【生物】基因工程的基本操作程序课件-2023-2024学年高二下学期生物人教版选择性必修3

第3章

第2节、基因工程的基本操作程序（含DNA片段的扩增及电泳鉴定）基因表达载体本节聚焦:1.基因工程的基本操作程序主要包括哪几个步骤？2.基因工程操作的每一步涉及的技术和方法有哪些？从社会中来课本P76、76转基因抗虫棉非转基因抗虫棉1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴胞晶体蛋白(Bt抗虫蛋白)，破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫(P76)①Bt抗虫蛋白的抗虫原理？②抗虫棉中的Bt抗虫蛋白会不会对人畜产生危害？P77[相关信息]你知道转基因抗虫棉的机制是什么吗？培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤？

当Bt抗虫蛋白被分解为多肽后，多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，最后造成害虫死亡Bt抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也没有特异性受体，因此，Bt抗虫蛋白不会对人畜产生上述影响苏云金杆菌与载体拼接普通棉花（无抗虫特性）棉花细胞抗虫棉提取导入抗虫基因（Bt抗虫蛋白基因）重组DNA分子培育转基因抗虫棉的简要过程1.目的基因的筛选与获取2.基因表达载体的构建3.将目的基因导入受体细胞4.目的基因的

检测与鉴定实例：具体的步骤是？(含抗虫基因）（含有并表达抗虫基因）1、目的基因的筛选与获取2、基因表达载体的构建3、将目的基因导入受体细胞4、目的基因的检测与鉴定核心有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可进行遗传、表达和发挥作用。载体进入受体细胞稳定表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化才能确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达。基因工程的基本操作程序01第一步：目的基因的筛选与获取获取目的基因时获取的是哪一部分的DNA片段？在解决这个问题之前，我们得先了解基因的结构是怎样的？1.目的基因(1)概念：在基因工程的设计和操作中，用于

或

等的基因。(3)实例：与

等相关的基因。根据不同的需要，目的基因不同，主要指的是

。改变受体细胞性状获得预期表达产物(2)作用：编码蛋白质的基因生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶资料：苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴胞晶体蛋白（Bt抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。科学家将“杀虫基因”转入棉花中，棉花产生Bt抗虫蛋白抵抗虫害。目的基因--Bt抗虫蛋白基因1一、目的基因的筛选与获取

一第一步：目的基因的筛选与获取注意：

所有的基因都编码蛋白质或肽链。基因的种类一般分为结构基因、转录基因和调控基因。结构基因的功能：具有转录和翻译功能，能控制生物性状（编码蛋白质或肽链）。转录基因的功能：只有转录功能，没有翻译功能，能转录形成tRNA和rRNA。调控基因的功能：不能进行转录和翻译，只能调控其他基因的表达。知识拓展：基因不是基因1基因2基因3知识拓展：基因的结构DNA片段放大基因通常是有遗传效应的DNA片段；能编码特定的蛋白质非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游能转录相应的mRNA，进一步编码（翻译）出蛋白质的DNA区段不能转录为相应的mRNA，不能编码蛋白质的区段不能转录为相应的mRNA，不能编码蛋白质的区段启动子1.编码区：能转录相应的信使RNA，能编码蛋白质的序列。2.非编码区：原核细胞的基因结构非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游含有能调控遗传信息表达的DNA序列。不转录，不编码蛋白质；知识拓展：基因的结构终止子获取目的基因一般获取哪一部分的DNA片段？基因编码区与RNA聚合酶结合位点RNA聚合酶识别并结合的位点，驱动基因转录出mRNA启动子终止子本质：位置：作用：是一段有特殊序列结构的DNA片段；位于基因上游；也是一段有特殊序列结构的DNA片段；位于基因下游；终止转录本质：位置：作用：原核细胞的基因结构知识拓展：基因的结构启动子终止子非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游真核细胞的基因结构编码区非编码区非编码区内含子外显子启动子终止子外显子：内含子：能转录相应的mRNA，进一步能编码蛋白质的DNA序列。能转录相应的mRNA，但却不能编码蛋白质的DNA序列，然后在翻译前就被剪切掉。知识拓展：基因的结构非编码区非编码区编码区转录剪接外显子内含子前体mRNA成熟mRNA真核生物基因的表达知识拓展：基因的结构真核生物的DNA转录形成的mRNA需要在细胞核加工处理成为成熟的mRNA后才能作为下一步翻译的模板。CA……UCCCUAAGGAUAGCCAUCCCAGAUG--ATGCATGCAT……CGATCGTAGCCA……TCCCTAAGGATAGCCATCCCAGATG……CATGCATCCATGC-----TACGTACGTA……GCTAGCATCGGT……AGGGATTCCTATCGGTAGGGTCTAC……GTACGTAGGTACG---某原核细胞基因非编码区非编码区编码区不编码mRNA不编码mRNA(编码mRNA)启动子终止子RNA聚合酶原核生物基因的表达过程知识拓展：基因的结构--ATGCATGCAT……CGATCGTAGCCA……TCCCTAAGGATAGCCATCCCAGATG……CATGCATCCATGC-----TACGTACGTA……GCTAGCATCGGT……AGGGATTCCTATCGGTAGGGTCTAC……GTACGTAGGTACG---非编码区非编码区编码区(编码mRNA)启动子终止子CA……UCCCUAAGGAUAGCCAUCCCAGAUG转录mRNA某原核细胞基因原核生物基因的表达过程知识拓展：基因的结构--ATGCATGCAT……CGATCGTAGCCA……TCCCTAAGGATAGCCATCCCAGATG……CATGCATCCATGC-----TACGTACGTA……GCTAGCATCGGT……AGGGATTCCTATCGGTAGGGTCTAC……GTACGTAGGTACG---非编码区非编码区编码区(编码mRNA)启动子终止子CA……UCCCUAAGGAUAGCCAUCCCAGAUG转录mRNA翻译蛋白质某原核细胞基因原核生物基因的表达过程知识拓展：基因的结构CA……UCCCUAAGGAUAGCCAUCCCAGAUG--ATGCATGCAT……CGATCGTAGCCA……TCCCTAAGGATAGCCATCCCAGATG……CATGCATCCATGC-----TACGTACGTA……GCTAGCATCGGT……AGGGATTCCTATCGGTAGGGTCTAC……GTACGTAGGTACG---某真核细胞基因非编码区非编码区编码区不编码mRNA不编码mRNA(编码mRNA)启动子终止子RNA聚合酶外显子内含子外显子内含子外显子真核生物基因的表达过程知识拓展：基因的结构--ATGCATGCAT……CGATCGTAGCCA……TCCCTAAGGATAGCCATCCCAGATG……CATGCATCCATGC-----TACGTACGTA……GCTAGCATCGGT……AGGGATTCCTATCGGTAGGGTCTAC……GTACGTAGGTACG---非编码区非编码区编码区(编码mRNA)启动子终止子CA……UCCCUAAGGAUAGCCAUCCCAGAUG转录初始mRNA某真核细胞基因外显子内含子外显子内含子外显子真核生物基因的表达过程知识拓展：基因的结构--ATGCATGCAT……CGATCGTAGCCA……TCCCTAAGGATAGCCATCCCAGATG……CATGCATCCATGC-----TACGTACGTA……GCTAGCATCGGT……AGGGATTCCTATCGGTAGGGTCTAC……GTACGTAGGTACG---非编码区非编码区编码区(编码mRNA)启动子终止子CA……UCCCUAAGGAUAGCCAUCCCAGAUG转录某真核细胞基因外显子内含子外显子内含子外显子RNA加工CA……UAGGAUCCAGAUG翻译蛋白质初始mRNA成熟mRNA真核生物基因的表达过程知识拓展：基因的结构【总结】原核细胞与真核细胞的基因结构比较不能编码蛋白质的序列=

非编码区原核生物的基因：不能编码蛋白质的序列真核生物的基因：=非编码区+内含子原核细胞真核细胞不同点编码区是

的编码区是间隔的、

的相同点都由能够编码蛋白质的

和具有调控作用的

区组成的连续不连续编码区非编码知识拓展：基因的结构目的基因的筛选和获取的方法是怎样的？2.筛选合适的目的基因1一、目的基因的筛选与获取1.较为有效的方法之一从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。2.认识基因结构和功能的技术方法随着测序技术的发展，以及序列数据库（GenBank）、序列比对工具（如BLAST）等的应用，越来越多的基因的结构和功能为人们所知，为找到合适的目的基因提供了更多的机会和可能。3.实例：Bt

抗虫蛋白基因（Bt基因）的筛选过程用苏云金杆菌制成的生物杀虫剂广泛用于防治棉花虫害也对Bt基因的表达产物——Bt抗虫蛋白有了较为深入的了解。苏云金杆菌的杀虫作用与Bt基因有关不仅掌握了Bt基因的序列信息Bt基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因13.目的基因的获取方法1一、目的基因的筛选与获取✭获取目的基因的方法：①利用PCR获取和扩增目的基因②从基因文库中获取③人工合成前提：方法：DNA合成仪基因比较小、核苷酸序列已知通过DNA合成仪用化学方法直接合成（常用）重点了解什么是PCR？人工合成目的基因1.化学方法人工合成：(1)需要仪器：DNA合成仪。(2)适用目的基因类型：基因比较小，核苷酸序列又已知。(3)不需要模板。DNA合成仪蛋白质的氨基酸顺序mRAN核苷酸序列基因DNA的核苷酸序列目的基因推测推测化学合成比如：引物2.反转录法：基因的相对分子质量大而又不知其序列。目的基因的mRNA杂交双链(RNA-DNA)单链DNA双链DNA(目的基因)逆转录酶核酸酶HDNA聚合酶构建基因文库来获取目的基因1.基因文库概念：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。2.基因文库类型：基因组文库：含有一种生物的全部基因。部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因，如：cDNA文库。基因组文库与部分基因文库的关系？构建基因文库来获取目的基因3.基因文库的构建：将DNA片段与载体连接导入受体菌中储存(1)基因组文库的构建提取某种生物的全部DNA多个一定大小的DNA片段基因表达载体用适当的限制酶切割基因组文库构建基因文库来获取目的基因3.基因文库的构建：(2)部分基因文库（如cDNA文库）构建提取某种生物某器官或特定发育时期的mRNA单链互补DNA双链DNA片段基因表达载体与载体连接cDNA文库逆转录酶DNA聚合酶导入受体菌中储存mRNA逆转录酶核酸酶HRNA-DNA杂交双链单链DNADNA聚合酶双链DNA与载体连接导入受体菌中储存文库类型cDNA文库基因组文库文库大小基因中启动子基因中内含子基因多少物种间基因交流小大无有无有某种生物的部分基因某种生物的全部基因可以部分基因可以基因组文库和部分基因文库的比较PCR是

的缩写。它是一项根据＿＿＿＿＿的原理，在

提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对

的技术。利用PCR获取和扩增目的基因1.PCR的概念：中文全称原理操作环境目的PCR扩增仪聚合酶链式反应DNA半保留复制体外目的基因的核苷酸序列进行大量复制PCR由穆里斯等人于1985年发明，为此，穆里斯于1993年获得诺贝尔化学奖。离心管CGTATACGGCCGTATAGCCGATATCGATCGTATATATACGTATACGGCTAGCCGTA3'5'CCGTAGTATACGGCTAGCCGTATACGGCCGTATAGCCGATATCGATCGTATATATA3'5'ATP解旋酶（1）解旋目的基因的筛选与获取回顾：体内DNA复制CCGTAGTATACGGCTAGCCGTATACGGCCGTATAGCCGATATCGATCGTATATATA3'5'ACGCAAGCTAGTCATTATATGCATGATCGAGCTT（2）合成子链回顾：体内DNA复制CCGTAGTATACGGCTAGCCGTATACGGCCGTATAGCCGATATCGATCGTATATATA3'5'ACGCAAGCTAGTCATTATATGCATGATCGAGCTTACGCAAGCTAGTCATTADNA聚合酶5'3'TATGCATGATCGAGCTT5'3'ATPATPDNA聚合酶作用下形成磷酸二酯键子链延伸合成的方向？只能从5′－端→3′－端延伸，细胞内有RNA引物结合到模板3′－端引发子链的延伸回顾：体内DNA复制（2）合成子链CCGTAGTATACGGCTAGCCGTATACGGCCGTATAGCCGATATCGATCGTATATAA3'5'ACGCAAGCTAGTCATTATATGCATGATCGAGCTT5'3'TAGCCGTATAGCCGATAT3'5'TTACGCGTATATATA5'3'（3）重新螺旋形成新的DNA分子回顾：体内DNA复制引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。3’5’DNA母链13’5’DNA母链23’5’引物13’5’引物2什么是引物？3’5’DNA母链13’5’DNA母链2引物可以是DNA单链，也可以为RNA单链，细胞内的DNA复制通常以RNA单链为引物细胞外（PCR）一般以DNA单链为引物用于PCR的引物长度通常为20~30个核苷酸。引物结合在模板链的3’端因为DNA聚合酶不能直接将单个的核苷酸聚合成链。子链合成需要引物？利用PCR获取和扩增目的基因2.DNA体外复制（PCR）的条件：体内DNA复制参与的组分在DNA复制中的作用PCR中参与的组分解旋酶DNA母链4种脱氧核苷酸DNA聚合酶引物无需解旋酶，用高温(90℃以上)代替DNA模板(含目的基因的DNA片段)4种脱氧核苷酸(dNTP)PCR反应需要在一定的缓冲溶液中才能进行提供DNA复制的模板合成DNA子链的原料打开DNA双链催化合成DNA子链使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸（变性）提供相对稳定的pH环境；一般添加Mg2+，真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活。dNTP和ATP类似,不但可以提供原料还可以提供能量，无需添加ATP。耐高温的DNA聚合酶(Taq酶）2种引物(常为小的单链DNA，通常为20-30个核苷酸)利用PCR获取和扩增目的基因3.PCR的过程：当温度超过_____以上时，

断裂，双链DNA解聚为两条

。

氢键单链DNA待扩增的DNA片段(1)变性：变性90℃变性复性延伸

3’3’5’5’3’5’3’5’不需要解旋酶思考：变性的温度为何是90℃以上的一个温度范围，而不是95℃？因为变性的温度与氢键的数量有关。当氢键数量越多时，所需温度就越高；反之，当氢键数量越少时，所需温度也就越低。利用PCR获取和扩增目的基因3.PCR的过程：当温度下降

到左右时，

种引物通过

与两条单链DNA结合。

3’5’3’5’碱基互补配对引物15’3’引物25’3’(2)复性：50℃两由于DNA双链是反向平行的，所以需要两种引物变性复性延伸

思考：为什么需要引物？引物结合在模板链的什么位置？①因为Taq酶不能从0开始添加核苷酸。②引物结合在DNA模板链

3'端位置，引导子链从5'端→3'端方向复制。当温度上升到____左右时，溶液中的4种_________在耐高温的_______________的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。

脱氧核苷酸DNA聚合酶72℃利用PCR获取和扩增目的基因3.PCR的过程：(3)延伸：(Taq酶)3’5’3’5’引物15’3’引物25’3’Taq酶3’Taq酶3’变性复性延伸

思考1：为什么温度要上升至72℃？思考2：Taq酶结合在引物的3’还是5’端？72℃是Taq酶的最适温度Taq酶结合在引物的3’端第一轮循环的产物作为第二轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第二轮循环的产物；第二轮循环的产物作为第三轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第三轮的产物；第二轮循环的产物第三轮循环的产物利用PCR获取和扩增目的基因由于一个循环得到的产物又可以作为下一个循环的模板，因而每一次循环后目的基因的量可以增加一倍。即成

形式扩增（约为

，其中n为扩增循环的次数）。指数2n常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物。4.PCR的结果：5.PCR产物的鉴定：循环n次，理论上可获得DNA数

，

其中含引物的DNA数

，含引物的DNA链数

，共需引物数

。2n2n2n+1-22n+1-2利用PCR获取和扩增目的基因下图表示PCR的前三个循环，目的基因位于模板DNA分子中与两种引物所对应的位置之间，请据图回答下列问题：(1)PCR扩增的是完整的模板DNA分子吗？

不是，PCR扩增的仅仅是两种引物之间所对应的特定DNA片段。(2)如果已知某目的基因的序列和结构，利用PCR筛选和扩增出该目的基因的关键是什么？

根据目的基因两端的核苷酸序列设计引物。

利用PCR技术扩增目的基因，在第几轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段(即出现完整的目的基因)？5’3’5’5’第一次循环第二次循环3’5’第三次循环3’3’一、目的基因的筛选与获取——利用PCR获取和扩增目的基因练习：图1、图2分别是PCR扩增技术相关过程，请思考回答下列问题：（1）图1所示利用PCR技术扩增目的基因，在第

轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段。（2）图2是某同学设计的两组引物（只标注了部分碱基序列）都不合理，请分别说明理由。第1组：引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生

而失效。第2组：引物Ⅰ′

后会出现局部

而失效。3碱基互补配对自身折叠碱基互补配对每种引物内部不能发生局部碱基互补配对两种引物之间不能在局部发生碱基互补配对一、目的基因的筛选与获取——利用PCR获取和扩增目的基因用PCR可以扩增mRNA吗？mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA再进行扩增。1.逆转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA链，形成RNA-DNA杂交分子；2.核酸酶H降解RNA-DNA杂交分子中的RNA链，使之变成单链DNA；3.以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子，即cDNA思考：能不能直接将目的基因导入受体细胞，为什么？如果不能，如何避免该结果的发生呢？

①游离的DNA进入细胞后，一般会直接被分解。

②就算没有被破坏且能进行转录和翻译，游离的DNA也无法跟着细胞分裂进行复制，导致子代细胞中不再含有目的基因。核心工作——基因表达载体构建02第二步：基因表达载体的构建（1）使目的基因在受体细胞中稳定存在，且可以遗传给下一代；（2）使目的基因能够在受体细胞中表达和发挥作用。目的基因＋启动子＋终止子＋标记基因+复制原点二、基因表达载体的构建（基因工程的核心）1.基因表达载体的目的2.基因表达载体的组成思考：要各个元件有什么作用？（1）启动子：①本质：一段有特殊序列结构的

片段。DNA②功能：RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。表达载体启动子目的基因终止子复制原点（2）终止子：①本质：一段有特殊序列结构的

片段。②功能：使转录在所需要的地方停下来。DNA2.基因表达载体的组成二、基因表达载体的构建（基因工程的核心）启动子终止子起始密码子终止密码子本质位置功能启动子、终止子、起始密码子、终止密码子的比较DNA片段DNA片段mRNA上三个相邻的碱基mRNA上三个相邻的碱基目的基因上游目的基因下游mRNA首端mRNA尾端RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA使转录在所需要的地方停下来翻译的起始信号（编码氨基酸）翻译的结束信号（不编码氨基酸）（3）标记基因：①作用：便于重组DNA分子的筛选。②常见类型：抗生素抗性基因、荧光蛋白基因等。启动子终止子标记基因复制原点目的基因主要是指编码蛋白质的基因，能控制表达所需要的特殊性状，如Bt基因。（5）复制原点：DNA复制的起始位点。注意：目的基因必须插入到

与

之间。启动子

终止子（4）目的基因：二、基因表达载体的构建（基因工程的核心）二、基因表达载体的构建（基因工程的核心）3.基因表达载体的构建过程③再利用

将含目的基因的DNA片段拼接到

的切口处，这样就形成了一个重组DNA分子（基因表达载体）。目的基因限制酶切割位点标记基因启动子限制酶切割位点终止子复制原点限制酶限制酶DNA连接酶①首先用一定的

切割载体（质粒），使它出现一个切口。②然后用

限制酶或能产生

末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。限制酶同种相同DNA连接酶载体思考·讨论使用一种DNA限制酶进行切割（单酶切），是否只会得到目的基因与载体结合的这一种重组DNA？载体目的基因自连片段间的连接目的基因自连质粒自连目的基因与质粒连接目的基因与目的基因连接质粒与质粒连接正向连接反向连接11’22’122’1’22’1’1选择两种不同的限制酶同时对目的基因和质粒切割（双酶切），防止目的基因和载体的自身环化和反向连接。将目的基因与载体结合，构建好基因表达载体后，下面该进行什么操作？基因工程第三步：将目的基因导入受体细胞思考03第三步：将目的基因导入受体细胞将目的基因导入植物细胞将目的基因导入动物细胞将目的基因导入微生物细胞农杆菌转化法花粉管通道法——显微注射法——Ca2+处理法我国科学家独创（常用）三、将目的基因导入受体细胞②在植物授粉后一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴在花柱切面，使目的基因通过花粉管通道进入胚囊。①用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；花粉管通道法导入外源DNA（1）花粉管通道法（我国独创）三、将目的基因导入受体细胞1.将目的基因导入植物细胞受体细胞：受精卵（2）农杆菌转化法三、将目的基因导入受体细胞1.将目的基因导入植物细胞体细胞或受精卵该方法受体细胞为

。“转化”概念：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程，实质是基因重组。①农杆菌特点：a.能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力；b.农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。随着转化方法的突破，农杆菌侵染水稻、玉米等多种单子叶植物也取得了成功表现出新性状的植株植物组织培养第一次导入第二次导入第一次拼接第二次拼接将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上。(非人工操作)是指含目的基因的T-DNA被拼接到受体细胞的染色体DNA上。(非人工操作)含目的基因的T-DNA导入受体细胞。将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌。Ti质粒T—DNA目的基因构建基因表达载体重组Ti质粒转入农杆菌导入植物细胞过程：（2）农杆菌转化法1.将目的基因导入植物细胞将目的基因插入Ti质粒的T-DNA中，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞，并整合到受体细胞的染色体DNA上，使目的基因能够维持稳定和表达。1.农杆菌转化法中，目的基因是否就是T-DNA，如果不是，T-DNA与目的基因是什么关系？T-DNA不是目的基因，但它将来会被整合到宿主细胞染色体的DNA上，只要将目的基因插入T-DNA中，目的基因就可以随T-DNA进入宿主细胞并整合到宿主细胞的染色体上。2.农杆菌转化法中，目的基因只能进入植物的一个体细胞，但基因工程最终要的是一个转基因植株，如何实现这一目标？得到含有目的基因的植物细胞后进行植物组织培养问题探讨核心探讨

将目的基因导入受体细胞下面为利用农杆菌转化法制备转基因植物的过程图，据图回答下列问题：1.重组Ti质粒的构建需要哪些酶的作用？限制酶、DNA连接酶。2.将基因表达载体导入农杆菌细胞时，应怎样处理农杆菌细胞？要用Ca2＋处理农杆菌细胞，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。三、将目的基因导入受体细胞2.将目的基因导入动物细胞（1）导入方法：（2）受体细胞:显微注射法受精卵原因：①体积大，易操作；

②易表现出全能性。（3）过程：构建基因表达载体并提纯利用显微注射将基因表达载体注入动物的受精卵中早期胚胎培养胚胎移植获得具有新性状的动物科学家用病毒DNA与目的基因一起构建的载体，去感染受体动物细胞，也能使目的基因导入动物细胞内，如腺病毒载体等。病毒侵染法三、将目的基因导入受体细胞3.将目的基因导入微生物细胞(1)常用方法：(2)受体细胞：Ca2+处理法常选择原核细胞（其中以大肠杆菌应用最为广泛）目的：可使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态优点：繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少，易于培养(3)过程：大肠杆菌使细胞处于一种能吸收周围环境DNA分子的生理状态溶于缓冲液中的重组DNA分子转化CaCl2(Ca2+)三、将目的基因导入受体细胞3.将目的基因导入微生物细胞(4)应用实例利用转基因大肠杆菌生产药物

原核生物作为受体细胞产生的真核生物的蛋白质通常没有生物活性（原核细胞中没有高尔基体和内质网等），需要在体外进行再加工。转录翻译加工如果把一个真核生物的基因导入原核细胞中表达，一定会产生原来的蛋白质吗？一般不能产生原来的蛋白质原因：①原核生物细胞里没有相应的机制来去除内含子；②原核生物没有真核的蛋白质加工系统（如内质网、高尔基体等）相应机制剪切内含子转录出来的序列真核基因：编码区（外显子+内含子）前体mRNA成熟mRNA多肽链蛋白质将目的基因导入受体细胞的方法总结细胞种类植物细胞动物细胞微生物细胞常用方法农杆菌转化法显微注射Ca2＋处理法(CaCl2)受体细胞受精卵或体细胞受精卵常用原核细胞转化过程目的基因插入Ti质粒的T-DNA上→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA中→表达目的基因表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物Ca2+处理细胞→能吸收周围环境中DNA分子的生理状态细胞→重组的基因表达载体导入细胞中将基因表达载体导入受体细胞后，如何判断导入是否成功？即使导入成功，如何判断目的基因是否可以正常表达？思考不一定！检查目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性。04第四步：目的基因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴定1.检测与鉴定的方法检测目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性。目的：(1)分子水平的检测：(2)个体生物学水平鉴定：③检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等②检测目的基因是否转录出了mRNA①检测目的基因是否插入受体细胞染色体DNA

上类型检测内容方法分子水平的检测PCR等技术抗原-抗体杂交技术PCR等技术①检测受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因②检测目的基因是否转录出了mRNA③检测目的基因是否翻译成蛋白质等1.分子水平的检测2.个体生物学水平的鉴定类型检测内容方法个体生物学水平的鉴定个体是否具有相应性状或产物是否具有功能活性抗虫、抗病的接种实验产品功能活性比较五、DNA片段的扩增及电泳鉴定材料用具①PCR仪（自动控温，实现DNA的扩增）②微量离心管（实际上是进行PCR反应的场所）③微量移液器（用于向微量离心管转移PCR配方中的液体）④一次性吸液枪头（微量移液器吸取一种试剂更换一次枪头）PCR仪电泳装置⑤电泳装置（包括电泳仪、电泳槽等）微量离心管推动杆调节旋钮卸枪头按钮体积刻度吸液杆枪头（注意：加不同样品时，需要更换枪头）DNA片段的扩增及电泳鉴定探究·实践DNA片段的扩增及电泳鉴定1.利用PCR在体外进行DNA片段扩增的原理：探究·实践一、实验原理(1)PCR利用了

原理，通过调节

来控制DNA双链的

，PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器。(2)PCR扩增DNA片段还利用了

的原理。一次PCR一般要经历

次循环。DNA的热变性温度解聚与结合DNA半保留复制305’--3’3’--5’3’--5’5’--3’5’--3’-5’5’-3’--5’5’--3’-5’5’-3’--5’3’--3’高温变性延伸复性低温中温1次循环DNA片段的扩增及电泳鉴定探究·实践二、材料用具2.试剂:(1)4种脱氧核苷酸等量混合液、2种引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、扩增缓冲液、无菌水。10倍浓缩的扩增缓冲液（含Mg2+）5μL20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液（实为dNTP）1μL20μmol/L的引物Ⅰ2.5μL20μmol/L的引物Ⅱ2.5μLH2O28～33μL1-5U/μL的TaqDNA聚合酶（即耐高温的DNA聚合酶）1～2U模板DNA（用量为1pg-1μg）5～10μL总体积50μLPCR反应体系的配方为保证加入反应体系中的各试剂体积的准确性，建议按照加入体积的大小，由大到小依次加入各试剂，即先加入无菌水。为保护酶的活性，一般最后加入DNA聚合酶。DNA片段的扩增及电泳鉴定探究·实践三、实验步骤(1)DNA片段的扩增①移液：用微量移液器依次将各组分加入微量离心管中。（注意：酶和缓冲液要在冰块上缓慢融化，用后置于-20℃冰箱中保存。酶和缓冲液一般分装成小份，避免反复融化导致活性降低甚至失活）②离心：待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部（提高反应速率）③反应：参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。循环程序变性复性延伸预变性94℃,5min//30次94℃,30s55℃,30s72℃,1min最后一次94℃,1min55℃,30s72℃,1min

使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合预变性：DNA片段的扩增及电泳鉴定2.DNA片段电泳鉴定的原理：(1)带电粒子：DNA分子具有___________，在一定的pH下，这些基团可以带上____________。(2)迁移动力与方向：在____的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷_____的电极移动，这个过程就是_____。(3)迁移速度：PCR的产物一般通过

来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与_________、_____________和____等有关。(4)检测：凝胶中的DNA分子通过_____，可以在波长为______的_______下被检测出来。可解离的基团正电荷或负电荷电泳相反电场凝胶的浓度染色300nm紫外灯DNA分子的大小构象探究·实践一、实验原理（呈负相关）琼脂糖凝胶电泳一般使用的电泳缓冲液pH=8，DNA分子带负电荷，在电场中DNA便向正极泳动。(1)凝胶浓度：制成的琼脂糖凝胶是一种带孔的筛网状多聚物。凝胶浓度越小，筛孔越大，DNA分子迁移速率就越高；凝胶浓度越大，筛孔越小，DNA分子迁移速率就越低。影响DNA迁移速率的因素(2)DNA分子的大小：当凝胶浓度相同时，较大的DNA分子因体积大，所占据的空间大，在穿过凝胶孔隙时会遇到较大的阻力，穿过孔隙相对困难，迁移速率低。反之，迁移速率就高。因此，电泳一段时间后，较大的DNA分子迁移距离小，离加样孔近；而较小的DNA分子迁移距离大，离加样孔远。相同大小的DNA分子则会聚集在凝胶同一特定的位置上。根据这一特性，可以把不同大小的DNA分子分离开来。(3)DNA的构象:迁移速率：双螺旋环状DNA＞双螺旋链状DNA＞单链DNA。EB可插入DNA双链碱基之间，形成EB-DNA复合物。该复合物在紫外线激发下，发射出红橙色荧光。EB-DNA复合物荧光强度与DNA含量成正相关，根据荧光强度可粗略地估计样品中DNA含量。（EB有剧毒）DNA片段的扩增及电泳鉴定探究·实践二、材料用具2.试剂:(2)电泳缓冲液(TAE或TBE)、凝胶载样缓冲液(内含指示剂——溴酚蓝)、琼脂糖核酸染料(常用核酸染料为EB即溴化乙锭)等电源+电泳槽琼脂糖凝胶样品孔缓冲液—4.配制琼脂糖溶液琼脂糖电泳缓冲液加热至融化稍冷却根据待分离DNA片段的大小，确定琼脂