第11讲基因工程-备战2023年高考生物核心考点讲练

专题五生物技术与工程第11讲基因表达载体的构建和PCR的应用【学习目标】1.结合基因表达载体的构建过程，学会如何在具体题目中选用合适的限制酶进行切割。通过分析基因编辑技术的原理和过程，了解此技术在社会实践中的应用。2.掌握PCR技术的原理和操作过程。结合新冠病毒核酸检测，了解PCR技术在生产、生活中的应用。【学习过程】探究点1限制酶的选取与基因表达载体的构建【情境引领】资料1：基因表达载体的构建微生物吸附是重金属废水的处理方法之一。金属硫蛋白(MT)是一类广泛存在于动植物中的金属结合蛋白，具有吸附重金属的作用。科研人员将枣树的MT基因导入大肠杆菌构建工程菌。资料2：基因编辑技术CRISPR/Cas9基因编辑技术能对基因进行定点编辑，其原理是由一条单链向导RNA(sgRNA)引导核酸内切酶Cas9到一个特定的基因位点进行切割(如图)。CRISPR复合体中sgRNA的主要功能是与靶向基因(目的基因)上特定碱基序列互补，从而定向引导Cas9蛋白与靶向基因结合，并在特定位点切割DNA。【教材追根】根据资料1，回答下列问题：1.根据枣树的MTcDNA的核苷酸序列设计了相应的引物(图1甲)，通过PCR扩增MT基因。已知A位点和B位点分别是起始密码子和终止密码子对应的基因位置。选用的引物组合应为__________。2.本实验中，PCR所用的DNA聚合酶扩增出的MT基因的末端为平末端。由于载体E只有能产生黏性末端的酶切位点，需借助中间载体P将MT基因接入载体E。载体P和载体E的酶切位点及相应的酶切序列如图1乙所示。①选用____________酶将载体P切开，再用__________(填“T4DNA”或“E.coliDNA”)连接酶将MT基因与载体P相连，构成重组载体P′。②载体P′不具有表达MT基因的____________和______________。选用____________酶组合对载体P′和载体E进行酶切，将切下的MT基因和载体E用DNA连接酶进行连接，将得到的混合物导入到用________离子处理的大肠杆菌，筛出MT工程菌。根据资料2，回答下列问题：3.从功能上来看，CRISPR/Cas9系统相当于基因工程中的限制酶，该系统广泛存在于细菌中，可推测其在细菌中的作用是_________________________。4.若用CRISPR/Cas9基因编辑技术培育转基因生物，与传统的基因工程相比，其明显优点是______________________________。5.CRISPR/Cas9基因编辑技术有时存在编辑对象出错而造成“脱靶”，sgRNA的识别序列越短，基因编辑的脱靶率越高。请分析原因。6.通过上述材料，你认为CRISPR/Cas9基因编辑技术在哪些方面有广阔的应用前景。【评价检测】1.(单选)自然界中很少出现蓝色的花，天然蓝色花产生的主要原因是花瓣细胞液泡中花青素在碱性条件下显蓝色。我国科学家利用链霉菌的靛蓝合成酶基因(idgS)及其激活基因(sfp)构建基因表达载体(如图)，通过农杆菌转化法导入白玫瑰中，在细胞质基质中形成稳定显色的靛蓝。图中PmeⅠ、BamHⅠ、SpeⅠ、SacⅠ为不同的限制酶。错误的是B.将sfp基因插入Ti质粒时使用的限制酶是PmeⅠ和BamHⅠC.sfp和idgS基因具有各自的启动子，表达是相互独立进行的D.农杆菌可将Ti质粒上的T­DNA整合到白玫瑰染色体DNA上2.(不定项)为了获得抗蚜虫棉花新品种，研究人员将雪花莲凝集素基因(GNA)和尾穗苋凝集素基因(ACA)与载体(pBⅠ121)结合，然后导入棉花细胞。正确的是A.用限制酶BsaBⅠ和DNA连接酶处理两种基因可获得GNA­ACA融合基因B.与只用KpnⅠ相比，KpnⅠ和XhoⅠ处理融合基因和载体可保证基因转录方向正确探究点2PCR的应用【情境引领】资料1:实时荧光PCR新型冠状病毒感染的常规检测方法是通过实时荧光PCR鉴定。实时荧光PCR扩增目的基因，需额外添加荧光标记探针(一小段单链DNA，可与目的基因中部序列特异性结合)。当探针完整时，不产生荧光。在PCR过程中，与目的基因结合的探针被TaqDNA聚合酶水解，R与Q分离后，R发出的荧光可被检测到(如图甲)，通过实时荧光PCR检测新型冠状病毒感染时，检测到的荧光强度变化如图乙。资料2：重叠延伸PCR重叠延伸PCR技术是一项重要的基因定点突变技术，其主要设计思路是用具有互补配对片段的引物(图中的引物2和3，突起处代表与模板链不能互补的突变位点)，分别进行PCR，获得有重叠链的两种DNA片段，再在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸获得想要的目的基因。水蛭素是一种蛋白质，可用于预防和治疗血栓。某科研团队运用重叠延伸PCR技术在水蛭素基因中的特定位点引入特定突变，使水蛭素第47位的天冬酰胺(密码子为AAC、AAU)替换为赖氨酸(密码子为AAA、AAG)，从而提高水蛭素的抗凝血活性。原理见图。资料3：RT-PCR(逆转录PCR)RT－PCR是将mRNA逆转录(RT)和cDNA的聚合酶链式反应相结合的技术，具体过程如图所示：【教材追根】根据资料1，回答下列问题：1.与指数增长期相比，线性增长期目的基因数量的增长率下降，可能的原因是什么？2.Ct值是在PCR扩增过程中，每个反应管内的荧光信号达到设定的荧光阈值时所经历的扩增循环数。请推测样本中初始模板数与Ct值的关系。3.某新型冠状病毒核酸检测说明书标明，Ct值≤37判定为阳性，Ct值＞40或无Ct值判定为阴性。图乙所示新型冠状病毒核酸检测结果应判定结果是______(阳性、阴性)。4.阴性结果也不能排除新型冠状病毒感染。可能产生假阴性的因素有________(填字母)。a.取样太早，样本中病毒量少，达不到实时荧光PCR检测阈值b.样本被污染，RNA酶将病毒RNA降解根据资料2，回答下列问题：5.若拟突变位点的碱基对为A-T，则需要让其突变为______才能达到目的。引物2的突变位点(突起处)应设计为______(假设引物为单链DNA)。6.在第一阶段获得两种具有重叠片段DNA的过程中，引物1、引物2组成的反应系统和引物3、引物4组成的反应系统中均进行一次复制，共产生______种DNA分子。该阶段必须将引物1、2和引物3、4置于不同反应系统中，其原因是_______________________。7.利用重叠延伸PCR技术还可以将两个不同来源的DNA片段拼接起来。有人想利用该技术把基因M和N拼接在一起，设计基因M的引物M1、M2，基因N的引物N1、N2。在设计这4种引物时，特别要注意的问题是什么？8.设计引物是PCR的关键步骤之一。某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理(如图)，请分别说明理由。(1)第1组：_____________________________________________________；(2)第2组：____________________________________________________。根据资料3，回答下列问题：①需要加入缓冲液、原料、___________、___________和引物A等。②首先要将反应体系的温度升高到95℃，其目的是_________________________。该反应体系中所用的TaqDNA聚合酶至少应能耐受________℃高温。11.决定RT－PCR扩增片段的是引物，要对图中单链cDNA进行n次循环的扩增，理论上至少需要________个引物B。12.利用RT－PCR技术可对某些微量RNA病毒进行检测，并可提高检测的灵敏度，原因是________________________________________________。【评价检测】1.(单选)在PCR反应体系中，加入过量的只与双链而不与单链DNA结合的荧光染料可用来鉴定扩增结果，该染料在游离状态不发出荧光，只有在DNA复制过程中掺入DNA双链中才发出荧光。错误的是2＋来激活耐高温的DNA聚合酶B.若要扩增一个DNA上的某基因，应加入DNA的两种引物和该基因的两种引物2.(不定项)研究员利用PCR技术扩增X基因。两种引物及其与模板链的结合位置如图甲所示。经4轮循环后产物中有5种不同的DNA分子，如图乙所示。错误的是⑤种DNA分子最早出现在第三轮复制后，只有一个⑤⑤种DNA分子共有8个3.如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如图(以EcoRⅠ酶切为例)。(1)步骤Ⅰ用的EcoRⅠ主要存在于________生物中，限制酶存在于该类生物中的主要作用是__________________________。(2)步骤Ⅱ用的DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的3′-羟基与5′-磷酸间形成_________；PCR每次循环一般可分为________________(按顺序书写)三步，其中第二步的目的是____________________。(3)若下表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是________(从引物①②③④中选择，填编号)。DNA序列(虚线处省略了部分核苷酸序列)已知序列PCR引物①5′－AACTATGCGCTCATGA－3′②5′－AGAGGCTACGCATTGC－3′③5′－GCAATGCGTAGCCTCT－3′④5′－TCATGAGCGCATAGTT－3′(4)对PCR产物测序，经分析得到了片段F的完整序列。下列DNA单链序列中(虚线处省略了部分核苷酸序列)，结果正确的是________。A.5′－AACTATGCG－－－－－AGCCCTT－3′B.5′－TTGATACGC－－－－－CGAGTAC－3′C.5′－GCAATGCGT－－－－－TCGGGAA－3′D.5′－AATTCCATG－－－－－CTGAATT－3′【跟踪检测】1.(单选)通过设计引物，运用PCR技术可以实现目的基因的定点诱变。如图为基因工程中获取突变基因的过程，其中引物1序列中含有一个碱基T不能与目的基因片段配对，但不影响引物与模板链的整体配对，反应体系中引物1和引物2的5′端分别设计增加限制酶a和限制酶b的识别位点。正确的是A.在PCR反应体系中还需要加入4种游离核苷酸、解旋酶、TaqDNA聚合酶等B.第2轮PCR，引物1能与图中②结合并且形成两条链等长的突变基因D.第3轮PCR结束后，含突变碱基对且两条链等长的DNA占1/22.(不定项)如图是将目的基因导入大肠杆菌内制备“工程菌”的示意图，其中引物1～4在含有目的基因的DNA上的结合位置如图甲所示，限制酶BamHⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ在质粒上的识别位点如图乙所示。正确的是A.PCR过程完成4轮循环，理论上至少需加入引物30个B.若已经合成了图甲所示4种引物，应选择引物2和3扩增目的基因①中应使用限制酶BamHⅠ切割质粒D.对于转化失败的大肠杆菌及其培养基应进行灭菌处理，以防其污染环境3.某科研小组从土壤菌株A、B中分离到同源性为93%的Bt1抗虫基因和Bt2抗虫基因的编码序列，并运用交错延伸PCR技术获得了抗虫性能强的重组B基因，转入烟草获得成功，过程如图所示。注：①交错延伸PCR：基因Bt1和Bt2均作为模板，所需引物相同，图中仅表示其中一条链的延伸情况。②启动子Pr1a可在烟草叶肉细胞中特异性启动基因的转录。③图中生长素合成酶基因是通过成熟mRNA逆转录获得的DNA片段，可使植物细胞合成生长素。④抗草甘膦基因(oroA)正常表达可使植物对除草剂草甘膦有较好抗性；⑤抗卡那霉素基因(Kanr)正常表达可使细菌对卡那霉素有较好抗性。(1)若用EcoRⅠ(5′-G↓AATTC-3′)和限制酶XmaⅠ(5′-G↓CCGGG-3′)双酶切多个目的基因，随机连接________(填“能”或“不能”)避免两个目的基因连接成环。图中所示Ti质粒部分至少含有______个启动子，复制原点是___________酶识别和结合的位点。(2)在培养愈伤组织的培养基中添加____________可以筛选含有Bt重组基因的细胞。图中生长素合成酶基因________(能、不能)促进愈伤组织生根，作出判断并解释。(3)已知交错延伸PCR中所用引物片段均为30个核苷酸，TaqDNA聚合酶在72℃下的扩增速度为1000个碱基/min，本实验的循环扩增条件为：95℃变性30s,50℃复性15s,72℃延伸15s，共80个循环。第二轮循环后所得重组型子链长度为______个核苷酸。若将复性温度调成55℃，则无法得到扩增产物，原因是__________________________________。通过交错延伸PCR获得的重组Bt基因，同时具有Bt1和Bt2基因序列的原因是______________。【归纳建模】通过本课题的深入探究，可以构建以“基因表达载体的构建和PCR的应用”为核心的知识网络体系，建构以下思维模型。请在空白处，拓展需要整理的知识内容。参考答案探究点1【教材追根】2.①EcoRⅤT4DNA②启动子终止子XhoⅠ和PstⅠ钙3.切割外源DNA，使之失效，起到保护自身的目的(或抵抗外源DNA的入侵，保护自身或清除入侵的病毒DNA)。4.避免了因目的基因随机插入宿主细胞DNA引起的生物安全性问题。5.sgRNA的识别序列短，特异性差，容