酶工程制药技术

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酶工程的研究内容及应用酶工程的基本概念和基本技术，酶和细胞的固定化技术影响工程制药酶活性的因素及工程制药酶的来源第2页,共53页，2024年2月25日，星期天目录概述

工程制药酶药物的酶法生产

123第3页,共53页，2024年2月25日，星期天思考叶绿体的生理功能是什么？光合作用6CO2+12H2OC6H12O6+6O2+6H2O光能叶绿体第4页,共53页，2024年2月25日，星期天色素分子可见光C52C3ADP+PiATP2H2OO24[H]多种酶酶C6H12O6+H2OCO2吸收光解能固定还原酶光反应暗反应光合作用的过程光合作用怎样进行？第5页,共53页，2024年2月25日，星期天第一节概述一、酶的特性

酶是生物体内具有生物催化活性的生物大分子（蛋白质或核酸）。

酶=蛋白质/蛋白质+辅酶第6页,共53页，2024年2月25日，星期天一、酶的特性普通催化剂酶的特性反应条件温和催化效率高专一性强加快反应速度降低反应活化能不改变反应性质活性受到调节和控制反应前后数量、质量不变第7页,共53页，2024年2月25日，星期天高效性以分子比表示，酶的催化反应的速度比非催化反应高108—1020倍，比非酶催化剂高105—1013倍。FeCl3第8页,共53页，2024年2月25日，星期天高效性第9页,共53页，2024年2月25日，星期天专一性第10页,共53页，2024年2月25日，星期天酶的调节第11页,共53页，2024年2月25日，星期天酶的分类氧化还原酶类水解酶类异构酶类转移酶类裂合酶类合成酶类第12页,共53页，2024年2月25日，星期天二、酶工程的研究内容

酶工程是酶学和工程学相互渗透结合、发展而形成一门新的技术学科。它是从应用的目的出发研究酶、应用酶的特异性催化功能，并通过工程化将相应原料转化成有用物质的技术。第13页,共53页，2024年2月25日，星期天二、酶工程的研究内容酶和细胞固定化、酶反应器分离、提取、大生产、应用酶分子改造、修饰基因工程、遗传修饰酶酶抑制、激活剂有机相酶反应人工设计酶抗体、核酸酶

内容第14页,共53页，2024年2月25日，星期天三、酶工程的研究进展及应用（一）酶工程的研究进展1.酶的化学修饰抗原性、蛋白水解酶水解、抑制剂抑制、体内半衰期短应用受限提高稳定性、解除抗原性、改变酶学性质、扩大应用范围第15页,共53页，2024年2月25日，星期天（一）酶工程的研究进展1.酶的化学修饰

对酶在分子水平上用化学方法进行改造，即在体外将酶分子通过人工方法与一些化学基团，特别是具有生物相容性的大分子进行共价连接，从而改变酶分子的酶学性质的技术。第16页,共53页，2024年2月25日，星期天2.酶的人工模拟

根据酶的工作原理，用人工方法合成的具有活性中心和催化作用的非蛋白质结构的化合物叫人工模拟酶。人工磷酸化酶的催化简图

（一）酶工程的研究进展第17页,共53页，2024年2月25日，星期天（一）酶工程的研究进展3.有机相的酶反应——在含有有机溶剂的介质中进行的催化反应。增加疏水性物质的溶解度热力学平衡向合成方向移动可抑制有水参与的副反应利于酶的回收再利用容易从沸点低的溶剂中分离产物酶的热稳定性高，pH适应性扩大无微生物污染能测定水介质中不易测定的常数固定化酶法简单第18页,共53页，2024年2月25日，星期天1酶基因的克隆和表达酶基因的遗传修饰酶的遗传设计基因工程酶23

44.基因工程酶的构建（一）酶工程的研究进展第19页,共53页，2024年2月25日，星期天药物生产亲和层析医疗应用酶工程的特点：工艺简单、效率高、生产成本低、污染环境小，产品收率高、纯度好。可制造出化学法无法制备的产品。（一）酶工程在医药工业中的应用第20页,共53页，2024年2月25日，星期天固定化青霉素酰化酶磷酸二酯酶L-氨基酸（一）酶工程在医药工业中的应用第21页,共53页，2024年2月25日，星期天（一）酶工程的研究进展亲和层析第22页,共53页，2024年2月25日，星期天第二节工程制药酶一、工程制药酶的来源

第23页,共53页，2024年2月25日，星期天微生物生产酶制剂特点微生物种类繁多繁殖快、生产周期短、培养简便适应性强，能通过遗传变异手段培育高产菌株

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3一、工程制药酶的来源

第24页,共53页，2024年2月25日，星期天一、影响工程制药酶活性的因素

第25页,共53页，2024年2月25日，星期天底物浓度

第26页,共53页，2024年2月25日，星期天酶浓度

底物过量第27页,共53页，2024年2月25日，星期天温度

第28页,共53页，2024年2月25日，星期天pH

第29页,共53页，2024年2月25日，星期天抑制剂

非竞争性抑制剂第30页,共53页，2024年2月25日，星期天抑制剂-可逆性抑制

第31页,共53页，2024年2月25日，星期天中毒、解毒巯基酶抑制羟基酶抑制剂

抑制剂——不可逆抑制

第32页,共53页，2024年2月25日，星期天抑制剂——不可逆抑制

二巯丙醇第33页,共53页，2024年2月25日，星期天抑制剂——不可逆抑制

解磷定、阿托品第34页,共53页，2024年2月25日，星期天第三节药物的酶法生产一、酶的选择1.底物特异性2.pH3.温度4.激活剂和抑制剂5.价格因素第35页,共53页，2024年2月25日，星期天第三节药物的酶法生产二、酶的反应条件1.底物浓度对反应速度的影响2.酶浓度对反应速度的影响3.pH对反应速度的影响4.温度对反应速度的影响5.激活剂和抑制剂对反应速度的影响第36页,共53页，2024年2月25日，星期天三、酶和细胞的固定化技术（一）固定化酶的制备

1.固定化酶的定义——是指限制或者固定于特定空间位置的酶，具体来说，就是指经过物理、化学方法处理，使酶变成不易随水流失的固定化催化剂。制备固定化酶的过程称为酶的固定化。酶可以采用经过分离后高纯度的提纯酶、也可以是菌体细胞碎片上的酶系，甚至可以是死细胞上的酶。第37页,共53页，2024年2月25日，星期天三、酶和细胞的固定化技术（一）固定化酶的制备

2.固定化酶的特点（1）稳定性很高，可以多次连续使用。（2）产物中不含酶，易于纯化。（3）反应条件易于控制，可实现连续化和自动控制。（4）酶的利用率高，实际使用量较少。（5）比水溶性酶更适合进行多酶反应。（6）固定化酶属于修饰酶，可以改良。第38页,共53页，2024年2月25日，星期天（一）固定化酶的制备

3.酶和细胞的固定化方法第39页,共53页，2024年2月25日，星期天（1）物理吸附法A、物理吸附法的优点：

（1）操作简单

（2）可选用不同的吸附剂

（3）酶失活之后，载体可以再生B、物理吸附法的缺点：

（1）酶的最适吸附量无规律可寻

（2）酶与载体之间的吸附力不强，酶容易脱落。C、常用的吸附剂第40页,共53页，2024年2月25日，星期天（2）离子结合法A、离子结合法的优点----操作简单、处理条件温和，酶的活性中心不容易被破坏。B、离子结合法的缺点----载体和酶的结合力较弱、常常发生酶脱落的现象C、常用的离子结合剂树脂----阴离子交换树脂、阳离子交换树脂、多糖类离子交换剂、合成高分子类离子交换剂。每克载体能吸附50-150mg酶蛋白。DEAE-纤维素Amberlite-CG-50Amberlite-XE-97Amberlite-IR-45Dowex-50第41页,共53页，2024年2月25日，星期天（3）共价键结合法酶分子上的氨基、羧基、羟基、咪唑基、巯基与载体表面的反应基团形成共价键，因而将酶固定在载体上的方法。A、共价键结合法的优点----酶与载体结合牢固，酶不会发生脱落。B、共价键结合法的缺点----操作复杂、反应条件苛刻，酶的活性中心会遭到部分性的破坏。C、共价键结合法的类别重氮化 迭氮化

酸酐活化法 酰氯法

异硫氰酸酯法 缩合剂法

溴化氰活化法 烷基化法纪

硅烷基化法第42页,共53页，2024年2月25日，星期天交联法交联法是采用双功能、或者多功能试剂，使得酶与酶之间发生交联的固定化方法。基团之间的交联通过共价键结合。交联法的优点----交联后的酶活性较高交联法的缺点----反应条件剧烈、酶的回收率低。第43页,共53页，2024年2月25日，星期天交联法的类别和内容类别酶与酶交联法酶与辅助蛋白交联法吸附交联法载体交联法内容分子内交联分子间交联酶与辅助蛋白分子之间交联酶与载体之间交联第44页,共53页，2024年2月25日，星期天（3）参与交联的酶蛋白功能团和常用的交联剂参与交联的酶蛋白功能团N-末端的α-氨基赖氨酸的ε-氨基酪氨酸的酚基半胱氨酸的巯基组氨酸的咪唑基常用的交联剂戊二醛双重氮联苯胺-2、2-二磺酸1、5-二氟-2、4-二硝基苯已二酰亚胺二甲酯第45页,共53页，2024年2月25日，星期天3、包埋法包埋法的优点----不需要改变酶的高级结构，酶的回收率较高。包埋法的缺点----包埋酶容易导致酶的失活，包埋法只适用于小分子底物的反应过程，大分子底物由于无法进入凝胶，故不适用。包埋法分为三类

（1）网格型（2）微囊型第46页,共53页，2024年2月25日，星期天（1）凝胶包埋法网格法也称凝胶包埋法，是指将酶包埋在高分子凝胶的细策网格之中。凝胶包埋法是目前因定化技术中用得最多的方法。所用的凝胶有：

聚丙烯酰胺

聚乙烯醇

光敏树脂

淀粉

明胶

胶原

海藻胶（卡拉胶）

角叉菜胶第47页,共53页，2024年2月25日，星期天（2）微囊化包埋法将酶包埋在高分子半透膜中的方法，称为微囊化包埋法。微囊化固定化酶的优点----微囊化固定化酶的直径为几微米到几百微米之间的球状体，其颗粒较小，有利于大分子底物进行反应。微囊化固定化酶的缺点----反应条件要求高，制备成本也较高。第48页,共53页，2024年2月25日，星期天（3）纤维包埋法此法适用于大规模生产。纤维包埋法所形成的聚合物，每克能够包埋1500mg的转化酶，并且具有良好的稳定性。制备时，先把含酶水溶液在高聚物（醋酸纤维素、聚氯乙烯）的有机溶剂（二氯甲烷）中进行乳化，

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然后将乳化液通过一多孔喷丝头挤压进凝结浴池中，形成纤维

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酶溶液便被包裹在纤维内

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将纤维编织成各种酶布，以适合反应器的要求。第49页,共53页，2024年2月25日，星期天

选择性热变性法----此法专用于细胞固定化，是将细胞在适当温度下处理，使其细胞膜蛋白质变性，但不使其酶变性，从而使酶固定于细胞内的方法。

第50页,共53页，2024年2月25日，星期天（1）吸附法制备固定化酶技术

——物理吸附

——离子交换等电点、低离子强度、载体颗粒、蛋白质量、温度（2