酶活性测定的主要影响因素及控制

酶活性测定的主要影响因素及控制酶（enzyme）酶的应用临床诊断酶学产生至今已有100年的历史。用于诊断的酶类已超过100多种，常用的数十种。酶测定约占目前临床化学总工作量的1/4到1/2。酶的概念是一种由活细胞产生，具有高度专一性、高度催化活性的特殊蛋白质，又称为生物催化剂。酶的测定方法分为绝对定量法和相对定量法两大类，以后者为主。酶催化化学反应的能力称为酶活性（activity）。酶活性浓度的测定受许多因素的影响。第2页,共55页，2024年2月25日，星期天酶活性浓度测定的主要影响因素1.标本及标本采集和处理因素2.试剂及方法学因素3.仪器因素的影响4.测定条件与参数设置第3页,共55页，2024年2月25日，星期天1.标本及标本采集和处理因素

的影响及控制第4页,共55页，2024年2月25日，星期天1.标本及采集和处理的影响因素1.1溶血1.2抗凝剂1.3温度1.4空气与光线1.5标本副反应1.6酶蛋白浓度1.7其他第5页,共55页，2024年2月25日，星期天1.1溶血最重要的影响是RBC内酶的大量释出。大部分酶在细胞内外浓度差异明显，且其活性远高于血清；如RBC内的LD、AST和ALT活性分别较血清中高100、15和7倍左右。RBC释放的Hb在300～500nm可见光波段能使吸光度值明显升高，干扰分光光度计的测定。第6页,共55页，2024年2月25日，星期天1.1Hb的吸光度曲线第7页,共55页，2024年2月25日，星期天1.1溶血影响的控制减少溶血体外溶血可通过实施样品制备技术的标准化加以克服；分清体内溶血与体外溶血。减少溶血的干扰可通过设置样品对照，或使用双波长比色、连续监测法以及改进商品试剂等措施，克服对分光光度分析的影响。应用血清(溶血)指数直接判断溶血程度。第8页,共55页，2024年2月25日，星期天1.1注意:RBC中酶的干扰不仅表现在溶血影响上，采血后如不及时将血清和血凝块分离，血细胞中酶同样可以透过细胞膜进入血清，所以，静脉采血后，必须在1～2h内及时离心，将血清与血细胞、血凝块分离，以免引起误差。第9页,共55页，2024年2月25日，星期天1.2抗凝剂临床上除非测定与凝血或纤溶有关的酶，一般都应以血清作为首选测定标本。大多数抗凝剂都在一定程度上影响酶活性，EDTA、草酸盐和柠檬酸盐等抗凝剂，它们为金属离子螯合剂；在去除Ca2+同时也去除其中Mg2+、Mn2+等离子，Ca2+是AMY的激活剂，Mg2+是ALP、CK和5′-核苷酸酶（5′-NA）的激活剂。第10页,共55页，2024年2月25日，星期天1.2肝素是一种粘多糖，是对酶活性影响最小的抗凝剂，对ALT、AST、CK、LD和ACP无影响，适于急诊时迅速分离血浆进行测定。第11页,共55页，2024年2月25日，星期天1.3温度由于血清清蛋白对酶蛋白有稳定作用，如无细菌污染，某些酶（如AST、

-GT和ALP等）可在室温保存1～3天活性不受影响。有些酶极不稳定，如血清前列腺ACP，在37℃放置1h，活性可下降50%。第12页,共55页，2024年2月25日，星期天1.3贮存不同室温体液酶的稳定性

（活性变化小于10%）

酶室温（25℃）冷藏（0～4℃）冰冻（-25℃）LD1周1～3d§1～3d§

-GT2d1周1月ALD2d2d不稳定*ALT2d5d不稳定*AST3d1周1月CK1周1周1月ChE1周1周1周ALP2～3d2～3d1月ACP4h※3d#3d#5’-NT24h1周3月AMY1月7月2月LPS1周3周3周*酶不耐融化；§与同工酶类型有关；※标本未酸化；#标本加枸橼酸或醋酸至pH5第13页,共55页，2024年2月25日，星期天1.3温度影响的控制及时检测低温贮存大部分酶在低温中比较稳定，因此当天不能测定时，应在血清分离后置冰箱中冷藏。第14页,共55页，2024年2月25日，星期天1.4空气与光线血清置于空气中时，血中CO2丧失极快，pH可在15min内由7.4增至8.0，从而使对碱性环境敏感的ACP活性迅速下降。某些酶易受光线破坏，CK可因吸收蓝光而引起酶发生不可逆地失活，其失活程度与暴光时间的长短成正比。第15页,共55页，2024年2月25日，星期天1.5副反应副反应是指酶促反应体系中，除待测酶反应外，其他非待测酶和物质引起的干扰待测酶测定的反应。NAD（P）H是目前使用最多的指示反应物质。体内存在数以百计的氧化还原酶，它们的辅酶很多是一致的。若存在内源性代谢物，必然会相互干扰。第16页,共55页，2024年2月25日，星期天1.5副反应(酶偶联法测ALT)由于反应体系中含有大量NADH和LD，可与血液标本中所含丙酮酸反应，引起340nm波长处吸光度下降，从而引起ALT活性测定误差。ALT活性测定的反应式如下：第17页,共55页，2024年2月25日，星期天1.5副反应的控制可通过加入副反应抑制剂，或对样品进行预处理等方法给予排除。双试剂底物启动模式因不增加成本、不耗费时间是最经济的方法。第18页,共55页，2024年2月25日，星期天1.6酶蛋白浓度酶蛋白在低浓度时易失活，可能是亚基易解离、易吸附于容器上和易发生表面变性之故。酶蛋白在高浓度时较稳定，但活性过高超过检测仪器的线性范围时，需将样品进行稀释或减少样品用量后再行测定。样品稀释后所测得的活性常偏高，可能与抑制剂被稀释有关。第19页,共55页，2024年2月25日，星期天1.7其他样本器皿的质地和洁净度，采血部位，以及血清中过量的胆红素、脂质，样品制备过程中的振摇等，均可引起酶活性改变。季节冬季气温低，血液凝固慢，血清分离时间延长，可引起血细胞内酶释至血清，加上血清与空气长时间接触，可使某些抑制剂遭到破坏，故冬季测定LD的活性较夏季高。第20页,共55页，2024年2月25日，星期天2.试剂及方法学因素

的影响及控制第21页,共55页，2024年2月25日，星期天2.试剂及方法学的影响因素酶的测定大多使用商品试剂盒不同厂家酶试剂盒的测定原理、试剂配方（包括缓冲液、底物、添加剂等）、产品质量、技术含量等常有区别。常见的影响因素2.1

定时法与连续监测法2.2检测底物或检测产物2.3底物启动模式与样品启动模式2.4正向反应与逆向反应2.5试剂的干扰作用第22页,共55页，2024年2月25日，星期天2.影响因素的控制选购试剂盒时要仔细阅读试剂盒说明书；了解试剂盒所用方法的原理、试剂配方等；选择IFCC或中华医学会检验学会推荐的常规方法，或选择公认的测定方法。使用时定期对试剂盒的质量进行监测；准确性、重复性、稳定性好，线性范围宽；正向型试剂空白吸光度低、反向型试剂空白吸光度高、试剂空白速率低、瓶间差小等。第23页,共55页，2024年2月25日，星期天2.酶活性测定的原理酶活性与速度的关系*酶促反应进程曲线第24页,共55页，2024年2月25日，星期天2.1定时法与连续监测法的选用在条件许可的情况下，应尽可能全部采用连续监测法，少用或不用定时法。连续监测法可以选择线性期的反应速度来计算酶活性，测定结果可靠，是首选的方法。但该方法仪器要求相对较高。在基层单位，某些酶采用定时法测定也可以得到比较准确的结果。ALP酶活性的测定，如加做样品空白，两法的结果准确性相当。第25页,共55页，2024年2月25日，星期天2.1连续监测法与定时法

的酶促反应时间进程曲线第26页,共55页，2024年2月25日，星期天2.2检测底物或检测产物的选择取决于哪个更方便，测定的结果更准确。通常原则是选择测定产物的生成量而不是底物的消耗量。反应时底物浓度高，反应时间短；这也是淀粉酶的碘淀粉比色法逐渐被色素源底物所取代的原因之一。除部分测定NADH减少可以看成测底物的消耗量外，已很少采用测定底物消耗量的项目。第27页,共55页，2024年2月25日，星期天2.2检测底物或检测产物的选择底物与产物举例ALT测定（赖氏法-定时法）L-丙氨酸+α-酮戊二酸α-丙酮酸

+L-谷氨酸α-丙酮酸+2，4-二硝基苯肼2，4-二硝基苯腙

(红棕色，λ=505nm)ALT测定（连续监测法）L-丙氨酸+α-酮戊二酸α-丙酮酸

+L-谷氨酸第28页,共55页，2024年2月25日，星期天2.3底物启动模式与样品启动模式底物启动模式（IFCC推荐采用）。指样品先与缺乏某种底物的试剂1预孵育一定时间后，再加入内这种底物的试剂2，开始启动样品中的待测酶的酶促反应。好处是在待测酶酶促反应开始之前，可以除去某些干扰物，包括内源性干扰物和外源性干扰物。这种模式需要双试剂剂型。样品启动模式。指反应所需的试剂先混合在一起，然后加入样品，依靠样品中的待测酶来启动酶促反应；只是在延滞期去除部分干扰物。这种模式可采用单一试剂剂型。第29页,共55页，2024年2月25日，星期天2.3底物启动模式与样品启动模式双试剂与单试剂酶促反应时间进程曲线第30页,共55页，2024年2月25日，星期天2.3需要注意某些双试剂剂型是基于试剂稳定性考虑，并没有将底物单独作为第二试剂，也起不到消除内源性干扰的作用。第31页,共55页，2024年2月25日，星期天2.4正向反应与逆向反应一般根据测定底物或产物的难易程度来决定。除原则上选择对底物亲和力大，酶转换率高的方向外，还应考虑内源性干扰、底物价格和稳定性等诸多因素。例如，CK的测定普遍采用逆向反应，因其逆向反应是正向反应的6倍，而且受影响因素少。第32页,共55页，2024年2月25日，星期天2.4正向反应与逆向反应LDH测定的选择目前尚有争议。国内多采用正向反应（L→P），与IFCC在2001年发表的操作手册一致。正向反应有利于LD1的活性表达，同时试剂成本低廉，稳定性好。国外常用方法曾是逆向反应（P→L），反应速度是正向的3倍，成本也较低。第33页,共55页，2024年2月25日，星期天2.5检测试剂的干扰作用试剂酶的污染。组织匀浆中往往含有NADH-细胞色素C还原酶，它将干扰各种还原酶的测定。底物的非酶反应。很多硝基酚的酯类衍生物在水溶液中不稳定，放置一段时间可自行水解释放出硝基酚。如碱性磷酸酶（ALP）测定解决的方法是通过试剂空白管检出并加以校正。选购IFCC或中华检验学会推荐的方法和质量好的试剂。第34页,共55页，2024年2月25日，星期天3.仪器因素的影响及控制第35页,共55页，2024年2月25日，星期天3仪器的影响因素加样系统加样的准确性、重复性和携带污染；反应系统反应杯的形状、表面和携带污染；反应杯和反应槽温度的准确性、波动范围；搅拌和清洗机构的效果和携带污染；检测系统光度计的准确性、重复性、线性范围和杂散光等均会造成结果的偏差。第36页,共55页，2024年2月25日，星期天3仪器影响因素的控制在日常工作中，除常规做好仪器和设备的正确使用和维护外，重点应注意仪器的校准问题。第37页,共55页，2024年2月25日，星期天3.1酶活性浓度的计算公式摩尔吸光系数

和系数K均为常数，

和

K受仪器诸多因素的影响，如波长的准确性、半波宽的大小、比色池光径及磨损与清洁度、温控的准确性、加样系统状况等。

和

K可用校准物定期校正。第38页,共55页，2024年2月25日，星期天3.2校准物可用作酶活性测定用的校准物分两类。一类是产物的基准物质，如对硝基酚、对硝基苯胺等，用于校准仪器的值（摩尔吸光系数）。另一类称酶校准物（Enzymecalibrator），多是用人血清或动物血清作介质，与测定标本比较接近，用于校准仪器的K值（酶活性浓度定量系数）。第39页,共55页，2024年2月25日，星期天3.2校准物国际上已经有经IFCC认可的CRM酶参考物。各试剂供应商所提供的酶校正物的定值应可溯源至CRM酶参考物。常规工作一般选用用于常规实验室的工作校准品。目前，临床常规实验室应用较多的是德国宝灵曼公司的校准品(c.f.a.s)。第40页,共55页，2024年2月25日，星期天3.3ε的校准（340nm波长）NAD(P)H是酶活性测定中常用的指示辅酶。在340nm

的NAD(P)H的

，可用葡萄糖己糖激酶法实测、计算其实测的

。NAD(P)H的ε为6220。如果6000>ε>6600为不合格，则需找维修部检查。注：干涉滤光片者需校准，光栅式可直接使用文献或试剂盒说明书的数值。第41页,共55页，2024年2月25日，星期天3.3ε的校准（405nm波长）最常用的色素原为对硝基苯酚等。对硝基苯酚在405nm的，可用ALP测定试剂的缓冲液作为测定试剂，对硝基苯酚标准液作为血清标本，实际测定计算ε值。对硝基苯酚的ε为18700。如果ε值偏差过大，则需找维修部检查。第42页,共55页，2024年2月25日，星期天3.4K的校准（公式计算法）将上述实测ε值代入K值计算公式得到校准K值外。第43页,共55页，2024年2月25日，星期天3.4K的校准（酶校准物）使用公认的酶校准物对K值进行校准，它是国际上目前酶测定标准化新途径。使用酶校准物的优点，除具有实测ε值换算出的校准K值所具有的一切优点外，还可促进方法间的一致性和增加常规酶方法的可靠性，可使不同实验室之间的测定结果相对统一。第44页,共55页，2024年2月25日，星期天3.4K的校准（频率）最好（低）每半年进行一次酶活性的校准。仪器在使用过程中，滤光片、加样系统的精度都可能发生变化，光学系统的灯泡、光电转换元件的老化、灵敏度变化等，都会导致测定结果的偏差。但日常工作中，遇到下列情况时，必须进行校准：试剂盒改变厂家，或者更换了批号；仪器性能改变，如进行一次大的预防性维护或者更换了重要部件；质控反映出异常的趋势或偏移，或者超出实验室规定的接受限，采取一般性纠正措施后，不能识别和纠正问题时。第45页,共55页，2024年2月25日，星期天4.测定条件与参数设置第46页,共55页，2024年2月25日，星期天4.1最适条件包括①合适的底物和最适底物浓度；②理想的缓冲液种类和最适离子强度；③反应液的最适pH；④最适反应温度；⑤合适的辅因子、激活剂浓度；⑥若是酶偶联反应，还需要确定指示酶和辅助酶的用量；⑦合理的测定时间，包括延滞期尽量短暂，有足够的线性期；⑧合适的样品与反应试剂的比例；⑨足够的检测范围；⑩尽量去除各种抑制剂等。第47页,共55页，2024年2月25日，星期天4.2反应温度目前常规实验室越来越多的使用37℃，这更多地是从实际工作方便来考虑。1986年以前，IFCC推荐酶活性测定的温度是30℃，纯镓的熔点为29.77℃，镓作为此温度的基准物质，保证了测定仪器在30℃的高度准确性。2001年，IFCC正式发表了“37℃下检测酶催化活性浓度的IFCC一级参考方法操作手册和参考制品认可系统”，包括CK、LD、ALT、AST、GGT五个酶在内。第48页,共55页，2024年2月25日，星期天4.2反应温度酶活性与酶促反应温度的关系第49页,共55页，2024年2月25日，星期天4.3延滞期、线性期的确定延滞期的确定延滞期可以因酶在样品中所存在的介质不同而略有差别，原因可能是存在内源性干扰物，也可能存在一些抑制剂。确定原则是多观察浓度不等、病理情况不同的标本，选择延滞期最长者作为确定值。线性期的确定离不开酶浓度的可测上限，因为酶浓度越高，在同样时间内消耗底物越多，产生产物越多，底物的不足