荧光原位杂交

原位杂交（ISH）原位杂交(insituhybridization,ISH)

将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交。原位杂交技术(ISH)是分子生物学、组织化学及细胞学相结合而产生的一门新兴技术，始于20世纪60年代。使用DNA或者RNA探针来检测与其互补的另一条链在细菌或其他真核细胞中的位置。第2页,共40页，2024年2月25日，星期天基本原理根据碱基互补配对原则，同源的DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA两条单链在一定条件下能结合成双链。用放射性或非放射性物质标记的DNA、RNA或与mRNA互补的cDNA作探针，与组织切片或细胞内待测核酸(RNA或DNA）片段进行杂交，然后可用放射自显影等方法予以显示，在光镜或电镜下观察目的mRNA或DAN的存在与定位。第3页,共40页，2024年2月25日，星期天3H、35S、125I、32P等原位杂交常用标记物质70年代80年代中后期放射性同位素12荧光素、生物素、地高辛等非放射性物质2第4页,共40页，2024年2月25日，星期天同位素原位杂交的不足之处：1、不稳定2、高背景3、曝光时间长4、结果统计处理繁琐5、同位素的使用和处理

第5页,共40页，2024年2月25日，星期天几种原位杂交技术1基因组原位杂交技术2荧光原位杂交技术3多彩色荧光原位杂交技术4原位PCR第6页,共40页，2024年2月25日，星期天荧光原位杂交荧光原位杂交（Fluorescenceinsituhybridization，FISH）是在20世纪80年代末在放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性分子细胞遗传技术,以荧光标记取代同位素标记而形成的一种新的原位杂交方法，探针首先与某种介导分子(reportermolecule)结合,杂交后再通过免疫细胞化学过程连接上荧光染料。第7页,共40页，2024年2月25日，星期天FISH的基本原理FISH基本原理是利用同源互补的待检染色体与用生物素、地高辛标记过的核酸探针,经变性-退火-复性,形成待检DNA与核酸探针的杂交体。使探针与荧光素标记的特异亲和素之间发生免疫化学反应,最后用荧光显微镜对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。第8页,共40页，2024年2月25日，星期天第9页,共40页，2024年2月25日，星期天发展历史1974年Evans首次将染色体显带技术和染色体原位杂交联合应用，提高了定位的准确性。20世纪70年代后期人们开始探讨荧光标记的原位杂交，即FISH技术。1981年Harper成功地将单拷贝的DNA序列定位到G显带标本上，标志着染色体定位技术取得了重要进展。第10页,共40页，2024年2月25日，星期天1969年Gall和Pardue以及Pardue等人利用放射性同位素标记的核酸探针对DNA进行了杂交,开创了RNA-DNA的同位素原位杂交技术。他们都是采用放射性同位素标记探针,需要采用放射自显影进行检测,这种检测上的限制及当时分子克隆方法的缺乏使得DNA原位杂交技术不能很快得到广泛应用。第11页,共40页，2024年2月25日，星期天1974年，Evans第一次将染色体显带技术和原位杂交技术结合起来,提高了基因定位的准确性。1975年,Manning等最先在溶液的分子杂交中,使用非放射性标记,通过细胞色素C将生物素与RNA分子连接起来。1977年Rudkin发明了用间接免疫荧光法检测目的DNA的非同位素原位杂交(NISH)。第12页,共40页，2024年2月25日，星期天1981年，Langer等首次采用生物素标记的核苷酸探针成功地进行了染色体原位杂交,建立了非放射性原位杂交技术。至此,以荧光标记的探针在细胞制片上进行基因原位杂交的技术建立起来。1985年，原位杂交技术被引进到植物。1986年，Cremer与Licher等分别证实了荧光原位杂交技术应用于间期核检测染色体非整倍体的可行性,从而开辟了间期细胞遗传学研究。第13页,共40页，2024年2月25日，星期天20世纪90年代，随着人类基因组计划的进行，由于绘制高分辨人类基因组图谱的需要，FISH技术得到了迅速的发展和广泛应用。第14页,共40页，2024年2月25日，星期天FISH样本的制备探针的制备探针标记杂交（染色体显带）荧光显微镜检测结果分析实验流程第15页,共40页，2024年2月25日，星期天DNARNAPNA将探针置于载玻片上制片FISH基本实验过程杂交加盖玻片变性检测在荧光显微镜下观察第16页,共40页，2024年2月25日，星期天探针的制备探针（probe)是指用于检测特定基因或转录产物存在或表达的DNA、RNA或寡核苷酸序列。杂交实验所选择的核酸探针可以分为三种：化学合成、克隆和PCR。第17页,共40页，2024年2月25日，星期天探针的分类根据化学组成，可以将探针分为DNA、RNA、PNA及寡核苷酸探针。DNA探针这类探针应用最广，可以通过化学合成、克隆或PCR技术获得。RNA探针一般用RNA聚合酶体外转录克隆的DNA序列获得。RNA-RNA杂交分子在所有可能的杂交分子中最稳定，但RNA探针容易被RNase降解。第18页,共40页，2024年2月25日，星期天肽核苷酸（PNA）探针

PNA寡聚物是一类新分子，其结构与DNA相似。但在PNA中，没有核糖-磷酸基骨架，其骨架是不带电的肽链(聚酰胺）。第19页,共40页，2024年2月25日，星期天PNA与DNA杂交时也

遵循碱基互补配对原则第20页,共40页，2024年2月25日，星期天与DNA相比，PNA对热稳定、与DNA的结合不依赖于离子强度，因此杂交时，受探针变性温度和溶液PH的影响较小，鉴于这些特点和优点，PNA有望取代DNA或RNA作为FISH的探针。但由于PNA探针只能通过化学方法进行合成，而且合成费用高，因此迄今所用的PNA探针还仅限于染色体的泛着丝粒和泛端粒探针。第21页,共40页，2024年2月25日，星期天寡核苷酸探针它是根据探针靶序列的碱基顺序用化学方法合成的单链DNA，其长度为15-20核苷酸。由于分子小，因此更容易渗透到细胞的目标区域；但也正由于分子小，限制了其所能携带的荧光基团或报告分子数目，并最终导致杂交后荧光信号较弱。因此这类探针仅实用于对重复单位较短的高度重复序列的荧光原位杂交分析。第22页,共40页，2024年2月25日，星期天探针标记为了确定探针是否与相应的基因组DNA杂交，有必要对探针加以标记，以便在结合部位获得可识别的信号。荧光原位杂交得探针常用荧光素或地高辛进行标记。探针标记可以采用均匀标记和末端标记的方法。第23页,共40页，2024年2月25日，星期天对探针进行标记时，可复制合成一段新探针分子，在复制合成过程渗入标记核苷酸，从而使整个新分子被均匀地标记。其显著的特点是标记不局限一个位点，而是均匀地渗入，探针的信号强。均匀标记有切口平移法、随机引物法和PCR扩增等方法。均匀标记第24页,共40页，2024年2月25日，星期天切口平移标记法标记部分第25页,共40页，2024年2月25日，星期天切口平移法可对环状或线性双链DNA进行标记。一般对克隆的DNA片段用这种方法标记的效果较好。该方法使用时应注意：A.只能标记双链DNA使用探针时要预先变性后再使用，而且标记时DNA片段不太小B.DNA酶I使用的量要合适太多会将DNA模板切碎，不能进行标记反应；太少则不能有效地打开缺口，使标记物不能进入缺口C.标记时间不能太短太短时间会造成标记量不足，影响杂交的进行

第26页,共40页，2024年2月25日，星期天随机引物标记法第27页,共40页，2024年2月25日，星期天1、不但可用于双连DNA的标记，而且可用于单连DNA和RNA的标记2、操作简单3、标记率高随机引物法的特点第28页,共40页，2024年2月25日，星期天PCR标记法第29页,共40页，2024年2月25日，星期天末端标记直接将探针分子的某个原子替换为放射性同位素原子，或直接在探针分子上加上标记的原子或复合物，这种直接标记一般是在探针分子的末端进行，所以称之为末端标记。经过末端标记的核酸分子除作为杂交探针外，更多的用于RNAS1作图以及引物延伸反应中的标记引物。第30页,共40页，2024年2月25日，星期天末端标记法第31页,共40页，2024年2月25日，星期天染色体显带显带染色是将染色体经过一定程序的处理,并用特定的染料染色后,使染色体在其长轴上显示出一个个明暗交替或深浅不同的横纹,这样的横纹就叫做染色体的带。食管癌细胞系24色染色体mFISH核型分析第32页,共40页，2024年2月25日，星期天每条染色体都含有一定数量、一定排列顺序、一定宽窄和染色深浅或明暗不同的带,这就构成了每条染色体的带型。显示染色体带的过程称为染色体显带。染色体显带为染色体的研究提供了一个十分有效的方法。染色体的显带技术分为两大类:一类为整条染色体的显带技术；另一类为染色体局部的显带技术。第33页,共40页，2024年2月25日，星期天第34页,共40页，2024年2月25日，星期天奥芬兰海水硝化细菌荧光原位杂交全菌（采用EUBMIX型探针）氨氧化细菌（采用NSO1225型探针）全菌（采用EUBMIX型探针）亚硝酸盐氧化细菌（采用NIT3型探针）第35页,共40页，2024年2月25日，星期天荧光原位杂交特点

优点1、荧光试剂和探针经济、安全；2、探针稳定，一次标记后可在两年内使用；3、实验周期短、能迅速得到结果、特异性好、定位准确；4、FISH可定位长度在1kb的DNA序列，其灵敏度与放射性探针相当；第36页,共40页，2024年2月25日，星期天5、多色FISH通过在同一个核中显示不同的颜色可同时检测多种序列；6、既可以在玻片上显示中期染色体数量或结构的变化，也可以在悬液中显示间期染色体DNA的结构。第37页,共40页，2024年2月25日，星期天

缺点1、不能达到100%杂交，特别是在应用较短的cDNA探针时效率明显下降。2、必须在已知探针的情况下方可进行。第38页,共40