医学微生物学实验指导

医学微生物学

实验指导

潍坊医学院病原生物学教研室

二00六年九月

医学微生物学实验指导

主编：岳启安

副主编：吴晓燕赵淑梅金光香马麦生

编者：（按编写先后顺序）

岳启安吴晓燕王红艳赵淑梅金光香马麦生宫英

实验须知

一、实验的目的及要求

1.验证和巩固课堂上所学的理论知识。

2.实验前做好预习，明确实验目的和内容。

3.学习和掌握微生物学的基本操作技术，为学习临床课程与防治疾病打下基础。

4.培养严谨求实的科学态度，独立分析问题和解决问题的能力。

5.微生物学的实验对象为肉眼看不见的病原微生物，因此，必须进行严格无菌操作，以免造成人为

传染。

二、实验室规则

1.进入实验室要穿工作服，非必要的衣物书籍请勿带入。

2.实验室保持安静，禁止饮食、吸烟和随地吐痰，保持清洁卫生。

3.用过的带菌材料、器材（吸管、试管、玻片等）应放在指定的消毒缸内，如遇材料破损或物品被污

染，应立即报告老师进行处理。

4.注意安全，实验用酒精灯不可互相对点，火焰不可靠近易燃物如酒精、二甲苯等。

5.爱护国家财产，节约实验用品，损坏器材应主动报告登记。

6.实验完毕，应清洁桌面，进行湿性打扫室内卫生，用消毒水或肥皂洗手，检查水、电源，门窗关

好后方可离开。

目录

实验一细菌的形态学........................................................................1

一、油镜的原理和使用方法.................................................................1

二、细菌的基本形态和结构.................................................................I

三、革兰染色法...........................................................................2

实验二细菌的生理..........................................................................4

一、细菌培养基的制备.....................................................................4

二、细菌培养法与生长现象观察............................................................5

三、细菌在自然界及正常人体的分布........................................................8

四、细菌的生化鉴定.......................................................................9

实验三外界因素对细菌的影响..............................................................13

一、消毒与灭菌..........................................................................13

二、噬菌体...............................................................................15

实验四细菌的遗传变异....................................................................17

一、细菌的鞭毛变异......................................................................17

二、细菌的耐药性变异....................................................................17

三、细菌的L型变异......................................................................17

四、R质粒接合传递试验...................................................................18

实验五细菌的致病性.......................................................................19

一、透明质酸酶试验......................................................................19

二、荚膜的致病作用......................................................................19

三、细菌外毒素的毒性作用................................................................19

四、细菌内毒素的致热作用................................................................20

实验六机体的天然抵抗力..................................................................21

一、吞噬细胞的吞噬作用..................................................................21

二、溶菌酶试验..........................................................................21

实验七细菌质粒DNA的提取.................................................................23

实验八化脓性球菌.....................................................................25

一、球菌的形态观察......................................................................25

二、球菌的菌落观察......................................................................25

三、凝固酶试验..........................................................................25

四、细菌的触酶试验......................................................................26

五、细菌耐热核酸酶试验..................................................................26

六、抗链球菌溶血素0试验（简称抗0试验）...............................................26

七、胆汁（胆盐）溶菌试验................................................................27

八、脓汁中病原球菌的检查程序...........................................................27

实验九肠道杆菌...........................................................................29

一、常用肠道杆菌鉴别培养基及主要生化反应培养基.........................................29

二、肥达试验与外斐反应..................................................................30

三、病原性肠道杆菌的分离与鉴定方法.....................................................32

实验十弧菌..............................................................................34

一、霍乱弧菌的形态观察..................................................................34

二、霍乱弧菌的分离程序..................................................................34

三、霍乱弧菌的快速诊断..................................................................34

实验十一厌氧芽胞梭菌.....................................................................36

一、厌氧培养法..........................................................................36

二、破伤风梭菌、产气荚膜梭菌和肉毒梭菌的形态及培养特性.................................36

三、产气荚膜梭菌在牛乳培养基中的“汹涌发酵”现象.......................................36

实验十二棒状杆菌.........................................................................38

一、白喉棒状杆菌的形态与染色...........................................................38

二、白喉棒状杆菌的培养特性..............................................................38

三、白喉棒状杆菌的毒力试验..............................................................38

实验十三分枝杆菌.........................................................................40

一、结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌形态观察.................................................40

二、结核分枝杆菌的培养特性观察.........................................................40

三、结核病人痰标本的检查................................................................40

四、结核分枝杆菌毒力试验................................................................41

实验十四支原体...........................................................................43

一、支原体形态观察......................................................................43

二、支原体在培养基上生长的菌落观察.....................................................43

实验十五立克次体.........................................................................44

一、立克次体形态观察....................................................................44

二、立克次体染色方法....................................................................44

三、血清学诊断：外斐反应................................................................44

实验十六衣原体...........................................................................46

一、衣原体包涵体的形态观察.............................................................46

实验十七螺旋体..........................................................................47

一、螺旋体的形态观察....................................................................47

二、钩端螺旋体的活体标本检查一暗视野显微镜检查法.......................................47

三、钩端螺旋体的显微镜凝集试验一凝集溶解试验...........................................47

四、口腔螺旋体检查......................................................................48

实验十八真菌..............................................................................49

一、真菌的基本形态与菌落观察...........................................................49

二、浅部真菌的临床标本检查.............................................................49

三、深部真菌的临床标本检查.............................................................50

四、真菌的培养..........................................................................50

五、真菌毒素的检测......................................................................50

实验十九病毒的形态及分离培养技术.........................................................52

一、病毒电镜照片观察....................................................................52

二、病毒包涵体观察......................................................................52

三、病毒动物接种法......................................................................52

四、病毒鸡胚接种法......................................................................53

五、病毒的组织培养法....................................................................54

实验二十病毒的血清学试验.................................................................56

一、病毒血凝效价滴定....................................................................56

二、病毒血凝抑制试验....................................................................57

三、病毒中和试验........................................................................57

实验一细菌的形态学

内容

1.油镜的原理和使用方法

2.细菌的基本形态和结构

3.革兰染色法

一、油镜的原理和使用方法

1.显微镜油镜的原理：

细菌体积微小，放大1000倍以上才能看清楚。由于油镜镜片直径小，又因介质（从载玻片至空气再进

入油镜）密度不同，有些光线因折射就不能进入透镜（图la）,致使射入的光线较少，物象显现不清。若在

透镜与载玻片中间加上和玻片折光率（n=l.52）相仿的香柏油（n=L512）则不使透过的光线有所损失（图

1b）,进入透镜的光线量多，视野的高度也就增大了，故物象清楚。

2.油镜的使用方法：

（1）尽量升高聚光器，放大光圈，调节反光镜，使射入镜筒的光线最强。

（2）标本片的待检部位滴加镜油一滴，将标本片放在载物台上固定，将待检部位移置于物镜下。先用

低倍镜找到适宜的视野，然后再换油镜检查。

（3）从侧面注视油镜头，然后将载物台缓缓上移，使油镜浸入油滴内，接近玻片表面。

（4）从目镜边看边转动粗调节器，使载物今慢慢向上移动（以免压碎标本和损伤镜头），直至看到模糊

物象时，再改用细调节器转动到物象清晰为止。

（5）油镜用完后，须用擦镜纸将油镜头的镜油拭净.

注意：油镜头的标志为100X；高倍镜为45X；低倍镜为10X。

二、细菌的基本形态和结构

（•）细菌的基本形态（革兰染色法）

1.球菌：葡萄球菌、链球菌、肺炎球菌。

2.杆菌：大肠杆菌、枯草杆菌。

1

3.螺形菌：霍乱弧菌。

（-）细菌的结构（特除染色法）

1.细胞壁：枯草杆菌。

2.核质：炭疽杆菌。

3.荚膜：肺炎球菌。

4.鞭毛：伤寒杆菌。

5.芽胞：破伤风梭菌。

（三）细菌动力检查：悬滴法

材料：

1.菌种：水弧菌幼龄肉汤培养物。

2.凹玻片、盖片、接种环、凡士林等。

方法：

1,取洁净凹玻片一张，在凹的四周涂抹凡士林少许。

2.用取菌环取水弧菌幼龄肉汤培养物滴，置于盖玻片中央。

3.将凹玻片反转，使凹窝对准盖片中央，复于其上，粘住盖片后再反转（见图2）。

4.先用相差显微镜低倍镜找到悬滴边缘后，再换用高倍镜观察。

图2悬滴法

三、革兰染色法

（-）细菌涂片标本制作法

材料：

1.葡萄球菌、大肠杆菌琼脂平板培养物。

2.其它：生理盐水、玻片、玻璃铅笔、接种环、酒精灯等。

方法：

1.涂片：取清洁玻片一张，分别用玻璃铅笔在背面划出二个涂片范围，并用数字或简单符号标记，

然后各加一小滴生理盐水。

将接种环在酒精灯火焰上烧灼灭菌，冷却后从细菌琼脂平板培养物沾取少量细菌，放在盐水滴旁轻轻

涂抹，然后与全滴盐水混合，使成为均匀悬液。将接种环在火焰灭菌后放下。

2.干燥：制成的涂片可使其自然干燥，亦可放在火焰高处缓慢烘干。

3.固定：将干燥后的涂片在酒精灯上通过火焰三次，达到固定杀死细菌，并使细菌粘着于玻片上，

2

以免染色时脱落；固定又可使细菌蛋白凝固，而易于着色。

（二）革兰染色法

原理：革兰染色的原理至今尚未完全明了，但可能与以下几方面因素有关：（1）革兰阳性菌等电点

（pH2〜3）比阴性菌（pH4〜5）为低，在同样的染色环境中，阳性菌所带阴电荷较阴性菌多，因之与碱性染

料结合力较强。（2）媒染剂中的碘进入菌体后与染料结合，生成一种复合物，并和阳性菌体内的核糖核酸

镁盐结合，使已着色的细菌不易脱色。（3）脱色剂酒精容易透入阴性菌体内，溶解染料和碘的复合物，使

细菌脱色。阳性菌结合的染料较多且牢固，酒精又不易透过细胞壁，故不易脱色。

材料：

1.已制备好的涂片。

2.革兰染液：结晶紫染液、碘液、95%酒精、稀释复红染液。

方法：

1.加结晶紫于细菌涂片标本上，染一分钟，水冲洗。

2.加碘液，二分钟后水冲洗。

3.用95%酒精脱色，至无紫色液流下为止，约30秒钟，水冲洗。

4.加稀释复红液，染一分钟水冲洗。

5.干燥后，用油镜检查，革兰阳性菌呈现紫色，革兰阴性菌呈红色。

其染色步骤如下：

水冲洗水冲洗水冲洗水冲洗

涂片f固定一结晶紫-----•■碘液----1"酒精脱色-----•■复红----•■干后镜检

（一分钟）（二分钟）（半分钟）（一分钟）

附：革兰染色液的配制法

1.结晶紫溶液

（1）结晶紫酒精饱和溶液（2克结晶紫溶于20毫升95%的酒精内）20毫升。

（2）1%草酸镀水溶液80毫升。

2.卢戈氏碘溶液

（1）碘片1克。

（2）碘化钾2克。

（3）蒸储水300毫升。

先将碘片与碘化钾置玻璃瓶中，加少量蒸锵水震摇，使碘片溶化，然后加入蒸储水混匀备用。

3.脱色剂：95%酒精。

4.石炭酸复红稀释液

（1）碱性复红酒精饱和液（复红10克加入100毫升95%酒精）10毫升。

（2）5%石炭酸水溶液100毫升。

二液混合后即为石炭酸碱性复红液，用蒸镭水稀释成1：10（10毫升染液加90毫升蒸储水）即成为石

炭酸复红稀释液。

实验报告

1.绘图记录细菌的基本形态与特殊结构。

2.革兰染色的原理和意义是什么？

3

实验二细菌的生理

内容

1.细菌培养基的制备

2.细菌培养法与生长现象观察

3.细菌在自然界及正常人体的分布

4.细菌的代谢产物

一、细菌培养基的制备

(一)培养基的制备原则及程序

人工配制成的适合细菌生长繁殖的营养环境称为培养基。根据各种细菌生长繁殖时所需条件的不同，

培养基可分为很多种类。

培养基的制备程序可分：配料一溶化一测定及矫正pH一过滤一分装~灭菌备用。

(二)常用培养基的制备及用途

1.肉膏汤培养基

成分：牛肉膏0.3克

蛋白膝1克

氯化钠0.5克

蒸储水100毫升

(1)用天平分别称取牛肉膏0.3克，蛋白腺1克，氯化钠0.5克置三角烧瓶中。

(2)加入蒸储水100毫升，把三角烧瓶用酒精灯或电炉加热，使蛋白豚等溶解。

⑶测定培养基的酸碱度。用1N的NaOH调整pH至7.6(可用pH试纸测定)。必要时用滤纸过滤。

(4)分装试管或烧瓶，塞上棉塞，用玻璃纸包扎管口、瓶口。

(5)高压蒸气灭菌103.42千帕20分钟取出冷却后冰箱贮存备用。

用途：

肉膏汤培养基可供一般细菌生长。

2.普通琼脂培养基

成分：肉膏汤培养基100毫升

琼脂2〜3克

制法：

(1)将琼脂加入肉汤中。

(2)高压蒸气灭菌压力103.42千帕，温度121.3C,维持15〜20分钟。

(3)取出在酒精灯下按无菌手续分装于无菌试管中，每管约5毫升，斜放使其凝成斜面培养基。

(4)无菌操作将已溶化的肉膏汤琼脂注于无菌平血中，厚度约3〜4毫米。凝固后即反转过来，底向

上，以免在平皿盖上积存凝结水，即为普通琼脂培养基(亦称固体培养基)，冷却后置冰箱保存备用。

用途：

普通琼脂培养基用于一般细菌的分离培养，纯种接种或保存菌种。

3.血液琼脂培养基

成分：普通琼脂培养基100毫升

脱纤维绵羊血或兔血5〜10毫升

制法：

(1)取已制备好的无菌普通琼脂培养基100毫升，加热溶解并冷至50℃。

4

(2)在已消毒的无菌室内打开瓶口，瓶口通过火焰以杀灭瓶外的杂菌，用无菌吸管吸取5〜10毫升血

液，加入100毫升普通琼脂培养基内，轻轻摇匀。

(3)在无菌条件下，倾注于无菌平皿中，冷凝后即成血琼脂平板培养基。凝固后即反转过来，底向上,

置冰箱保存备用。

用途：

血液琼脂培养基可用来培养对营养要求较高的细菌，如链球菌、肺炎球菌等。

4.半固体培养基

成分：

肉膏汤培养基100毫升

琼脂0.5~1克

制法：

(1)将0.5〜1克琼脂加到100毫升肉膏汤中，加热溶化，调整PH至7.6

(2)分装于小试管中，每管约2〜3毫升，加棉塞。

(3)高压蒸气灭菌(压力103.42千帕，温度121.3℃,维持20分钟)。

(4)冷却后冰箱保存备用。

用途：

半固体培养基用于保存菌种或观察细菌的动力。

二、细菌培养法与生长现象观察

(一)细菌的分离培养法

细菌在自然界分布广、种类多，在多种被检材料中，如粪便、痰、脓、水及牛乳等常混杂有多种细菌。

如欲专门研究其中一种细菌，或检查病人标本中是否存在有某种病原菌时，需先将细菌在固体培养基上做

分离培养，以获得由一个细菌生长繁殖而生成的单个菌落，再取单个菌落作纯种细菌的培养，然后进一步

观察和研究其生物学特性。最常用的细菌分离法是琼脂平板划线分离法。

1.平板划线法

平板划线法要求借划线而将混杂的细菌在琼脂平板表面分离开，使单个细菌能固定在一点，生长繁殖

后形成单个细菌菌落，以达到分离纯种的目的。

材料：

(1)菌种：葡萄球菌和大肠杆菌的混合液。

(2)培养基：普通琼脂平板。

(3)接种环、酒精灯，试管架等。

接种方法：

(1)右手持接种环在火焰上烧灼灭菌、待冷后，取一接种环混合菌液。

(2)左手持平板培养基，靠近火焰，左拇指打开平板盖约3〜4厘米，右手持接种环在平板的上端涂

开并密集来回划线，划线约占平板面积的1/4。注意，划线时接种环与平板面成约30度角，以腕力在平板

表面行轻而快的来回滑动，接种环不应嵌进培养基内。

(3)烧灼接种环，以杀灭环上的细菌，转换平板约70度，用冷却后的接种环通过第一次划线区继续

进行第二区的平行划线以占平板面积的1/4为止(见图3)。

(4)重复第3步，划出第三、四区。

(5)划线完毕，将接种环烧灼灭菌，将培养基盖好后倒放(盖在下，底在上)。

用玻璃铅笔注明接种菌名，接种者姓名、班级、组、II期，放37℃温箱培养。

5

1

分区划线法分离培养生长状态

图3平板培养基分离培养法

2.斜血培养基接种法

斜面培养基一般不用作分离培养，仅使细菌繁殖作为保存菌种或观察其某些生化特性。

材料：

(1)菌种：大肠杆菌琼脂斜面18〜24小时培养物。

(2)培养基：琼脂斜面培养基。

(3)接种环、酒精灯、试管架。

接种方法：

(1)先用笔在试管上端表明接种菌名、日期。

(2)左手拇指和食指、中指及无名指握持菌种和待接种的培养基管，使菌种管位左，培养基管位右，

斜面部均向上。

(3)以右手持接种环烧灼灭菌，待冷。

(4)以右手手掌与小指、小指与无名指分别拔起并挟持两管棉塞，将两管口迅速通过火焰灭菌。

(5)将已冷却的接种环伸入菌种管内，从斜面上轻轻挑取少许细菌退出菌种管，再伸进待接种的培养

基管底的凝结水中并从管底部向上在斜面上划一直线，然后再从底部向上连续蜿蜒划线(如图4),也可以

不划直线只蜿蜒划线。

(6)管口通过火焰再度灭菌，塞好棉塞。接种环烧灼灭菌后放下。

(7)斜面接种后放37℃温箱中培养.

3.液体培养基接种法

凡是肉膏汤、葡萄糖、蛋白陈水以及各种单糖发酵管等液体培养基都用此方法接种。

接种液体培养基主要用于纯种细菌的增殖培养，也可观察到细菌的不同生长情况。有的呈均匀混浊,

有的呈沉淀生长，有的表面形成菌膜，另外还可以供测定细菌生长特性使用。

图4斜面培养基接种法

6

材料：

(1)菌种：生长在平板上的单个菌落。

(2)培养基：牛肉汤。

(3)酒精灯、接种环、试管架等.

接种方法：

操作方法与斜面培养基相同，但要使液体培养基向右侧倾斜45度角，接种环在接近液面管壁上轻轻

研磨，并沾取少量肉汤调合，使菌混合于肉汤中(见图5)。接种后放入37℃温箱中培养，18〜24小时后观

察生长情况。

图5液体培养基接种法

4.半固体培养基接种法(穿刺接种法)

此法主要用于保存菌种，观察细菌的运动力，以及某些细菌的生化特性等。

材料：

(1)菌种：大肠杆菌和痢疾杆菌琼脂斜面18—24小时培养物。

(2)培养基：半固体琼脂培养基•

(3)接种针、酒精灯、试管架等。

接种方法：

(1)作好标记。

(2)左手握持菌种管和待接种的半固体培养基。

(3)右手持接种针，灭菌冷却后，以针挑取菌落，垂直刺入半固体琼脂培养基的中心，可刺达近管底

约3〜5亳米，但不必刺至管底，然后循原路退出，注意刺入及退出时不可晃动接种针(如图6)。

(4)接种完毕，将接种针重新灭菌后放试管架上，塞好棉塞，37℃孵育18〜24小时后取出观察结果.

7

(-)细菌在培养基上的生长现象

1.观察细菌在普通平板与血平板上单个菌落特征，并注意下列几点：

(1)菌落直径大小：小于2毫米者为小菌落；在2〜4毫米之间者为中等菌落；在4毫米以上者为大

菌落。

(2)形状：圆形或不规则。

(3)透明度：要对光观察，分为透明、半透明或不透明。

(4)表面：光滑、粗糙、湿润、有光泽、干燥、凸起、凹下、平坦等。

(5)边缘：整齐、不整齐(波浪状、锯齿状、毛发状)。

(6)颜色：有无特殊颜色，无特殊颜色者一般呈灰色或无色。

(7)溶血性：有无溶血环，是完全溶血，还是不完全溶血。

2.观察细菌在肉汤中的生长状态

观察时注意细菌是否在液体表面形成菌膜，菌膜的特征；培养基是否变混浊，混浊度；生长是否形成

沉淀，沉淀的性质是絮状、颗粒状或其它。

3.观察细菌在半固体培养基中的生长状态

无鞭毛的细菌沿穿刺线生长，穿刺线呈白色，培养基的其余部分透明。有鞭毛的细菌有运动力、呈弥

散生长，使培养基整个变为混浊，穿刺线往往不明显。

三、细菌在自然界及正常人体的分布

细菌在自然界及正常人体分布极广、种类繁多。本实验的目的在于了解细菌的分布，进一步加深对消

毒、灭菌与无菌操作重要性的认识。

(-)空气中细菌的检查

材料：普通琼脂平板。

方法：普通琼脂平板打开盖暴露在实验室空气中，10分钟后盖上盖，置37℃温箱培养18〜24小时后,

观察结果。

(-)泥土中细菌的检查

材料：泥土1克(取离地面10〜20厘米土层中泥土)，无菌生理盐水，庖肉培养基、无菌滴管、普通

琼脂平板等。

方法：将泥土置于无菌试管中，加10毫升无菌生理盐水混匀，用滴管吸1〜2滴加入普通琼脂平板，

然后用接种环以划线分离法划开。上述试管置酒精灯火焰上，加热100℃5分钟，取0.5毫升悬液加入庖

肉培养基中。将接种好的庖肉培养基和普通琼脂平板放37℃温箱培养24小时后观察结果。

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（三）水中细菌的检查

材料：

1.池水和自来水。

2.普通琼脂平板两个。

3.无菌试管、无菌滴管等。

方法：

1.用酒精灯烧灼自来水管口约1分钟，然后开龙头放水约2分钟，无菌试管取自来水2毫升。

2.用无菌滴管取自来水滴于普通平板上约2滴，然后以接种环用划线法划开。

3.再用另一只无菌滴管取池水于另一普通琼脂平板上约2滴，同样用接种环划线分开。

4.把上述接种好的培养基放37℃温箱培养24小时后观察结果。

（四）皮肤上细菌的检查

材料：

普通平板、玻璃铅笔。

方法：

将普通平板用玻璃铅笔分成4〜6份，在酒精灯火焰旁每个同学在平板的相应位置用手指涂摸数次（或

轻按手指仅留下指纹）。然后盖好盖，置37℃温箱培养18〜24小时观察结果。

（五）咽喉部细菌的检查

材料：

血平板、压舌板、无菌棉拭子等。

方法：

用无菌棉拭子从正常人咽喉部取材，无菌操作涂于血平板上，灭菌的接种环划线分离，置37℃温箱

培养18〜24小时观察结果。

（六）齿垢中细菌的检查

材料：

载玻片、无菌牙签、生理盐水、酒精灯、革兰染液等。

方法：

1.取洁净载玻片一张，加生理盐水1滴。

2.用无菌牙签挑取自己的牙垢少许与载玻片上的生理盐水混匀后涂开。

3.干燥、固定。

4.革兰染色，油镜观察。

四、细菌的生化鉴定

由于各种细菌具有独特的的酶系统，对营养物质的利用能力不同，因而在代谢过程中合成及分解产物

也不同，应用生物化学方法检测细菌的代谢产物，有助于细菌种属的鉴定。细菌的生化试验是鉴别细菌的

重要依据之一。

（-）糖发酵试验

原理：

不同的细菌具有不同的酶系统，分解糖的能力各异，其产生的分解产物亦不同，借此可鉴别细菌的种

类。

材料:

1.菌种：大肠埃希菌、伤寒沙门菌、副伤寒沙门菌、痢疾杆菌。

2.培养基：单糖发酵管（葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖）。

方法：

1.取葡、乳、麦、甘、蔗五个单糖发酵管。

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2.将接种针烧灼冷却后，分别挑取大肠埃希菌、伤寒沙门菌、副伤寒沙门菌、痢疾杆菌培养物接种

单糖发酵管。

3.单糖发酵管放37℃温箱中孵育24小时。

4.观察结果：首先要观察细菌是否生长，细菌生长后培养基变混浊，如发酵糖类产酸则使培养基中

指示剂（溪甲酚紫）由紫色变为黄色，如发酵糖类既产酸又产气，则培养基除变黄色外，在发酵管内有气泡

产生，如不发酵则培养基为原来的紫色。（附表1）。

意义：

单糖发酵试验常用于肠杆菌科细菌的鉴别。

表1单糖发酵试验结果

菌种葡萄糖乳糖麦芽糖甘露糖蔗糖

大肠埃希菌㊉㊉©©—

伤寒沙门菌+—++—

副伤寒沙门菌©—©©—

痢疾杆菌+—++—

注：产酸用“+”表示；产酸产气用“❷”表示；不发酵用“一”表示。

（二）靛基质试验

原理：

有些细菌具有色氨酸防，能分解蛋白陈水中的色氨酸生成靛基质（口引味），叫I噪本身无色不能直接观察,

加入对位二甲基氨基苯甲醛（叫跺试剂）后，相互作用而形成肉眼可见的红色化合物。

材料：

1.菌种：大肠杆菌、伤寒杆菌培养物。

2.蛋白陈水2支。

3.吧噪试剂。

方法：

1.分别接种大肠杆菌、伤寒杆菌于蛋白陈水试管中。

2.37℃孵育18〜24小时后取出，每管滴加2〜3滴口引味试剂于液面上，轻轻摇动试管，少等片刻，

呈玫瑰红色者为吧跺试验阳性，说明此菌能产生靛基质，呈黄色者为吧噪试验阴性，说明此菌不产生靛基

质。

意义：

用于判定大肠杆菌、变形杆菌、志贺菌、沙门菌。

（三）VP试验

原理：

某些细菌能分解葡萄糖，产生丙酮酸，并将丙酮酸脱竣变为中性的乙酰甲基甲醉。乙酰甲基甲醇在碱

性环境中被空气中氧气氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白陈水中精氨酸所含的胭基起作用，生成红色化合物，

为VP试验阳性。

材料：

1.菌种：大肠杆菌、产气杆菌培养物。

2.培养基：葡萄糖蛋白陈水。

3.40%K0H溶液（含0.3%的肌酸）、6%a一茶酚酒精溶液、毛细吸管等。

方法：

1.分别接种大肠杆菌和产气杆菌于2支2毫升葡萄糖蛋白陈水培养基中。

2.37℃孵育48小时后取出分别加入1毫升40%K0H和a一蔡酚溶液（加速反应），

摇匀，静置桌上，5〜15分钟内出现红色者，为阳性反应。大肠杆菌阴性，产气杆菌阳性。

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意义：

常与甲基红试验一起使用，可鉴别肠道杆菌科细菌。

（四）甲基红试验

原理：

某些细菌分解葡萄糖产生丙酮酸，并进一步将丙酮酸分解为甲酸、乙酸、乳酸等，使培养基的pH值

降至4.5以下，加入甲基红指示剂呈红色（甲基红变色范围：pH<4.4为红色，pH>6.2为黄色）。某些细

菌虽能分解葡萄糖，但产酸量少或产生的酸进一步被氧化成其他物质（如醇、醛、酮等），培养基pH为6.2

以上，加入甲基红指示剂呈黄色。大肠杆菌呈红色（阳性），产气杆菌呈黄色（阴性）。

材料：

1,菌种：大肠杆菌、产气杆菌18〜24小时培养物。

2.培养基：葡萄糖蛋白陈水。

3.甲基红试剂、毛细滴管等。

方法：

1.分别接种大肠杆菌、产气杆菌于2支葡萄糖蛋白陈水培养基中。

2.37℃孵育48小时后取出，分别滴加甲基红试剂2〜3滴，可立即观察。阳性者呈红色，阴性者呈

黄色。

意义：

用于肠杆菌科细菌鉴别。测定细菌能否利用枸椽酸盐作为碳的唯一来源，常用以鉴别肠道杆菌。

（五）枸椽酸盐利用试验

原理：

在枸椽酸盐培养基中，枸椽酸盐为唯一碳源，磷酸二氢钱为唯一氮源。某些细菌（如产气杆菌）可利用

枸檬酸盐为碳源，磷酸二氢钱为氮源，在此培养基中生长，分解枸檬酸盐产生的碳酸盐使培养基呈碱性。

指示剂溟麝香草酚蓝由绿色变为深蓝色。大肠杆菌不能利用，故不生长。

材料：

1.菌种：大肠杆菌、产气杆菌18〜24小时培养物。

2.培养基：枸檬酸盐培养基•

方法；

1.分别接种大肠杆菌、产气杆菌于枸椽酸盐培养基上。

2.37℃孵育24小时后观察。有菌苔出现，培养基变为深蓝色，为枸椽酸盐利用试验阳性。

意义：

用于鉴别肠杆菌科细菌。埃希菌属、志贺菌属、耶尔森菌属等为阴性。枸椽酸菌属、沙雷菌属、克雷

伯菌属为阳性。

（六）尿素试验

原理：

某些细菌（如变形杆菌）能产生尿素酶，分解尿素形成氨，使培养基呈碱性，指示剂酚红呈红色。

材料：

1.菌种：大肠杆菌、变形杆菌。

2.培养基：尿素培养基。

方法：

1.分别接种大肠杆菌、变形杆菌于尿素培养基中。

2.37c孵育18〜24小时观察，培养基呈红色为阳性反应.不变色者为阴性。

意义：

用于肠杆菌科鉴别。其中变形杆菌属、肺炎克雷伯菌属、结肠耶尔森菌为阳性。幽门螺杆菌尿素酶阳

性。

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（七）硫化氢试验

原理：

某些细菌能分解含硫氨基酸（如胱氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸）生成硫化氢，后者与培养基中的铅离

子或二价铁离子形成硫化铅或硫化亚铁黑色化合物。

材料：

1.菌种：大肠杆菌、变形杆菌。

2.培养基：克氏双糖铁琼脂培养基或醋酸铅培养基。

方法：

1.分别接种大肠杆菌、变形杆菌于克氏双糖铁琼脂培养基或醋酸铅培养基上。

2.37℃孵育24小时后观察。接种部位呈黑色者为阳性，不变色者为阴性。大肠杆菌阴性，变形杆

菌阳性。

意义：

用于肠杆菌科细菌鉴别，部分沙门菌、变形杆菌属等硫化氢试验阳性，部分沙门菌硫化氢试验阴性。

（八）细菌色素

原理：

某些细菌的代谢产物中有不同颜色的色素产生，这一点有利于这些细菌的鉴别。

材料：

1.菌种：葡萄球菌（金黄色、白色）、绿脓杆菌。

2.普通培养基。

方法：

1.将葡萄球菌，绿脓杆菌分别接种于普通培养基中。

2.37c孵育18〜24小时观察结果。葡萄球菌可产生脂溶性色素，只菌落有色。绿脓杆菌产生水溶

性色素，故菌落和培养基均有色。

意义：

常用于细菌类别的初步鉴定。

实验报告

1.记录细菌分布的实验结果。

2.细菌人工培养的实际意义是什么？

3.观察记录细菌代谢产物的实验结果。

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实验三外界因素对细菌的影响

内容

1.消毒与灭菌

2.噬菌体

一、消毒与灭菌

（-）常用灭菌器械的使用

1.高压蒸气灭菌器

构造：

高压蒸气灭菌器是一个双层的金属圆筒，两层之间盛水，外层坚厚，其上或前方有金属厚盖，盖旁附

有螺旋，借以紧闭盖门，水蒸气不能外溢。灭菌器内蒸气压力升高时，水的沸点相应增高，它们的关系如

表2。高压蒸汽灭菌器匕装有排气阀门、安全活塞，以调节器内蒸气。有温度计及压力表，以显示器内的

温度和压力。器内装有带孔的金属桶用以放置灭菌的物品。

表2不同蒸气压力所能达到的温度

压力（千帕）温度（℃）压力（千帕）温度（C）

34.47108.8137.90126.2

55.16113.0172.37130.4

68.95115.6206.84134.6

103.42121.3

用法：

加水至灭菌器内，放入要灭菌的物品，将器盖盖上，螺旋拧紧.使之密闭。加热至压力34.47千帕时,

打开排气阀放气，使器内冷空气全部排出，关闭排气阀，继续加热，待压力表渐升至所需压力数（视消毒

物品，一般为103.4千帕），减小炉火，维持20〜30分钟。灭菌时间到时，停止加热，待压力逐渐降至零

时，慢慢打开排气阀，放气减压（注意避免瓶内液体等外溢）。

高压蒸气灭菌器灭菌是最可靠的灭菌方法，凡耐热和耐潮湿的物品，如培养基、生理盐水、手术器材、

衣服、纱布、棉花、玻璃器材、传染性脏物及细菌的培养物等都可用本法消毒灭菌。

2.干热灭菌器（干烤箱）

构造：

干热灭菌器是山双层铁板制成的长方形金属箱，外壁内层装有隔热的石棉板，箱壁中装置电热线圈，

顶上有孔，可安插温度计。箱前有铁门及玻璃门，箱内金属板架数层，电热烤箱前F方有装有气温度调节

器，可以保持所需温度。

用法：

将培养皿、吸管、试管等玻璃器材包装好后，放入箱内闭门加热，温度上升至160℃〜170℃时，保持

2小时，停止加热。当温度降至40℃以下，方可开门取物，否则冷空气突然进入，易引起玻璃器材炸裂，

而且热空气外溢，往往会烫伤取物者的皮肤。

3.滤菌器

滤菌器是由孔径极小，能阻挡细菌通过的陶瓷、硅藻土、石棉或玻璃细沙等制成，种类较多，常用的

有下列几种。

（1）玻璃滤器：由玻璃制成，滤板用0.15〜250微米不等，分