食品化验员微生物检测知识培训

食品化验员微生物检测知识培训微生物(microorganism，microbe)是一群个体微小、结构简单的低等生物的统称。通常人的肉眼看不见，必须借助于光学显微镜或电子显微镜才能看到。概念第2页,共45页，2024年2月25日，星期天原核微生物微生物的分类非细胞型真核微生物无细胞结构，无产生能量的酶系统，由单一核酸和蛋白质衣壳组成，必须在活细胞内增殖，病毒属于此类微生物。细胞核的分化程度高，有核膜、核仁和染色体，能进行有丝分裂，如真菌、藻类细胞分化程度低，只有DNA盘绕而成的拟核，无核仁和核膜,包括细菌、衣原体、支原体、立克次体、螺旋体和放线菌。第3页,共45页，2024年2月25日，星期天微生物的主要特点“短”——个体微小：＜0.1mm，需借助显微镜观察“平”——构造简单：单细胞，简单多细胞或非细胞“快”——繁殖快速：20分钟一代，一天内1个10亿“多”——各类多样：细菌、真菌、病毒、原生动物“广”——分布广泛：土壤、空气、水和极端环境中第4页,共45页，2024年2月25日，星期天细菌细菌的群体形态在固体培养基上（内）的群体形态——菌落单个或少数的细胞在固体培养基上（内）会形成的以母细胞为中心的一堆肉眼可见的，有一定形态、构造特征的子细胞集合。细菌菌落常表现为湿润、粘稠、光滑、较透明、易挑取、质地均匀以及菌落正反面或边缘与中央部位颜色一致等。单位:CFU第5页,共45页，2024年2月25日，星期天任务一:微生物培养基第6页,共45页，2024年2月25日，星期天任务分析一、检测意义

培养基是供微生物、动植物组织生长和维持用的人工配制的养料。要制作培养基，就需要了解微生物的营养物质吸收方式以及常用的培养基配制技术。二、检测方法GB\T4789.28-2003食品微生物学检验染色法、培养基和试剂

第7页,共45页，2024年2月25日，星期天学习目标知识目标1、微生物生长所需要的基本营养及运输方式。2、培养基的概念、分类及配制原则技能目标1、正确进行培养基的分装和无菌检验2、正确配制实验室常用培养基第8页,共45页，2024年2月25日，星期天相关知识一、微生物的营养1.微生物的细胞化学构成微生物细胞水（70%-90%）干物质无机物（盐）有机物蛋白质、多糖、脂、核酸、维生素、有机酸等及其降解产物第9页,共45页，2024年2月25日，星期天微生物的营养构成

微生物的营养物质按照在机体的生理作用不同可分为：碳源、氮源、能源、无机盐、水和生长因子微生物、动物、植物之间存在营养上的统一性第10页,共45页，2024年2月25日，星期天二、培养基的定义

培养基提供微生物生长繁殖和生物合成名种代谢产物所需要的、按一定比例配制的多种营养物质的混合物，提供微生物所需能量，包括碳源、氮源、无机元素、生长因子及水、氧气等三、培养基的分类

(1)按成分分类天然培养基合成培养基复合（半合成）培养基（2）按物理状态分类半固体培养基液体培养基固体培养基第11页,共45页，2024年2月25日，星期天第12页,共45页，2024年2月25日，星期天第13页,共45页，2024年2月25日，星期天任务二:消毒与灭菌技术第14页,共45页，2024年2月25日，星期天任务分析一、检测意义

在进行微生物检验前，可以通过消毒和灭菌技术，不同程度的将实验物品和实验环境中的微生物减少甚至完全杀灭，从而减少或消除外来微生物对试验结果的影响，生物检测结果的真实性和准确性二、检测方法（1）加热灭菌干热灭菌湿热灭菌（2)辐射灭菌—紫外线灭菌第15页,共45页，2024年2月25日，星期天干热灭菌法原理：干热灭菌是在电热干燥箱内利用高温干燥空气（160℃~170℃）进行灭菌，它是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌目的。此法适用于玻璃器皿如移液管、试管和培养皿的灭菌。培养基、橡胶制品、塑料制品不能采用干热灭菌。细胞内的蛋白质凝固性与其本身的含水量有关，在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白质凝固就越快，反之含水量越小，凝固越慢。干热灭菌所需温度要高，时间长1-2h，但干热灭菌温度不能超过180℃，否则，包器皿的报纸或棉塞就会烧焦，甚至引起燃烧。第16页,共45页，2024年2月25日，星期天干热灭菌法1、将培养皿、吸管等下班器皿洗净干燥后，用旧报纸包好，或装入特制的铁筒中2将包装好的玻璃仪器摆入烤箱中，彼此间留有一定的空隙以便流通空气。3、关紧箱门，接上电源4、设定温度。灭菌温度一般在160℃-170℃保持1-2个小时5、待自然降温冷却后才能开门取出玻璃器皿，避免由于温度突然下降引起玻璃器皿碎裂。第17页,共45页，2024年2月25日，星期天湿热灭菌法

高压蒸气灭菌法主要是指将物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸气，待水蒸气急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸气不能溢出，而增加了灭菌锅内的压力，从而使沸点增高，得到高于100℃的温度，导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大。因为在湿热情况下，菌体吸收水分，使蛋白质易于凝固；同时湿热的穿透力强，可增加灭菌效力。讨论：干热灭菌法和湿热灭菌法哪个杀菌效力大?第18页,共45页，2024年2月25日，星期天湿热灭菌法一般培养基用0.1MPa，121.5℃，15—30min可达到彻底灭菌的目的。灭菌的温度及维持时间随灭菌物品的性质和容量等具体性况而有所改变。打开锅盖加水放入待灭菌的物品密封设定温度时间通电加热灭菌断电开盖第19页,共45页，2024年2月25日，星期天紫外线灭菌法紫外线灭菌是用紫外灯进行的，波长为200-300nm的紫外线都有杀菌能力，其中以260nm的杀菌能力最强，它的杀菌效率与杀菌时间是成正比的，它的原理主要是抑制了DNA的复制，另一方面，由于辐射能使空所中的氧电离成【0】，再使氧气生成臭氧或使水氧化生成过氧化氢。臭氧和过氧化氢均有杀菌的作用。紫外线的穿透力不大，所以只适用于无菌室的空气及物体及物体表面的灭菌。紫外线灯距照射物不超过1.2m为宜。为了加强紫外线灭菌效果，在打开紫外灯前；可在无菌室内喷洒石炭酸溶液，一方面使空气中附着有微生物的尘埃降落，另一方面也可以杀死一部分细菌，无菌室内的桌面、凳子可用2%-3%的来苏乐擦洗，然后再打开紫外灯照射0.5-1h，即可增强杀菌效果，达到灭菌目的.第20页,共45页，2024年2月25日，星期天任务三:食品中菌落总数的检验第21页,共45页，2024年2月25日，星期天任务分析一、检测意义菌落总数主要作为判别食品被污染程度的标志判定细菌在食品中繁殖的动态二、检测方法

GB4789.2-2010《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》第22页,共45页，2024年2月25日，星期天

菌落总数指食品检样经过处理，在一定条件下培养后，所得1ml（或1g）被检样品中所含细胞菌落的总数，以CFU\g(ml)。菌落总数并不表示实际中的所有细菌总数，也不能区分其中细菌的种类，只包括一群在计数平板琼脂中生长发育、嗜中温的需氧和兼性厌氧的细菌菌落总数，所以有时被称为杂菌数，需氧菌数等。食品中细菌菌落总数越多，则食品含有致病菌的可能性越大，食品质量越差；菌落总数越小，则食品含有致病菌的可能性越小。须配合大肠菌群和致病菌的检验，才能对食品做出较全面的评价。第23页,共45页，2024年2月25日，星期天检验程序检样25g(mL)样品+225mL稀释液，均质10倍系列稀释选择2个~3个适宜稀释度样品匀液，各取1mL分别加入无菌培养皿内每个培养皿中加入15~20mL平板计数培养基，混匀36℃±1℃48h±2h计算各平板菌落数计算菌落总数报告第24页,共45页，2024年2月25日，星期天培养基与试剂:平板计数琼脂培养基

无菌生理盐水第25页,共45页，2024年2月25日，星期天操作前，用镊子取酒精棉消毒桌子、消毒手。第26页,共45页，2024年2月25日，星期天从培养皿筒中取出培养皿。培养皿筒取出培养皿第27页,共45页，2024年2月25日，星期天在培养皿上编号提示：培养皿上的标记为稀释倍数。固体样品\半固体样品：稀释倍数为10-1、10-2、10-3液体样品：稀释倍数为100、10-1、10-2-1-1-2-2-3-3空白空白00-1-1-2-2空白空白第28页,共45页，2024年2月25日，星期天固体\半固体样品称量用镊子取酒精棉擦手，点燃酒精灯；取25g(ml)样品加入225ml生理盐水中（对样品进行10倍稀释）第29页,共45页，2024年2月25日，星期天25g+225mL生理盐水10-1-1-1-2-2-3-3空白空白

10-2

10-3灭菌生理盐水固体\半固体样品1mL1mL1mL1mL1mL第30页,共45页，2024年2月25日，星期天在培养皿中加入平板计数琼脂培养基（15~20mL），轻摇培养皿，使试样与培养基混匀。提示：倒培养基时，培养皿的开口尽量要小；同时，开口对着酒精灯。提示：摇动培养皿时，切勿使培养基溅到培养皿盖上。第31页,共45页，2024年2月25日，星期天待培养基凝固后，将培养皿放入恒温培养箱。提示：培养皿放入培养箱时要倒置。注意选择设置为36℃±1℃的培养箱。第32页,共45页，2024年2月25日，星期天任务四:食品中大肠菌群的检验第33页,共45页，2024年2月25日，星期天任务分析一、检测意义大肠菌群是作为粪便污染的判定指标大肠菌群是评价食品卫生质量的重要指标之一二、检测方法

GB4789.3-2010《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》第34页,共45页，2024年2月25日，星期天大肠菌群系指一群在32～37℃下24hr内，能发酵乳糖产酸、产气、需氧或兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌群主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标，来评价食品卫生质量，具有广泛的卫生学意义。第35页,共45页，2024年2月25日，星期天大肠菌群的检测第一法大肠菌群MPN计数法第二法大肠菌群平板计数法第36页,共45页，2024年2月25日，星期天第一法：大肠菌群MPN计数法第37页,共45页，2024年2月25日，星期天培养基与试剂:月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LaurylSulfateTryptose，LST）肉汤

煌绿乳糖胆盐（BrilliantGreenLactoseBile，BGLB）肉汤无菌生理盐水无菌1mol/LNaOH

无菌1mol/LHCl第38页,共45页，2024年2月25日，星期天初发酵试验每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL（如接种量超过1mL，则用双料LST肉汤），36℃±1℃培养24h±2h，观察倒管内是否有气泡产生，24h±2h产气者进行复发酵试验，如未产气则继续培养至48h±2h，产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。第39页,共45页，2024年2月25日，星期天LST判定结果大肠菌群的产气量，多者可以使发酵倒管全部充满气体，少者可以产生比小米粒还小的气泡。如果对产酸但未产气的乳糖发酵如有疑问时，可以用手轻轻打动试管。第40页,共45页，2024年2月25日，星期天复发酵试验用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）管中，36℃±1℃培养48h±2h，观察产气情况。产气者