，使之成为以5’－P为末端的单链区。随后游离的DNA单链侵入另一条DNA双螺旋中，取代它的同源单链并与其互补链配对形成异源双链区，被置换的单链形成D－环（D-loop）。D－环单链区随后被切除,两个DNA分子在DNA连接酶的作用下形成Holliday交叉。与Holliday不同，此时只在一条DNA分子上出现异源双链区。如果发生分支迁移，在两条双螺旋上均出现异源双链区。随后发生的连接分子的拆解与Holliday模型一样。第28页,共88页，2024年2月25日，星期天第29页,共88页，2024年2月25日，星期天但是更多的事实表明，重组是由双链断裂所启动。现在认为，同源重组是减数分裂的原因，而不是减数分裂的结果。DNA分子双链断裂才能与同源分子发生链的交换，藉以将同源染色体分配到子代细胞中去。因此，双链断裂启动重组，也启动了减数分裂。第30页,共88页，2024年2月25日，星期天6.2.4双链断裂重组模型

（modelofdouble-strandbreaksrecombination）

一条染色体的两条链都发生了断裂，断裂是由内切酶水解磷酸二酯键的结果。DNA断裂之后由核酸外切酶扩大缺口,接着是断裂链的游离3’端插入到具有完整双链的同源染色体中，形成D-环结构。在DNA聚合酶的作用下，断裂两条链分别以完整链为模板开始合成,最后再通过断裂重接过程完成重组。第31页,共88页，2024年2月25日，星期天在受体中形成双链断裂断裂扩大为含有3’端的间隙3’端转到其他的双链体上3‘端的合成替换了间隙的一条链置换的链迁移到其他双链体上DNA的合成发生于其他3’端间隙被供体序列替代相互移动产生了双交换第32页,共88页，2024年2月25日，星期天6.3重组和酶在原核生物同源重组中存在8个碱基组成的Chi位点（重组热点）——

5'GCTGGTGG3'3'CGACCACC5'

在E.coli中每隔约5~10kb有一个拷贝Rec和Ruv蛋白参与重组。第33页,共88页，2024年2月25日，星期天RecA蛋白RecA具有单链DNA和双链DNA的结合活性，能启动DNA单链和与之互补的双链分子进行碱基配对——催化单链取代。

RecA能促进SOS反应中的蛋白酶活性。第34页,共88页，2024年2月25日，星期天

单链取代

(single-stranduptake)其中一个DNA分子要有单链区；其中一个DNA分子要有游离的3'末端；单链区和3‘末端可和另一DNA分子互补。

RecA具有的处理DNA活性使一条单链能与一条双链体中的同源部分发生置换，这个反应称为单链同化。这个置换反应可发生在几种不同构型的DNA分子之间，但要具备3个条件：第35页,共88页，2024年2月25日，星期天在双链体与单链分子之间RecA催化链交换只要其中的一条反应链有游离端,RecA就能促进入侵的单链同化于双链体DNA中第36页,共88页，2024年2月25日，星期天RecA蛋白介导的DNA链交换模型第37页,共88页，2024年2月25日，星期天RecBCD复合体具有核酸酶，解旋酶和ATPase活性。在Chi位点产生单链3’游离未端.Chi位点能够改变RecBCD的酶活性。一旦RecBCD识别出Chi序列，RecBCD核酸酶活性便发生变化，其3’→5’外切酶活性受到抑制，5’→3’外切酶活性被激活，由原来优先降解3’末端链，改变为只降解5’末端链。但是它的解旋酶活性未受到影响。RecBCD酶活性变化的结果是产生3’末端带有Chi位点的ssDNA。RecBCD蛋白第38页,共88页，2024年2月25日，星期天RecBCD核酸酶从一边开始向chi位点前进,当它前进时,它降解DNA,在chi位点,它进行核酸内切,而后失去RecD,并保留解旋酶活性.第39页,共88页，2024年2月25日，星期天第40页,共88页，2024年2月25日，星期天RuvA可识别Holliday的连接点结构RuvB是ATPase，可发动迁移反应RuvC是一种内切酶，可特异识别Holliday分枝，它在体外可切这个连接体，解离重组中间体。Ruv蛋白第41页,共88页，2024年2月25日，星期天RuvAB是个不对称的复合体，它推进Holliday结合点的分叉迁移第42页,共88页，2024年2月25日，星期天损伤DNA的复制产生间隙RecA介导链交换第二链交换间隙由DNA合成来填补RuvAB介导分叉迁移RuvC切除Holliday连接点第43页,共88页，2024年2月25日，星期天6.4位点特异性重组位点特异性重组是发生在DNA上特定序列之间的重组，不依赖于DNA顺序的同源性，由能识别特异DNA序列的蛋白质介导，并不需要RecA蛋白和单链DNA。第44页,共88页，2024年2月25日，星期天6.4位点特异性重组λ噬菌体DNA侵入大肠杆菌细胞后，面临着裂解生长和溶原生长的选择。要进入溶原状态，游离的λ噬菌体DNA要插入到宿主的染色体DNA中去，这个过程称为整合（integration）。由溶原生长进入裂解生长，λDNA又必须从宿主染色体上切除下来，这个过程称为外切（excision）。整合和外切均需要通过细菌DNA和λDNA特定位点之间的重组来实现，这些位点称为att位点（attachmentsite）。λ噬菌体的int编码整和酶来催化整和反应。第45页,共88页，2024年2月25日，星期天位点专一性重组的核苷酸序列1.POP’:O为15bp(核心)富含A-T的非对称序列；

P为-160~0的160bp序列

P’为0~80的80bp序列2.BOB’:B为-11~0序列

B’为0~11序列λ噬菌体的整合和切除共240bp共23bp第46页,共88页，2024年2月25日，星期天通过在attB和attP之间的相互重组，噬菌体环状DNA转变成线性的前噬菌体；而通过在attL和attR之间的相互重组，前噬菌体能被外切出来。第47页,共88页，2024年2月25日，星期天λ-DNA对E.coli的整合：

POP’+BOB’→BOP’—POB’需要整合酶(Int—拓扑异构酶活性)和整合宿主因子(IHF)参与λ-DNA从E.coli的切离：

BOP’—POB’→POP’+BOB’需要整合酶(Int)、整合宿主因子(IHF)和切除酶(Xis)参与。所有这些蛋白质都结合到attL和attR的P和P’臂上，而attL和attR中央的核心序列并排对齐排列促进原噬菌体的切除。λ噬菌体的整合和切除第48页,共88页，2024年2月25日，星期天第49页,共88页，2024年2月25日，星期天整合的过程:具有对特异性DNA强烈亲和力的Int与attP和attB位点结合；

Int的拓扑异构酶活性，使两条双链各自断开一条单链，瞬间旋转然后交换连接，形成Holliday中间体，在另两条单链之间发生同样的断裂重接，从而完成双链间的重组。第50页,共88页，2024年2月25日，星期天Int和IHF结合到attP的不同位点，在核心区域的Int识别位点包括被切割位点第51页,共88页，2024年2月25日，星期天attB和attP的共同核心序列的交叉切割允许成十字架状的连接，使相互之间能产生重组连接点。第52页,共88页，2024年2月25日，星期天转座

在生物的基因组中存在一类特殊的DNA序列，它们能够作为独立的单位从基因组的一个位置移动到另一个位置，这种能够改变自身位置的DNA序列被称为转座子（transposons）。第53页,共88页，2024年2月25日，星期天

所有的转座子都有两个基本特征。首先，转座子的两端为反向重复序列（invertedrepeat）。第二，转座子至少含有一个编码转座酶（transposase）的基因。很多转座子还携带有与转座不相关的基因，例如抗生素抗性基因、毒性基因等。这些基因位于转座子内，随转座子一起从一个DNA分子移动到另一个DNA分子，对基因组的进化产生了十分重要的影响。第54页,共88页，2024年2月25日，星期天DNA转座子

（一）细菌的DNA转座子1.插入序列(insertionsequences,IS)插入序列是最简单的转座子。典型的插入序列长750～1500bp，具有10～40bp长的末端反向重复序列。IS元件的两个末端并非是十分精确的反向重复序列。所有的IS元件都含有一个编码区，它编码的转座酶能识别IS元件的末端重复序列，为一种介导转座过程关键蛋白质组分。转座酶对IS元件两个边界的识别保证了IS元件作为一个整体在基因组中移动。第55页,共88页，2024年2月25日，星期天第56页,共88页，2024年2月25日，星期天IS元件位于细菌的染色体上，也存在于噬菌体和质粒的DNA分子中。在大肠杆菌的染色体中发现了几个拷贝的IS1、IS2和IS3。F因子中没有IS1，但有一个拷贝的IS2和两个拷贝的IS3。当质粒和染色体上具有相同的IS元件时，质粒可以通过同源重组整合到宿主细胞的染色体上。第57页,共88页，2024年2月25日，星期天复合转座子

(compositetransposon)

中心区携带有抗药性标记(Drugmarker)，两侧有被称为模块（module）的IS元件或类IS元件。

每个IS元件都有以倒转重复序列为末端的一般结构，所以复合转座子也是以同样的倒转重复序列为末端的。有些复合转座子两侧IS序列是相同的,另一些例子中，模块高度同源但不相同。与IS序列一样，复合转座子的转座也会在靶基因组中产生短的正向重复。第58页,共88页，2024年2月25日，星期天第59页,共88页，2024年2月25日，星期天第60页,共88页，2024年2月25日，星期天Tn3

转座子Tn3代表另一类更为复杂的转座子。这类转座子的两个侧翼序列不是IS或类IS序列，而是短的倒转重复序列；Tn3的反向重复序列的长度是38bp。在两个倒转重复序列之间有3个基因。

第61页,共88页，2024年2月25日，星期天AmapoftransposonTn3.第62页,共88页，2024年2月25日，星期天转座的分子机制

转座子可以通过两种机制进行转座。一种是保守型转座（conservativetranspositin），一种是复制型转座（replicativetransposition）。在保守型转座中，转座元件从供体位点上切除，然后插到靶位点上，因此这个机制又叫做剪切－粘贴转座（cut-and-pastetransposition）。在复制型转座中，转座子被复制，转座的DNA序列是原座因子的一个拷贝，而不是它本身。因此，复制型转座伴随着转座子拷贝数的增加。第63页,共88页，2024年2月25日，星期天1.保守转座某些细菌转座子，包括很多IS元件和复合转座子，都是通过一种称为剪切－粘贴机制进行转座的。这种相对简单的机制是一个保守的过程，即只有靶序列被复制，而原始的转座子则不发生复制。第64页,共88页，2024年2月25日，星期天第65页,共88页，2024年2月25日，星期天2.复制型转座进行复制型转座的转座子除了具有编码转座酶的基因外，还具有编码解离酶（resolvase）的基因以及解离酶的作用位点，即内部解离位点（internalresolutionsite,IRS）。第66页,共88页，2024年2月25日，星期天第67页,共88页，2024年2月25日，星期天第68页,共88页，2024年2月25日，星期天69(四)真核生物DNA转座子

1.玉米胚乳颜色的控制因子第69页,共88页，2024年2月25日，星期天花斑色是由于突变造成的，而且这种突变不是常规突变，是与一种“控制因子”（controllingelement)的存在引起的。（2）解释如果有C基因，胚乳合成色素，呈紫色；如果C突变（c），胚乳无色素，呈白色。在c胚乳的发育过程中，部分细胞发生恢复突变（C），形成色斑。突变发生的越早，色斑就越大。（1）杂交结论第70页,共88页，2024年2月25日，星期天McClintock认为原来的c突变是由一个“可移动的控制因子”（现在称转座子）引起的，称为Ds，即解离因子（dissociator）。它可以插入到C基因中。另一个可移动的控制因子是Ac，称激活因子（activator），它的存在能够激活Ds转座进入C基因或其它基因，也能使Ds从基因中转出，使得突变基因回复突变成野生型基因，这就是著名的Ac-Ds系统。第71页,共88页，2024年2月25日，星期天（3）对突变的解释：Ac-Ds系统为什么总是恢复突变、而且高频率？McClintock认为C突变为c是由于一个“可移动的控制因子”（transposablecontrollingelement）的插入引起的，她称之为Ds（dissociator）。①解离因子Ds第72页,共88页，2024年2月25日，星期天另外还有一个控制因子Ac（activator），它能激活：②激活因子AcDs插入C基因（引起突变），或从C基因中转出（恢复突变）。W:white（C基因）第73页,共88页，2024年2月25日，星期天在插入位点上造成8bp的正向重复（DR），并导致染色体断裂。Ac引起Ds插入色素基因第74页,共88页，2024年2月25日，