第一节 克隆载体课件

第一节克隆载体第一节克隆载体质粒是存在于细胞质中的一类独立于染色体的自主复制的遗传成份.Plasmid一词由JoshuaLederberg于1952年提出。质粒的命名:例:pBR322一、质粒载体p代表质粒;“BR”代表两位研究者Bolivar和Rogigerus姓氏的字首,“322”是实验编号.第一节克隆载体第一节克隆载体已在形形色色的细菌类群中发现，大多数质粒的宿主范围较窄，只能生存于亲缘关系很近的少数细菌种类中。是独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位已进化出多种机制以维持其在细菌宿主中的稳定的拷贝并将质粒分子精确地分配给子代细胞。1.质粒的特点：（一）质粒的基本性质第一节克隆载体其复制和转录或多或少依赖于宿主编码的酶和蛋白质。常常含有一些编码对细菌宿主有利的基因。这些基因可赋予宿主迥然不同的特征，其中不少具有重要的医学和商业价值。由质粒产生的表型包括产生抗生素、大肠杆菌素、肠毒素、限制酶与修饰酶，以及降解复杂的有机化合物等。第一节克隆载体质粒通过合成长效致死物和短效解毒剂得以在细菌中生存.第一节克隆载体质粒绝大多数是环形双链的DNA但也存在有线形质粒、RNA质粒（酵母的杀伤质粒）2.质粒的生物学特征只能在在寄主细胞内独立增殖，随寄主分裂而遗传。自然界中，无论是真核生物还是原核生物细胞，甚至真菌的线粒体中都发现有质粒的存在。质粒DNA分子可以稳定存在于染色体外，呈游离状态,有一些质粒在一定条件下能可逆地整合到寄主染色体上，随染色体的复制而复制,称为附加体第一节克隆载体第一节克隆载体3.环形双链DNA质粒分子组成与构型多数为双链环状DNA分子.分子量从不足2kb到100kb以上,多数为10kb左右.具有三种不同的构型：共价闭合环形DNA(cccDNA):两条多核苷酸链均保持完整的环形结构。DNA呈超螺旋的SC构型。开环DNA(ocDNA)：有一条保持完整的环形结构，另一条链出现有一至数个缺口。即OC构型。线性分子（lDNA)：经限制性内切酶切割之后，双链断裂而形成。称L构型。第一节克隆载体第一节克隆载体第一节克隆载体4.作为克隆载体质粒的条件适于作为基因克隆载体的所有质粒DNA分子，都必须包括三种共同的组分：复制子选择性标记基因克隆位点基因克隆载体还需要满足具有较小的分子量和较高的拷贝数第一节克隆载体根据分子特性，革兰氏阴性细菌的质粒可分为两种接合型又叫自主转移的质粒具有自主复制所必须的遗传信息之外，还带有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。

可以在不同细胞间转移。非接合型的质粒不能自我转移的质粒。失去控制细菌配对和质粒接合转移的基因。不能自主转移5、质粒的类型第一节克隆载体F质粒的tra区包含细菌接合所需的基因第一节克隆载体第一节克隆载体质粒的转移与迁移.转移一般指一个质粒独立地从一个细胞转移到另一个细胞.迁移则指本身不能转移,在另一个接合型质粒存在下,从一个细胞移至另一种细胞.质粒迁移的条件:①bom位点(colE1)nic位点.②mob基因.结合动员基因.编码迁移蛋白,实质是一种核酸酶,切割nic位点.迁移作用(mobiligation):由共存接合型质粒引发的非接合型质粒的迁移过程.第一节克隆载体第一节克隆载体从基因工程安全角度考虑，接合型质粒不宜作为克隆载体。因为从理论上存在着发生使ＤＮＡ跨越生物种间遗传屏障的潜在危险.而利用迁移作用可能将非接合型质粒从一种细胞转移至另一种细胞,这种方法叫三亲杂交法.一般将受体菌、供体菌及辅助转移菌三者共培养过夜.在基因工程中得到大量的应用.第一节克隆载体三亲杂交法第一节克隆载体根据质粒的性状特征，可分为五种不同的类型：F(Fertility)质粒:

Ｒ(Resistance)质粒Col质粒降解质粒（Degradativeplasmids）致瘤质粒（Virulenceplasmids）农杆菌Ti质粒

第一节克隆载体根据质粒的表现分为:定义：质粒除了与控制本身复制和转移相关的基因外，有的质粒还携带一些其他的基因，宿主细胞由于含有这样的质粒而呈现出新的性状，这样的质粒称为显性质粒。相反，即使宿主细胞含有某种质粒，但无异样性状表露，这样的质粒称为隐蔽质粒。受检测手段的限制，现定为隐蔽型的质粒未必是真正的隐蔽质粒。显性质粒和隐蔽质粒第一节克隆载体人工构建的质粒根据其功能及用途分为:

(1)多拷贝质粒

(2)测序质粒

(3)整合质粒

(4)穿梭质粒

(5)表达质粒

(6)探针质粒

第一节克隆载体环状质粒的复制形式主要分theta(θ)及rollingcircle两种。质粒的复制子决定其拷贝数。复制子是一个遗传单位，包括DNA复制起点,相关的调控元件,复制终点。6、质粒的复制复制起点是一段特定的DNA片段，长约几百碱基对，常称为oriV(originofvegetativereplication)；有时R-质粒的复制原称为oriR,其相关的顺式作用调控元件中含有参与DNA合成起始的由质粒或宿主编码的可扩散因子的结合位点。定义：质粒DNA中能自主复制并维持正常拷贝数的一段最小的核酸序列单位。第一节克隆载体与一个起始点相连而没有被终点隔断的任何序列,都是作为复制子的一部分而被复制.起始点是一种顺式作用位点,只能作用于该位点所在的DNA分子.第一节克隆载体质粒的拷贝数定义:(1)通常定义:生长在标准培养条件下(LB培养基)每个细菌细胞中平均所含有的质粒的拷贝数.(2)特殊定义:在营养富有余的培养基中,每个细胞当中每条染色体所拥有的平均质粒DNA分子数.(3)<基因工程原理>中定义:在LB液体培养基中生长的每个细胞,如果具有20个及以上的质粒DNA分子,就叫高拷贝质粒,如果低于20个则叫低拷贝质粒.第一节克隆载体质粒就其复制方式而言分为两类：严紧型（stringentplasmid)每个寄主细胞中仅有１－３份的拷贝松弛型（relaxedplasmid)

每个寄主细胞中仅有１０－６０份的拷贝一般接合型的质粒是严紧型，具有较高的分子量。而非接合型的质粒是松驰型的，具有较低的分子量。例外，接合型的质粒Ｒ6K分子量较小，为松驰型。质粒中已鉴定的复制子已逾30个，但分子克隆中常用的几乎都带有一个来源于pMB1的复制子，可使每个细菌细胞中维持１５－２０个拷贝。第一节克隆载体即同一种质粒在不同的寄主类型中可能属于严紧型的也可能属于松驰型的如ColE1-K30在大肠杆菌中属于松弛型的,在奇异变形杆菌中是严紧型的.质粒拷贝数还与寄主状况有关。第一节克隆载体氯霉素扩增:

pMB1或ColEI类质粒复制子的复制完全依靠宿主细胞提供的半衰期较长的复制酶及蛋白因子（DNA聚合酶I，III，RNA聚合酶以及dnaB、dnaC、dnaD、dnaZ的产物），因此在蛋白质合成中断时，质粒复制能持续合成，这样当用氯霉素抑制蛋白质合成并阻断细菌染色体复制时，带有pMB1或ColEI复制子的质粒将利用丰富的原料大量复制，最后每个细胞可以积聚2000-3000个拷贝，这叫做氯霉素扩增。

第一节克隆载体另外两种质粒（psc101和p15A）的复制子的复制受质粒上编码的蛋白因子的正调节。氯霉素抑制蛋白质合成后，这类质粒便不能持续复制。第一节克隆载体质粒复制控制的分子模型抑制蛋白稀释模型阻遏蛋白在低浓度时处于单体状体，高浓度时处于多体状态。只有多体状态具有活性自体阻遏蛋白质模型阻遏蛋白具有自体阻遏活性。第一节克隆载体第一节克隆载体第一节克隆载体7、质粒的不相容性(不亲和性)指在没有选择压力下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够共存于同一个寄主细胞系中的现象。只有当两种质粒在同一寄主细胞中都不受限制时，才能判断亲缘关系较近的质粒，彼此之间互不相容，它们属于同一种不亲和群。大肠杆菌质粒中至少已鉴别出３０种以上的不亲和群。第一节克隆载体质粒不相容性现象与质粒的拷贝数及分离的调控有关.携带相同复制子的不同质粒属于同一不相容组。带有不可互换成分的复制子的质粒则属于不同的不相容组。大多数质粒都会产生出一种控制质粒复制的阻遏蛋白质，其浓度与质粒的拷贝数成正比。阻遏蛋白通过同其靶序列间的相互作用，使双链ＤＮＡ中的一条断裂从而导致质粒ＤＮＡ复制的启动。并建立起一种调节质粒拷贝数的负反馈环。当质粒面临高拷贝数和高浓度的阻遏蛋白时，其复制活动便被抑制了。反之，复制反应继续进行。第一节克隆载体第一节克隆载体8.质粒ＤＮＡ的分离与纯化(1)氯化铯密度梯度离心法(2)碱变性法第一节克隆载体（二）质粒载体的构建一般条件：选择适合手头工作目标的质粒载体选择载体上的限制性内切核酸酶位点用合适的连接反应条件选用最适合扩增外源目的ＤＮＡ的质粒的大肠杆菌菌株。具备筛选转化子的方法和验证目的基因克隆的技术有时需要特殊的步骤以降低转化菌落的背景。在每一阶段都需要设置阴性及阳性对照。第一节克隆载体构建质粒克隆载体的基本策略：(１)质粒载体应该能在转化的受体细胞中进行有效的复制。作为质粒的克隆载体，希望在受体细胞中有较多的拷贝数。所以含有能在受体细胞内有效复制的质粒复制起始位点（ori)，最好是松弛型质粒的复制起始位点。(２)必须含有允许外源DNA片段克隆的位点，且这样的克隆位点尽可能多。为了便于多种类型末端的DNA片段的克隆，质粒克隆载体中往往组装一个含多种限制性核酸内切酶识别序列的多克隆位点(MCS)连杆。第一节克隆载体(３)必须含有供选择克隆子的标记基因。(4)质粒载体本身DNA分子应尽可能小。(５)根据需要，使构建的质粒克隆载体中组装各种‘元件’，构建成不同用途的质粒克隆载体。如在克隆位点上游组装强的启动子，下游组装相应的终止子，就成为强表达质粒克隆载体。或者在质粒克隆载体的合适位置组入受体细胞染色体DNA的同源序列，成为基因整合平台系统的供体质粒克隆载体。第一节克隆载体质粒克隆载体的设计和构建过程应遵循的原则：(１)选择合适的复制起始位点。选用合适的出发质粒。(２)组装合适的选择标记基因。(３)增加或减少酶切位点。正确获得构建质粒克隆载体的元件。组装一个含有多种单一限制性内切酶识别序列的多克隆位点(MCS)(4)缩短长度。在能达到预期目的前提下，构建过程应力求简单。第一节克隆载体（三）常用的质粒载体1、天然质粒指那些没有经过以基因克隆为目标的体外修饰改造的质粒。常见的可用于基因克隆的天然质粒有：ColE1,RSF2124和pSC101pSC101是第一个用于基因克隆的载体。它对于限制酶EcoR1只有一个识别位点，而且在此克隆外源ＤＮＡ不影响它的复制功能，也不破坏其唯一的四环素抗性基因。其缺点是分子量较大，拷贝数少，且又只有一个抗菌素抗性基因，无法用插入失活技术选择重组分子。第一节克隆载体ColE1也只有唯一的单切割位点，且可以根据大肠杆菌素的免疫性选择转化子，该质粒拷贝数较高，但要用免疫筛选，在化学上相当麻烦。RSF2124派生于ColE1,可用氨苄青霉素的抗性标记进行选择。但仍然不是较好的载体。2、理想的质粒载体应具备以下条件：１）具有复制位点２）具有抗菌素抗性基因。３）具有若干个限制酶单一识别位点。可以满足基因克隆的需要而且在其中插入适当大小的外源ＤＮＡ片段之后，应不影响质粒ＤＮＡ的复制功能。４）具有较少的分子量和较高的拷贝数。第一节克隆载体3、选择标记质粒载体含有遗传标记，它赋予带有质粒的细菌在选择条件下以较强的生长优势。在分子克隆中，这些标记用来：选择带有质粒的细菌克隆。防止负载质粒或质粒编码蛋白质所致的危险因素，保持转化的细菌。因为高拷贝的质粒和大量的重组蛋白质可严重妨碍转化细胞的生长甚至生存，为了防止质粒被从细菌中清除，在培养基中一直加入合适的抗生素来维持选择压力是重要的。第一节克隆载体4、不同类型的质粒载体：(１)高拷贝数的质粒载体(２)低拷贝数的质粒载体目的基因产物含量高时对寄主细胞的正常新陈代谢具有扰乱作用时用。(３)失控的质粒载体是一些低拷贝的质粒，其复制控制是温度敏感型的，也就是说在不同的温度下，拷贝数会有显著的变化。

根据此原理，发展了失控的质粒载体pBEU1和pBEU2，并成功地用来扩增克隆基因及其编码产物。第一节克隆载体质粒ＤＮＡ可累积到细胞总ＤＮＡ的５０％(４)插入失活的质粒载体该类质粒至少含有两个选择记号，在与外源DNA的重组过程中，其中一个记号保持完整，用作选择转化子然后根据另一记号的插入失活效应进一步筛选出转化子，此表明它带有外源DNA.第一节克隆载体(５)正选择的质粒载体应用只有突变体或重组体分子才能正常生长的培养条件进行选择。可以直接选择记号并给予寄主细胞相应的表型。质粒pKN80带有来自Mu噬菌体DNA的EcoR1-C片段，它编码一种致死功能的kil基因。质粒pKN80可以在Mu噬菌体溶源菌株中正常地复制，而对非溶源菌株是致死的。当其Hpa1或HINd3位点插入外源DNA后，便会使这种致死功能失活。第一节克隆载体pUR2是另一种正选择质粒载体：在X-gal培养基上，生长的转化子菌落，只有含有pUR2质粒的才能显示出特有的蓝色，而那些在EcoR1、BamH1或Hind3位点具外源ＤＮＡ插入的pUR2质粒转化子菌落则呈现白色。第一节克隆载体(６)表达载体按特殊设计构建能使克隆在其中特定位点的外源真核基因的编码序列，在大肠杆菌细胞中正常转录并转译成相应蛋白质的克隆载体特称为表达载体。主要组成包括大肠杆菌的启动子及操纵子位点序列，多克隆位点、转录及转译信号、质粒载体的复制起点及抗菌素抗性基因。第一节克隆载体pBR322质粒由三个不同来源的部分组成：第一部分来源于pSF2124质粒易位子Tn3的氨苄青霉素抗性基因（ampr)第二部分来源于pSC101质粒的四环素抗性基因(tetr),第三部分是来源于ColE1的派生质粒pMB1DNA复制起点。其优点：分子量小具有两个抗菌素抗性基因插入外源基因后变成ampsTetr

5、常用克隆质粒载体介绍第一节克隆载体第一节克隆载体第一节克隆载体tet第一节克隆载体pUC系列由加利福尼亚大学的科学家于1987年构建.四个组成部分：来自于pBR322质粒的复制起点氨苄青霉素抗性基因，但它的ＤＮＡ核苷酸序列发生变化不再含有原来的核酸内切限制酶位点。大肠杆菌β－半乳糖苷酶基因(lacZ）的启动子及其编码α肽链的ＤＮＡ序列，此特称为lacZ’基因，位于lacZ’基因中的靠近5‘端的一段多克隆位点区段。第一节克隆载体pUC18和pUC19载体第一节克隆载体其多克隆位点是一段特殊设计的具有许多不同的核酸内切酶单一识别序列的短序列。

lacZ’基因编码的α肽链是β－半乳糖苷酶的氨基末端的短片段，它同失去了正常氨基末端的β－半乳糖苷酶基因突变体互补时，便会产出有功能活性的β－半乳糖苷酶分子。当pUC质粒转化了染色体基因组存在此种β－半乳糖苷酶突变的大肠杆菌细胞之后，便会出现具有功能活性的β－半乳糖酶的积累,称为α

互补。第一节克隆载体第一节克隆载体β－半乳糖苷酶催化二糖乳糖水解为单糖：葡萄糖和半乳糖。该酶的活性可以用X-gal(５-溴-4-氢-吲哚-3-β-半乳糖苷）等显色底物加以检测，β－半乳糖苷酶可将X-gal转变为不溶性的深蓝色沉淀。第一节克隆载体由于在正常情况下，任何插入到多克隆位点的外源ＤＮＡ片段，都会阻断α肽链的合成，因此含有重组质粒载体的克隆是无色的，它可以与含有非重组质粒载体的克隆形成的蓝色背景明显地区别。其优点：具有更小的分子量和更高的拷贝数。适用于组织化学方法检测重组体。一步实现对重组子克隆的鉴定。第一节克隆载体TA载体耐热聚合酶可在PCR产物的3’端加上一个非配对的脱氧腺嘌呤核苷(A)，根据此特点研制出线性TA质粒载体，其5’端各带有一个不配对的脱氧胸腺嘧啶(T)，用该载体可进行PCR产物的直接克隆。

TA质粒可通过普通质粒进行构建而成。其方法是将一般质粒线性化，然后通过一些方法形成平末端，再在末端加上T就可得到。常见的有TaKaRa公司的pMD18-T第一节克隆载体6、穿梭质粒载体具有两种不同复制起点和选择标记，可在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。可以携带外源基因在不同物种细胞之间，特别是真核和原核细胞之间往返穿梭，所以十分有用。目前已构建了可在大肠杆菌与枯草杆菌、酿酒酵母和动物体中进行穿梭的载体。植物与大肠杆菌的穿梭载体还未发现。第一节克隆载体二噬菌体载体第一节克隆载体病毒核酸外壳蛋白包装病毒颗粒第一节克隆载体病毒颗粒

实现病毒的增殖利用此性质，可以构建各类病毒载体。感染利用其体系宿主细胞DNA(RNA)复制和蛋白的合成第一节克隆载体病毒细菌病毒植物病毒动物病毒称噬菌体，有双链的，单链的如花椰菜花叶病毒，烟草花叶病毒ＴＭＶ等如SV40,劳斯肉瘤病毒（反转录病毒）腺病毒哺乳动物和禽类中都有分布痘苗病毒在哺乳动物细胞胞浆中增殖杆状病毒（感染昆虫等无脊椎动物）第一节克隆载体即细菌病毒的总称英文：Bacteriophage简称phage.该词来源于希腊文phagos,意为吞噬。在结构上没有细胞结构，比原核和真核简单但比质粒复杂，因为它还编码蛋白质外壳。可以克隆和扩增特定的DNA片段。是一种良好的基因克隆载体。噬菌体概念第一节克隆载体噬菌体的一般生物学功能1保护自已的核酸分子免遭环境化学物质的破坏2将其核酸分子注入到被感染的细菌细胞3将被感染的细菌细胞转变成制造噬菌体的体系，大量产生子代噬菌体。4使感染的细菌细胞释放出子代噬菌体颗粒第一节克隆载体噬菌体的结构与核酸类型三种结构：无尾部的二十面体型具尾部的二十面体型（多数）线状体型。核酸类型：双链环性DNA单链环形DNA单链线性DNA单链RNA不同种噬菌体核酸分子量相差较大。个别有碱基替代现象。如T4噬菌体中没有C，由5-羟甲基胞嘧啶取代。SP01噬菌体中没有T,为5-羟甲基尿嘧啶取代第一节克隆载体噬菌体的感染性噬菌体的感染效率高到令人生畏的程度。在琼脂糖平板上形成噬菌斑。第一节克隆载体第一节克隆载体噬菌体的生命周期噬菌体基因组整合到细菌染色体上称为溶源吸附、注入，整合、复制只能进行溶菌周期的噬菌体称为烈性噬菌体形成清晰的噬菌斑噬菌体的生命周期溶菌周期溶源周期吸附、注入，转变、合成组装释放第一节克隆载体第一节克隆载体温和噬菌体，既能进入溶菌生命周期，又能进入溶源生命周期。形成混浊的噬菌斑.只有双链DNA的噬菌体才有溶源周期。第一节克隆载体第一节克隆载体溶源性细菌：具有一套完整的噬菌体基因组的细菌叫溶源性细菌。如果有某些噬菌体基因缺失了，不能完成其溶菌周期，含有这种噬菌体的细菌叫做缺陷性的溶源性细菌。溶源化lysogenization：用温和的噬菌体感染细菌培养物使之形成溶源性细菌的过程。整合：如果噬菌体的DNA是被包容在寄主细菌染色体DNA之中，便叫做已整合的噬菌体DNA.这种噬菌体DNA组入细菌染色体DNA的过程，称噬菌体DNA的整合或插入。以游离DNA分子形式存在的噬菌体DNA，叫做非整合的噬菌体DNA.一些常见概念第一节克隆载体原噬菌体：在溶源性细菌内存在的整合的或非整合的噬菌体DNA，叫做原噬菌体。如:λ，e14

一般当这些质粒或原噬菌体缺失或变异时也用“()”或“/”等加以区别表示。

第一节克隆载体另一种类型的溶源周期是以噬菌体P1为原型这种类型的基本特征是不存在噬菌体DNA分子的整合作用体系，而是变成了一种进行独立复制的环形的质粒DNA分子。第一节克隆载体溶源性细菌有两个重要特点第一，不能被头一次感染并使之溶源化的同种噬菌体再感染。溶源性细菌所具有的这种抗御同种噬菌体再感染的特性，叫做超感染免疫性。第二，经过许多世代之后，溶源性的细菌便能够开始进入溶菌周期。这个过程叫做溶源性细菌的诱发。在诱发过程中，噬菌体基因组以单一DNA片段的形式从寄主染色体DNA上删除下来。第一节克隆载体（一）λ噬菌体载体1与构建载体相关的性质:λ噬菌体由DNA和外壳蛋白组成.分头部和尾部.DNA集中在头部.(1)λ噬菌体的DNA在噬菌体中是线状DNA,全长48502bp,左右两端各有12个核苷酸组成的5’凸出粘性末端，称为cos位点(cohesiveendsite)．(2)λ噬菌体基因组有基因50个，各司其职，功能相近的聚集成簇．有些区域对λ噬菌体生长必须，有些区域为其生长非必需的．第一节克隆载体λ－DNA的结构第一节克隆载体λDNA被外壳蛋白包装之前，在cos位点切开，这样的基因图便是线性的．(3)具有限制性核酸内切酶的酶切位点.有56种之多.(4)λ噬菌体具有溶源和溶菌两条生长途径．第一节克隆载体2选用λ噬菌体作为构建克隆载体材料的依据λ噬菌体是一种温和的噬菌体．对大肠杆菌的感染性强,可以原噬菌体形式长期潜伏在溶原细胞中,易于保存.λ噬菌体能承载比较大的外源DNA片段．

在其DNA分子上有多种限制性核酸内切酶的切割位点，便于多种外源DNA片段的克隆．第一节克隆载体3野生的λ噬菌体DNA的改造多余限制位点的删除非必需区段的去除．第一节克隆载体ABCDEFABD+E+F

**第一节克隆载体酶切位点的处理:确定一种限制性核酸内切酶识别序列用作克隆位点，并抹去这种酶的其它多余识别位点．对于非必需区的切割位点可直接切去．对于必需区的切割位点可用点突变或甲基化酶处理等方法使必须区内的这种酶的识别序列失效．4构建λ噬菌体克隆载体的基本技术路线第一节克隆载体标记基因:在λDNA的非必需区内组入选择标记基因．建立重组λDNA分子体外包装系统．包装蛋白由D蛋白和E蛋白组成．为了制备用于体外包装重组λDNA的各种蛋白质，筛选到了D基因和E基因分别缺失的λ噬菌体突变株D－和E－．两种噬菌体都不能包装成噬菌体颗粒．第一节克隆载体BHB2688是E基因缺失的λ溶源菌，BHB2690是D基因缺失的λ溶源菌．经诱导培养后可提取制备用于包装的全部蛋白质，成为λDNA分子体外包装系统．第一节克隆载体第一节克隆载体λ噬菌体头部外壳蛋白质容纳DNA的能力是有一定限度的。上限不得超过其正常野生型DNA总量的5％左右，而低限又不得少于正常野生型DNA总量的75％。按野生型λDNA分子长度为48kb计算，即λ噬菌体只容许包装<51kb而>34.6kb的DNA片段。

编码必要基因的DNA区段占28kb，因此λ载体克隆外源DNA的理论极限值应是最大23kb,最小6.6Kb。

第一节克隆载体5λ噬菌体载体的主要类型(1)插入型载体外源DNA克隆到插入型的λ载体分子上，会使噬菌体的某些生物功能丧失效力，即所谓的插入失活效应。第一节克隆载体Ａ免疫功能失活的插入型载体在其免疫区带有一两种核酸内切酶的单切割位点。外源片段插入到该位点之后,合成活性阻遏物的功能遭受破坏，不能进入溶源周期。凡带有外源DNA插入的λ重组体都只能形成清晰的噬菌斑，而没有外源DNA插入的亲本噬菌体就会形成混浊的噬菌斑。这种形态上的差异，为分离重组体分子提供了方便的标志。根据插入效应的特异性，又可分为以下两种第一节克隆载体第一节克隆载体Ｂβ-半乳糖苷酶失活的插入型载体可以通过噬菌斑的颜色判断有无外源基因的插入第一节克隆载体(2)替换型载体替换型载体又叫取代型载体，在其中央部分有一个可以被外源插入的DNA分子所取代的DNA片段的克隆载体。在构建此类载体时，安排在中央可取代片段两侧的多克隆位点是反向重复序列，因此当外源DNA插入时，一对克隆位点之间的DNA片段便会被置换掉，从而有效地提高克隆外源DNA的能力。第一节克隆载体第一节克隆载体第一节克隆载体λ噬菌体载体的选择:

并没有一种可以适于克隆所有DNA片段的入噬菌体载体。具体选择时，应该考虑以下几点：①如果要从染色体DNA来构建基因组文库，那么可以选择置换型的λ噬菌体载体，因其可容纳DNA较大片段。②如果要从染色体DNA中分离某一基因，而又不需构建完整基因组文库，那么选择的自由度就较大。③如果需要构建cDNA文库，那么常选λgt10或λgt11插入型载体；如果考虑选用抗体探针，那么常选λgt11这一有效表达载体。第一节克隆载体（二）M13噬菌体为了测序的需要，可应用丝状噬菌体产生单链DNA第一节克隆载体M13为丝状噬菌体家族成员，含有长度约为6400碱基的单链DNA基因组。M13是一种丝状病毒颗粒，它只能感染雄性细胞菌，并不裂解宿主，相反，它甚至要从继续生长和分裂的感染细胞中释放出来。感染时，单链噬菌体基因组转变成称为复制型（RF)的双链环状结构，它以凯恩斯复制(θ型复制

)。然后，RF分子以滚环方式产生单链正链子代DNA分子，RF分子也作为M13噬菌体11个基因进行转录的模板。三个病毒基因产物（pⅡ,p

ⅤpⅩ）用于病毒DNA的复制，五个病毒基因编码跨膜蛋白（pⅢ,pⅥ,pⅦ,pⅧ,pⅨ)构成外壳。子代病毒颗粒是通过一个协同过程组装而成的。衣壳蛋白突入细菌细胞膜，并围绕正链子代DNA装配，这一蛋白－DNA复合物以丝状病毒颗粒形式分泌出细胞。

第一节克隆载体第一节克隆载体所有M13噬菌体基因组的顺式作用元件均集中在一个508bp的基因间区，这一区域已被克隆到质粒上。当转化了这种质粒的细菌被野生型或辅助M13噬菌体感染，单链形式的质粒DNA就被包装入子代噬菌体。由于其基因组不稳定，重组丝状噬菌体一般不用于外源DNA片段的克隆和长期扩增，而用于制备已克隆于其他质粒上的DNA片段的单链拷贝。第一节克隆载体丝状噬菌体比其它载体优越的地方：单链DNA噬菌体的复制，是以双链环形DNA为中间媒介这种复制形式（RF)可以如质粒DNA一样在体外进行操作。RF和ssDNA都能够转染感受态的大肠杆菌寄主细胞，并依据所采用的实验方法而定，或产生出噬菌斑，或形成浸染的菌落。单链DNA噬菌体颗粒的大小是受其DNA多寡制约的。因此对它们来说，并不存在包装限制问题。应用这类单链DNA噬菌体，可以容易地检测出外源DNA的插入方向。可产生大量纯化的含外源DNA片段的单链DNA分子。第一节克隆载体第一节克隆载体M13噬菌体载体以野生型M13噬菌体为原始载体，进行以下改造：在IS区加入选择性标记基因，组装合适的多克隆位点第一节克隆载体噬菌体展示载体

在丝状噬菌体颗粒一端的表面，存在3-5个拷贝的基因Ⅲ编码的蛋白质。这类蛋白质对于噬菌体颗粒的正确组装，及其对大肠杆菌雄性细胞F性须的吸附过程，均具有重要功能。当外源DNA插入在噬菌体的基因Ⅲ编码序列中时，在两者读码结构保持一致的情况下，就会产生出由克隆基因与基因Ⅲ联合编码的融合蛋白质。因此可利用此特性构建噬菌体展示载体。第一节克隆载体构建噬菌体展示文库的方法：将随机的多肽DNA弹夹插入在基因Ⅲ的编码序列中，使在噬菌体颗粒的表面展现出各种不同的蛋白质或多肽此即是通常所说的随机多肽文库。然后通过亲和层析处理，将所要分离的某种特定的目标噬菌体，例如展示具有抗体结合特性的多肽的噬菌体颗粒分离出来。经过如此多次的层析和增殖后，所得的噬菌体制剂便可用于进一步富集具有期望结合特性的目标噬菌体。第一节克隆载体第一节克隆载体三、噬菌体-质粒杂合载体第一节克隆载体（一）、黏粒(Cosmid)载体λ噬菌体载体克隆外源DNA的能力有限理论上虽可达23kb，但事实上较为有效的克隆范围仅为15kb左右。一般情况下可以满足一个完整基因及其两端的侧翼序列克隆的要求。但有的基因分子大小比正常预期的要大很多，有的可达35-40kb或更大。有时，还需要能够同时克隆两个连锁的基因。所以还需要更大的载体。第一节克隆载体1978年，Collins及B.Hohn等人发展出的柯斯质粒载体(cosmidvectors)可以满足这一要求。Cosmid：是英文cossite-carryingplasmid缩写而成的。其原意是指带有粘性末端位点（cos）的质粒。即一类由人工构建的含有λDNA的cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。又叫柯斯质粒。第一节克隆载体Cos位点：λ噬菌体线性双链DNA分子的两端，各有一条由12个核苷酸组成的彼此完全互补的5‘单链突出序列，即通常所说的粘性末端。注入到感染寄主细胞内的λ噬菌体的线性DNA分子，会迅速地通过粘性末端之间的互补作用，形成环形双链DNA分子。随后，在DNA连接酶的作用下，将相邻的5‘-P,3’-OH连接起来。并进一步超盘旋化。这种由粘性末端结合形成的双链区段称为cos位点。第一节克隆载体柯斯质粒λDNA片段和pBR322质粒DNA联合组成的。用λ噬菌体基因组之cro-rⅡ

的Bg1Ⅱ

限制片段，取代pBR322质粒DNA的位于1459-1666bp之间的Sau3A片段，产生出具有BglⅡ

单切割位点的重组体分子，然后通过这个位点，将带有cos序列，长度为1.78kb的λDNA之BglⅡ片段插入进去，于是得到了pHC79柯斯质粒。第一节克隆载体第一节克隆载体1.柯斯质粒的特点除了cos位点外，在其两侧还具有与噬菌体包装有关的DNA序列，而质粒DNA部分则是一个完整的复制子，编码一个复制位点和两个抗菌素抗性基因ampr,tetr.因而具有两个载体的优点。第一节克隆载体(１)具有λ噬菌体的特性。柯斯质粒载体在克隆了合适长度的外源DNA，并在体外被包装成噬菌体颗粒之后，可以高效地转导对λ噬菌体敏感的大肠杆菌寄主细胞。然后便按照噬菌体同样的方式环化。由于不具有噬菌体的全部必要基因，因而不能通过溶菌周期，无法形成子代噬菌体颗粒。第一节克隆载体(２)具有质粒载体的特性。

柯斯质粒具有质粒的复制子，因此在寄主细胞内能够像质粒DNA一样复制，并且在氯霉素作用下，同样也会获得进一步的扩增。且具有抗菌素标记，可供作重组体分子表型选择，有的还带有插入位点。(３)具有高容量的克隆能力。由于其载体分子仅具有一个复制起点，一两个选择标记和Cos位点等三个组成部分，其分子量较少，一般只有5-7kb左右。其克隆极限可达45kb，比噬菌体和质粒载体的最大克隆能力都要大很多。由于包装限制的缘故，柯斯质粒载体的克隆能力还有一个最低极限制值。如果载体分子为5Kb,那么插入片段最少得有30kb长。才能够装形成具有感染能力的噬菌体颗粒。因此柯斯质粒载体用于克隆大片段的DNA分子。第一节克隆载体(４)具有与同源序列的质粒进行重组的能力。一旦柯斯载体与一种带有同源序列的质粒载体共存于同一个寄主细胞，它们之间便会形成共合体。如果让柯斯质粒与质粒各自具有一个互不相同的抗药性标记及相容性的复制起点，那么当它们转化到同一寄主细胞之后，便可容易地筛选出含有两个不同选择标记的共合体分子。第一节克隆载体2、柯斯克隆

应用柯斯质粒载体，在大肠杆菌细胞中克隆大片段的真核基因组DNA的技术，叫做柯斯克隆。理论依据:

在线性λ噬菌体DNA分子的每一端，都具有一段彼此互补的单链突出序列，即所谓的粘性末端，在λ噬菌体的正常生命周期中，会产生出由数百个λ噬菌体DNA分子拷贝组成的多连体分子。在此分子中，前后两个基因组之间都是通过cos位点连接起来的。λ噬菌体具有的一种位点特异的切割体系，叫做末端酶或Ter体系能识别两个相距适宜的cos位点，将多连体分子切割成λ单位长度的片段，并将它们包装到λ噬菌体头部中去，因此，对于λ噬菌体DNA的包装作用，cos位点和Ter体系是两项必须具备的条件。第一节克隆载体λDNA分子具有两个cos位点，而且它们之间的距离保持在38-54kb的条件下，Ter体系才能对它们发生作用。柯斯质粒是不能作为体外包装的底物的。因为它的基因组只具有一个cos位点。如果用适当的内切酶处理柯斯质粒所形成的片段仍不能被包装。因为尽管经过退火的片段可互相连接成具有两个cos位点的二聚体，但由于它们之间相距太近，只有几个kb,因此Ter体系还是对它不能发生作用。第一节克隆载体

只有将经过限制酶切割之后的柯斯质粒线性分子同外源真核生物基因组同样的酶切片段混合，并退火，由此形成的重组体DNA分子群体中，便会有一部分是具有两个Cos位点的线性二聚体。在这两个cos位点之间由于插入了足够长度的外源DNA，它们的距离已符合于ter体系的要求。由于包装限制问题，只有当柯斯质粒含有适当数量的外源DNA分子插入的情况下，才会发生包装作用。第一节克隆载体柯斯克隆的一般过程：外源基因组的消化柯斯质粒的线性化及与外源DNA分子进行体外连接反应。包装第一节克隆载体第一节克隆载体3、柯斯克隆的技术的优点主要有两个方面：第一由于柯斯载体兼具了质粒和λ噬菌体两方面的特性提高了克隆外源DNA片段的能力，可达45kb左右，因此对于构建真核生物基因文库是种特别有用的克隆载体。第二应用柯斯质粒作克隆载体，所形成的非重组体的克隆本底比较低，即便不使用插入失活或碱性磷酸酶对线性化的柯斯质粒DNA作预处理，其结果亦是如此。从而提高了筛选具外源DNA的重组体质粒的几率。第一节克隆载体（二）噬菌粒载体第一节克隆载体

问题的提出

M13可方便地用来制备克隆基因的单链DNA。所以在基因工程研究中很有用。但插入的片段遗传稳定性下降，且随片段分子量的增加，其稳定性降低的程度也越严重。所以其克隆外源DNA的实际能力十分有限，一般情况下，最大克隆能力只有1500bp.使其中真核基因克隆中的实用价值大大折扣。为了解决此问题，已经发展出一类由质粒载体和单链噬菌体载体结合而成的新型的载体系列，称为噬菌粒(phasmid)。第一节克隆载体

噬菌粒载体的特点噬菌粒载体的分子量一般都比M13载体的小，约为3000bp，易于体外操作，可得到长达10kb的外源DNA的单链序列。由于具有质粒的复制起点，又具有噬菌体的复制起点因此在大肠杆菌寄主细胞中，可以按正常的双链质粒分子形式复制，形成的双链DNA既稳定又高产。具有常规的质粒特性。当存在着辅助噬菌体的情况下，在噬菌体基因Ⅱ

蛋白质的影响下，噬菌粒的复制方式发生改变，又可如同M13载体一样按滚环模型复制产生单链的DNA，并在包装噬菌体颗粒之后被挤压出寄主细胞。应用噬菌粒可直接进行克隆DNA片段的序列测定，免去了从质粒载体到噬菌体的亚克隆步聚。第一节克隆载体

与M13相比，噬菌粒载体具有分子量小、克隆能力大能稳定遗传以及可用来制备单链或双链DNA等诸多优点。第一节克隆载体pUC118,pUC119噬菌粒载体

是一对分别由pUC18,pUC19质粒与野生型M13噬菌体的基因间隔区重组而成的噬菌粒载体。除了多克隆位点区的序列取向彼此相反而外，两者的分子结构完全一样。如果有某一种特定的外源基因被插入在这一对噬菌体多克隆位点区的同一种限制位点上，那么所形成的重组载体中的一个将转录克隆基因的正链DNA,而另一重组载体则转录克隆基因的负链。第一节克隆载体第一节克隆载体四、人工染色体载体第一节克隆载体染色体结构真核生物的染色体在形态上具有共同的特征：线状、中间有着丝粒把染色体分成两臂，两臂末端各有一个端粒，在染色体上有数目不等的复制起始点。着丝粒、端粒和复制起始点是真核生物染色体的三个最基本的组成元件。着丝粒DNA称CENDNA复制起始点DNA为自主复制序列(ARS)第一节克隆载体人工染色体克隆载体实际上是一种穿