肿瘤自杀基因治疗及中药方药的增效作用和机制

肿瘤自杀基因治疗及中药方药的增效作用和机制课题资助情况国家自然科学基金（编号：30171201;30572433;30672747

）广东省科技攻关计划（编号：2005B3030102）广州市科委（编号：2002J1-C7401）广东省中医药管理局（编号：A401028；1050079）广州中医药大学(K0050031)

第2页,共76页，2024年2月25日，星期天内容

研究背景及研究思路HSV-tk/GCV肿瘤自杀基因治疗系统的构建中药方药对肿瘤自杀基因治疗的增效作用中药方药增效作用的机制肿瘤自杀基因治疗系统的改进工作第3页,共76页，2024年2月25日，星期天研究背景及研究思路第4页,共76页，2024年2月25日，星期天基因治疗的概念基因治疗就是将外源性基因导入到正常或病变细胞中，利用其转录或翻译产物发挥治疗作用的一种方法第5页,共76页，2024年2月25日，星期天基因治疗的策略第6页,共76页，2024年2月25日，星期天基因治疗的临床试验第7页,共76页，2024年2月25日，星期天肿瘤的基因治疗恶性肿瘤由于患者来源广，用于治疗的基因多，容易复制动物模型等原因而成为首选对象

第8页,共76页，2024年2月25日，星期天目前常用的肿瘤基因治疗方案

肿瘤的免疫基因治疗肿瘤抑制基因治疗

自杀基因治疗（最有应用前景）

肿瘤多药耐药性基因治疗

抑制血管生成的基因治疗第9页,共76页，2024年2月25日，星期天自杀基因的概念

所谓自杀基因是指在一定条件下，可以引起细胞自动死亡的基因

目前研究的多数自杀基因是通过编码病毒或细菌的酶介导敏感性，这些酶能把药物的无活性形式转化为毒性代谢产物，引起细胞死亡第10页,共76页，2024年2月25日，星期天基因名称底物产物旁杀伤效应备注单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-tk）GCV，ACV，PCV，BCV，BVDU，BVDC，IVDU等核苷类似物磷酸化的核苷类似物有研究最多已上临床水痘带状疱疹病毒胸苷激酶（VZV-tk）araMaraATP－

大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶（EC-CD）5-FC5-FU有已上临床大肠杆菌硝基还原酶（NTR）CB1954，MTZ，NFT羟胺衍生物有研究正在兴起大肠杆菌黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（EC-XGPRT或gpt基因）6TG6TX6-硫代鸟嘌呤酸有

细胞色素P450CYP2B1CPA，IFA碱性化的底物有

细胞羧肽酶G2（CPG2）CMDA芥类药物有

大肠杆菌DeoD基因（PNP）Mep-dr6-甲嘌呤有

白细胞介素1β转化酶（ICE）RARP，LaminsRb，U1-70kD等被降解失活的底物－

p53－－有

目前应用于实验室和临床主要的自杀基因治疗系统

第11页,共76页，2024年2月25日，星期天自杀基因治疗的优势①特异性杀伤基因表达细胞②杀伤多药耐药性（MDR）肿瘤细胞③基因的表达只需将一定量的前药转换成足以杀伤肿瘤细胞的剂量即可，而无需基因的长期表达④绝大部分自杀基因存在极明显的“旁杀伤效应”，体外只需有10％以上的肿瘤细胞表达自杀基因，就可以杀伤绝大部分甚至全部肿瘤细胞⑤良好的瘤苗第12页,共76页，2024年2月25日，星期天旁杀伤效应

第13页,共76页，2024年2月25日，星期天旁杀伤效应作用机制

“缝隙连接”机制免疫介导机制“细胞凋亡”机制介质机制抗肿瘤血管生成

第14页,共76页，2024年2月25日，星期天缝隙连接机制第15页,共76页，2024年2月25日，星期天免疫介导机制tk+死亡大量抗原释放免疫细胞浸润细胞因子释放免疫炎症系统介导的非特异性杀伤诱发特异性抗肿瘤免疫反应12免疫抑制免疫激活免疫增强旁杀伤效应增强死亡第16页,共76页，2024年2月25日，星期天“细胞凋亡”机制自杀基因引起细胞死亡的形式为细胞凋亡tk+细胞凋亡形成凋亡小体为tk-细胞吞噬引起tk-细胞死亡细胞死亡tk-细胞第17页,共76页，2024年2月25日，星期天介质扩散

CD5-Fc5-Fu5-Fu5-Fu5-FuCD-细胞死亡第18页,共76页，2024年2月25日，星期天抗肿瘤血管生成注：自杀基因第19页,共76页，2024年2月25日，星期天单纯自杀基因治疗存在主要问题目的基因转染率低而杀伤力不足；缺乏靶向性，自杀基因的表达缺乏组织特异性和时序性等，单纯自杀基因治疗难以完全消除肿瘤细胞第20页,共76页，2024年2月25日，星期天肿瘤自杀基因疗法的增效方法

双自杀基因治疗联合治疗联合免疫基因治疗联合放射治疗联合化学治疗联合其他基因

靶向基因治疗增强旁杀伤效应第21页,共76页，2024年2月25日，星期天单纯自杀基因治疗易复发联合治疗增效联合免疫基因联合放化疗多基因间互相干扰，难以保证导入基因表达或长期表达；使用病毒载体量增多，潜在毒副作用增大；操作过程复杂，成本较高联合中药方药载体转染效率低靶向性不够自杀基因疗法联合中药方药可能是一种更为有效和可行的方案研究思路增强免疫功能增强“缝隙连接”功能增强杀伤敏感性提高旁杀伤效应

肯定的免疫药理作用多靶点作用给药方便，价格低廉，毒副作用小或无明显毒副作用第22页,共76页，2024年2月25日，星期天HSV-tk/GCV肿瘤自杀基因治疗系统的构建

第23页,共76页，2024年2月25日，星期天技术路线获得目的基因酶切酶切鉴定质粒重组病毒包装和阳性克隆筛选病毒感染胃癌细胞重组质粒鉴定病毒滴度测定GCV杀伤试验斑点杂交鉴定第24页,共76页，2024年2月25日，星期天目的基因（tk基因）的获得

由美国匹兹堡大学药理教研室HuangL.教授惠赠，广州军区总医院赵亚刚博士提供（pICl9R/MCl-tk质粒）第25页,共76页，2024年2月25日，星期天pICl9R/MCl-tk质粒酶切鉴定结果12345a：pICl9R/MCl-tk质粒结构图

b：pICl9R/MCl-tk质粒的酶切鉴定电泳图谱

注（b）：1：Marker(λDNAHindⅢ)；2：pICl9R/MCl-tk质粒

3：pICl9R/MCl-tk质粒/BamHⅠ；4：pICl9R/MCl-tk质粒/BamHⅠ+EcoRⅠ5：Marker(λDNA/EcoRⅠ+HindⅢ)

第26页,共76页，2024年2月25日，星期天重组质粒的限制性内切酶鉴定结果

a：pLXSN-tk质粒结构图b：pLXSN-tk质粒的酶切鉴定电泳图谱1234561．DNAmarkerⅨ(分子量分别为2.5kb,2.0kb,1.5kb,1.0kb,500bp,300bp)2．pLXSN-tk经EcoRI单酶切3．4．pLXSN-tk经EcoRI/BamHI双酶切5．pLXSN-tk质粒6．

DNA/EcoRI/HindⅢmarker第27页,共76页，2024年2月25日，星期天重组质粒的测序图鉴定结果

第28页,共76页，2024年2月25日，星期天PT67包装细胞筛选结果

a：G418筛选5d后的PT67b：筛选2w后形成的阳性克隆细胞图3pLXSN-tk质粒转染包装细胞PT67结果第29页,共76页，2024年2月25日，星期天病毒滴度测定及结果

本实验测定滴度最高为1×104cfu/mL第30页,共76页，2024年2月25日，星期天胃癌细胞tk基因的斑点杂交鉴定

123胃癌细胞SGC-7901、SGC-7901/tk的DNA与tk探针的斑点杂交图注：1.pLXSN/tk质粒DNA（阳性对照）；

2.SGC-7901细胞DNA；

3.SGC-7901/tk细胞DNA

第31页,共76页，2024年2月25日，星期天GCV对人胃癌细胞SGC-7901的体外杀伤试验

第32页,共76页，2024年2月25日，星期天结论及意义已成功已成功构建了逆转录病毒载体介导的HSV-tk/GCV肿瘤自杀基因治疗系统HSV-tk/GCV自杀基因治疗系统成功的构建，为后续的研究工作奠定了坚实的基础

第33页,共76页，2024年2月25日，星期天中药方药对肿瘤自杀基因治疗的增效作用第34页,共76页，2024年2月25日，星期天动物水平实验第35页,共76页，2024年2月25日，星期天技术路线H22/tk＋和H22/tk－按1∶4混合接种小鼠皮下组织（2×106细胞）病毒感染肝癌细胞疗效观察动物分组GCV体外杀伤试验成瘤后治疗小鼠移植性肝细胞癌治疗实验(六味地黄)

第36页,共76页，2024年2月25日，星期天分组及治疗

模型对照组正常对照组联合治疗组

六味地黄丸治疗组

自杀基因治疗组

（造模）第2天第6天第16天蒸馏水灌胃每天0.5mL

腹腔注射生理盐水每天0.25mL

蒸馏水灌胃每天0.5mL

腹腔注射生理盐水每天0.25mL

腹腔注射生理盐水每天0.25mL

腹腔注射GCV100mg﹒kg-1﹒d-1

腹腔注射GCV100mg﹒kg-1﹒d-1六味地黄丸悬液灌胃10g﹒kg-1﹒d-1

蒸馏水灌胃每天0.5mL

六味地黄丸悬液灌胃10g﹒kg-1﹒d-1（造模）（造模）（造模）（生理盐水）第37页,共76页，2024年2月25日，星期天肿瘤生长体积曲线时间（d）第38页,共76页，2024年2月25日，星期天肿瘤质量及抑瘤率组别n肿瘤质量（g）抑瘤率（%）模型对照组191.5825±1.2380六味地黄治疗组190.8498±0.716346.3自杀基因治疗组200.9904±0.979637.4联合治疗组180.5859±0.3786*63.0注：*与模型对照组比较P<0.05抑瘤率=（模型组肿瘤质量－治疗组肿瘤质量）/模型组肿瘤质量×100%第39页,共76页，2024年2月25日，星期天肿瘤质量图示第40页,共76页，2024年2月25日，星期天病理检查结果(肉眼观察)

注：第二组：肿瘤模型组；第三组：六味地黄丸治疗组；第四组：自杀基因治疗组；第五组：联合治疗组第41页,共76页，2024年2月25日，星期天病理检查结果(光镜观察

)

模型对照组

肿瘤细胞数量较多，密集。六味地黄丸治疗组肿瘤细胞数量较多，密集。自杀基因治疗组肿瘤细胞数量密度相对较少。联合治疗组肿瘤细胞数量密度相对较低。各组细胞密度第42页,共76页，2024年2月25日，星期天模型对照组：肿瘤组织内肿瘤细胞坏死，呈核固缩表现，并见大片红染无结构的坏死组织六味地黄丸治疗组：肿瘤组织内肿瘤细胞坏死，呈核固缩表现，并见大片红染无结构的坏死组织自杀基因治疗组：肿瘤组织内肿瘤细胞坏死，呈核固缩表现，并见大片红染无结构的坏死组织联合治疗组：肿瘤组织内肿瘤细胞坏死，呈核固缩表现，并见大片红染无结构的坏死组织。各组肿瘤坏死情况第43页,共76页，2024年2月25日，星期天模型对照组：肿瘤周边纤维组织增生不明显，未见明显包膜六味地黄丸治疗组：肿瘤周边纤维组织增生较明显，形成较明显的假包膜自杀基因治疗组：肿瘤周边纤维组织增生较明显，形成较明显的假包膜联合治疗组：肿瘤周边纤维组织增生较明显，形成较厚的假包膜各组肿瘤纤维结缔组织增生情况第44页,共76页，2024年2月25日，星期天模型对照组：肿瘤边缘见少量炎细胞浸润六味地黄丸治疗组：肿瘤边缘纤维结缔组织内见较多量炎细胞浸润自杀基因治疗组：肿瘤边缘纤维结缔组织内见较多量炎细胞浸润联合治疗组：肿瘤边缘纤维结缔组织内见大量炎细胞浸润各组肿瘤组织炎细胞浸润情况第45页,共76页，2024年2月25日，星期天肝癌治疗实验结论

自杀基因疗法与六味地黄丸联合应用于小鼠移植性肝细胞癌的治疗具有协同效应，表明六味地黄丸对自杀基因治疗小鼠移植性肝细胞癌具有增效作用第46页,共76页，2024年2月25日，星期天丹参注射液H22肝癌荷瘤小鼠剥落瘤块照片A模型对照组；B丹参组；Ctk/GCV组；D联合组.第47页,共76页，2024年2月25日，星期天技术路线tk＋和tk－细胞按1∶4混合接种小鼠皮下组织（1×106细胞）病毒感染黑色素瘤细胞疗效观察动物分组及治疗GCV体外杀伤试验小鼠移植性黑色素瘤治疗实验

第48页,共76页，2024年2月25日，星期天分组及治疗

模型对照组正常对照组联合治疗组

六味地黄丸治疗组

自杀基因治疗组

（造模）第2天第7天第27天蒸馏水灌胃每天0.5mL

腹腔注射生理盐水每天0.25mL

蒸馏水灌胃每天0.5mL

腹腔注射生理盐水每天0.25mL

腹腔注射生理盐水每天0.25mL

腹腔注射GCV100mg﹒kg-1﹒d-1

腹腔注射GCV100mg﹒kg-1﹒d-1六味地黄丸悬液灌胃10g﹒kg-1﹒d-1

蒸馏水灌胃每天0.5mL

六味地黄丸悬液灌胃10g﹒kg-1﹒d-1（造模）（造模）（造模）（生理盐水）第49页,共76页，2024年2月25日，星期天成瘤时间接种模型对照组六味地黄丸治疗组自杀基因治疗组联合治疗组

24681012141618202224262830第50页,共76页，2024年2月25日，星期天成瘤率第51页,共76页，2024年2月25日，星期天肿瘤生长体积曲线时间（d）时间（d）第52页,共76页，2024年2月25日，星期天肿瘤质量及抑瘤率注：*与模型对照组比较P<0.05

六味地黄治疗组因有2只肿瘤较大的荷瘤小鼠后期死亡未能获得肿瘤标本，该数据低于实际数据

抑瘤率=（模型组肿瘤质量－治疗组肿瘤质量）/模型组肿瘤质量×100%组别n肿瘤质量（g）抑瘤率（%）模型对照组100.9583±1.3260自杀基因治疗组110.3566±0.856962.8六味地黄治疗组70.4369±0.693754.4联合治疗组100.1234±0.2538*87.1第53页,共76页，2024年2月25日，星期天各组肿瘤质量图示注：六味地黄治疗组因有2只肿瘤较大的荷瘤小鼠后期死亡未能获得肿瘤标本，该数据低于实际数据第54页,共76页，2024年2月25日，星期天病理检查结果(肉眼观察)

注：B：肿瘤模型组；C：自杀基因治疗组；D：六味地黄丸治疗组；

E：联合治疗组第55页,共76页，2024年2月25日，星期天病理检查结果(光镜观察

)

模型对照组

模型对照组：肿瘤组织内可见细胞密集，细胞内可见黑色素自杀基因治疗组肿瘤组织内可见细胞密集细胞内可见黑色素六味地黄治疗组肿瘤组织内可见密集的肿瘤细胞联合治疗组肿瘤组织内可见细胞密度稍降低各组细胞密度第56页,共76页，2024年2月25日，星期天模型对照组肿瘤内可见大片坏死组织自杀基因治疗肿瘤内可见大片坏死组织六味地黄治疗组肿瘤内可见大片坏死组织联合治疗组肿瘤内可见坏死组织各组肿瘤坏死情况第57页,共76页，2024年2月25日，星期天模型对照组肿瘤周围无明显胞膜形成自杀基因治疗组肿瘤周围见薄层假包膜六味地黄丸治疗组：肿瘤周围见薄层假包膜联合治疗组肿瘤周围明显的假包膜形成各组肿瘤纤维结缔组织增生情况第58页,共76页，2024年2月25日，星期天模型对照组肿瘤周围组织内见少量炎症细胞浸润自杀基因治疗组肿瘤周围组织内见少量炎症细胞浸润六味地黄丸治疗组肿瘤周围组织内有较多炎症细胞浸润联合治疗组肿瘤间质及周围组织内见多量淋巴细胞浸润各组肿瘤组织炎细胞浸润情况第59页,共76页，2024年2月25日，星期天恶性黑色素瘤治疗实验结论六味地黄丸对自杀基因治疗小鼠移植性恶性黑色素瘤具有增效作用第60页,共76页，2024年2月25日，星期天细胞水平实验第61页,共76页，2024年2月25日，星期天中药成分联合tk/GCV系统对肝癌细胞的杀伤作用中药成分对肝癌细胞的作用(确定筛选药物及联合用药剂量)Q值法分析联合作用是否有协同性有效中药成分增效机制探讨有效中药成分对细胞周期、细胞凋亡率的影响有效中药成分对肝癌细胞GJIC的影响自身旁杀伤效应检测大鼠肝癌细胞tk-、tk+细胞对GCV敏感性检测决定采用的GCV浓度建立大鼠肝癌细胞tk/GCV系统技术路线第62页,共76页，2024年2月25日，星期天大鼠肝癌细胞CBRH7919/tk-和CBRH7919/tk+对GCV敏感性（MTT法，72h）第63页,共76页，2024年2月25日，星期天CBRH7919/tk-和CBRH7919/tk+不同混合比例对tk/GCV系统旁观者效应的影响(MTT法）

组别tk+细胞比例（％）存活率（%）GCV15.7μM10％98.2±5.525％92.6±10.9310％71.0±9.0

a420％57.3±5.2

b540％48.8±7.0

b660％31.0±3.5

b25.9±4.6

b7100％aP

0.05,bP

0.01,与组1比较第64页,共76页，2024年2月25日，星期天(一)六味地黄丸药物血清联合不同比例tk/GCV系统对大鼠肝癌细胞的作用观察第65页,共76页，2024年2月25日，星期天血清（%）GCVGCV5%tk/GCV(0μM)(39.2μM)(39.2μM)

对照对照对照含药含药含药

Q值057.5100.00±15.2469.70±15.1263.60±1.71122.04±5.99109.67±11.8594.78±6.86128.79±11.91109.53±9.7169.87±28.12

a128.06±0.90105.47±7.7190.51±9.85

120.06±9.2793.58±4.9656.86±13.71

a1.191.12

(mean±SDn=3)TheeffectofherbsserumofLiuweiDiduangBoluscombiningwith5%tk/GCVsystemonCBRH7919(MTT

assay)(Serum:12h)

第66页,共76页，2024年2月25日，星期天血清（%）GCVGCV10%tk/GCV(0μM)(39.2μM)(39.2μM)

对照对照对照含药含药含药

Q值057.5100.00±15.63c

85.59±6.37ac72.40±8.48b

89.06±12.85c73.46+±12.55c76.40±16.17b

91.06±9.69c84.58±6.25c55.97±13.06abd

97.45±12.60c91.88±8.34cb

75.16±11.99b

92.77±11.11c87.89±1.87db

57.79±8.45bd1.231.73

(mean±SDn=6)TheeffectofherbsserumofLiuweiDiduangBoluscombiningwith10%tk/GCVsystemonCBRH7919(MTTassay)(Serum:12h)

第67页,共76页，2024年2月25日，星期天10%tk/GCV，7.5%对照血清孵育12h10%tk/GCV，7.5%含药血清孵育12h第68页,共76页，2024年2月25日，星期天血清（%）GCVGCV10%tk/GCV(0μM)(39.2μM)(39.2μM)

对照对照对照含药含药含药

Q值057.5100.00±6.2883.50±9.3569.57±8.78

77.13±3.1772.93±7.9471.98±3.11

a

113.66±4.1984.15±9.5774.80±16.66

a

94.07±10.0868.84±8.8866.31±11.61

a

90.47±3.1779.88±10.0966.53±17.79

a1.041.26

(mean±SDn=3)TheeffectofherbsserumofLiuweiDiduangBoluscombiningwith10%tk/GCVsystemonCBRH7919(MTTassay)（Serum:24h）

第69页,共76页，2024年2月25日，星期天血清（%）GCVGCV20%tk/GCV(0μM)(39.2μM)(39.2μM)

对照对照对照含药含药含药

Q值057.5100.00±1.3073.10±7.9360.95±11.83

67.26±4.5064.54±4.0146.89±3.84

83.29±8.8970.45±9.1441.93±4.54a81.73±6.9676.56±6.3658.15±5.87

96.40±4.9281.01±3.9064.65±8.43

1.020.82

(mean±SDn=3)TheeffectofherbsserumofLiuweiDiduangBoluscombiningwith20%tk/GCVsystemonCBRH7919(MTT

assay)(Serum:12h)