免疫印迹实验技术

免疫印迹实验技术1免疫印迹实验技术5/8/2024应用举例免疫印迹实验2免疫印迹实验技术5/8/2024西妥昔单抗（EGFR抗体，C225)联合铂类／5-Fu治疗复发／晚期转移、不可切除的头颈鳞癌可有效提高患者五年生存率问题：为什么西妥昔单抗对头颈鳞癌有效？头颈鳞癌靶向治疗3免疫印迹实验技术5/8/2024EGFR在头颈鳞癌中表达如何？4免疫印迹实验技术5/8/2024EGFR在头颈鳞癌中表达如何？EGFR

N1

C1

N2

C25免疫印迹实验技术5/8/2024运用西妥昔单抗能否抑制头颈鳞癌细胞中EGFR的表达？6免疫印迹实验技术5/8/2024运用EGFR抑制剂能否抑制头颈鳞癌细胞中EGFR的表达？actinEGFR

NC248244872h7免疫印迹实验技术5/8/2024应用EGFR抑制剂，是否可以促进肿瘤细胞凋亡？8免疫印迹实验技术5/8/2024肿瘤细胞凋亡？caspase9免疫印迹实验技术5/8/2024检测细胞或组织蛋白中目标蛋白质的表达表达定位：组织（细胞）免疫荧光

激光共聚焦表达定量：westernblot实验目的10免疫印迹实验技术5/8/2024免疫印迹（Westernblotting）应用蛋白质特异的单克隆抗体或多克隆抗体检测特异性的目的蛋白未知蛋白进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶单向电泳（SDS）转移到固相支持物特异性的抗体检测目的蛋白原理11免疫印迹实验技术5/8/2024SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳原理在电场的作用下，根据蛋白质的不同分子量将蛋白分离垂直电泳12免疫印迹实验技术5/8/2024蛋白质特性原理13免疫印迹实验技术5/8/2024蛋白质空间结构原理氢键非共价键，次级键，包括氢键、疏水键、盐键以及范德华力（VanderWasls力）等二硫键14免疫印迹实验技术5/8/2024蛋白质的等电点PIPI=PH净电荷人体PH=7.2大于PI(﹤6)蛋白质带负电荷原理15免疫印迹实验技术5/8/2024原理

SDS多肽SDS-多肽多肽DTT断开半胱氨酸残基之间的二硫键，破坏蛋白质的四级结构SDS：阴离子表面活性剂（去污剂），断开分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构蛋白质迁移率只与多肽的分子量大小有关16免疫印迹实验技术5/8/2024原理17免疫印迹实验技术5/8/2024检测细胞或组织内目的蛋白质的表达检测细菌、真菌、血清等目的蛋白的表达非原位检测，不能对目的蛋白做细胞定位必须有目的蛋白质的特异性抗体才能完成检测属于半定量检测，需以内参蛋白，如β-肌动蛋白（β–actin），GAPDH等作为对照适用范围和条件18免疫印迹实验技术5/8/2024操作流程总蛋白质抽提蛋白质浓度测定SDS考马斯亮蓝染色（不可逆）检测电泳成功与否？电转移丽春红染色（可逆）检测电转成功与否？抗体western印记抗体孵育发色/光底物显迹提取分离固定显色19免疫印迹实验技术5/8/2024操作流程20免疫印迹实验技术5/8/2024完全性防降解保活性总蛋白抽提

温度:4℃

方法:机械法/非机械法

蛋白本身特性:

表面蛋白,膜蛋白,磷酸化蛋白

蛋白的保存:-80℃,蛋白酶抑制剂21免疫印迹实验技术5/8/2024Bradford比色法测定考马斯亮兰与待测蛋白的结合量用已知浓度的标准蛋白质（如牛血清白蛋白BSA)制作标准曲线蛋白浓度测定22免疫印迹实验技术5/8/2024一维分离

分子量不同,与电荷无关凝胶制备

分离胶-积层胶蛋白前处理

蛋白变性垂直电泳SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳

23免疫印迹实验技术5/8/2024SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳-凝胶制备分离胶积层胶1cm24免疫印迹实验技术5/8/2024凝胶成分25免疫印迹实验技术5/8/2024基层胶和分离胶配置比例26免疫印迹实验技术5/8/2024根据目的蛋白的分子量及SDS-聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围选择合适的丙烯酰胺分离胶浓度SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳-凝胶制备丙烯酰胺浓度（％）线性分离范围1512～431016～687.536～945.057~21227免疫印迹实验技术5/8/2024电泳仪28免疫印迹实验技术5/8/2024分离胶灌制后,蒸馏水压平界面,且可以隔绝空气分离胶完全聚合后（约30分钟），尽可能排出凝胶上的液体配制积层胶(约1cm),保证高度,快速梳子润湿后再放置,防气泡等待凝胶完全聚合(≥40分钟)冲洗梳孔,去除未完全聚合的丙稀酰胺SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳

-凝胶制备29免疫印迹实验技术5/8/2024蛋白测浓度,根据浓度计算上样量，尽量保证每孔上样量相同。加入SDS凝胶加样缓冲液，在100℃加热3-5分钟使蛋白变性上样缓冲液中的DTT易失效，使用前由贮存液中现加加样应柔和，一般小型的Bio-Rad垂直电泳仪每孔加样最好不要超过20μl，上样尽量快不加样的孔用上样缓冲液补齐SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳-蛋白的预处理

30免疫印迹实验技术5/8/2024电泳装置与电源相连,注意正负电极电压设置:积层胶80V分离胶120~150V目的蛋白电泳至分离胶中下2/3的位置SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳

–垂直电泳

蛋白分子量标准31免疫印迹实验技术5/8/2024用途：电泳中判断蛋白位置，显色后排除非特异性条带电泳过程中－预染Marker显色后－生物素Marker，荧光MarkerSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳–蛋白分子量标准32免疫印迹实验技术5/8/2024蛋白质从SDS聚聚丙烯酰胺凝胶转移至固相支持物固相支持物：硝酸纤维素膜和PVDF膜电转方法：干转，半干转，湿转转移装置的安装丽春红染色验证电转移33免疫印迹实验技术5/8/2024电转移

--固相支持物NC膜尼龙膜PVDF膜灵敏度和分辨率高高高背景低低低结合能力80～100μg/cm2＞400μg/cm2125～200μg/cm2（适合于SDS存在下与蛋白质的结合）材料质地干的NC膜很脆软而结实机械强度高溶剂耐受性无无有操作顺序缓冲液润湿，避免气泡缓存液润湿使用前100％甲醇润湿检测方式常规染色，可用放射和非放射性检测不能用阴离子染料常规染色，与NC膜比较，可用考马斯亮蓝染色，可用ECL检测，快速免疫检测使用范围0.45μm一般蛋白0.2μm分子量小于20kD蛋白0.1μm分子量小于7kD的蛋白低浓度小分子蛋白，酸性蛋白、糖蛋白、和蛋白多糖（主要用在核酸检测中）一般蛋白，糖蛋白检测和蛋白测序价格价格较便宜便宜较贵34免疫印迹实验技术5/8/2024湿转法条件：300mA转膜2~3小时（室温）

60mA转膜过夜（4℃）防过热，防气泡！！电转移-电转移方法35免疫印迹实验技术5/8/2024电转移

–转移装置凝胶滤膜Whatman3MM滤纸Whatman3MM滤纸多孔性垫片多孔性垫片阳极阴极每层别忘赶走气泡!!36免疫印迹实验技术5/8/2024拿取凝胶、滤纸和滤膜时必须戴手套，因为皮肤上的油脂和分泌物中组织蛋白质从凝胶向滤膜转移。转膜结束后，凝胶可用考马斯亮蓝染色，以便于检查蛋白转移是否完全。尤其是发现转膜失败时，转膜后凝胶的考马斯亮蓝染色帮助寻找失败原因。电转移

–注意事项37免疫印迹实验技术5/8/2024抗体成功的关键封闭尽量去除非特异条带干扰PBST洗膜压片显色蛋白印迹38免疫印迹实验技术5/8/2024价廉物美脱脂奶粉封闭法

10%脱脂奶粉4℃过夜夏天室温不宜过长冬天适当延长孵育时间蛋白印迹

–封闭39免疫印迹实验技术5/8/2024一抗关键!!!!!!!

兔抗多克隆抗体特异性低容易出条带鼠抗单克隆抗体杂带少稀释:1:500~2000(根据产品说明书,推荐1:1000)

脱脂奶粉封闭液或PBST稀释孵育条件:

室温2小时或4℃过夜二抗1:5000~10000稀释PBST稀释孵育条件:室温1小时一抗二抗PBST洗膜时间15minX3次不能偷懒蛋白印迹

–抗体40免疫印迹实验技术5/8/2024化学发光法在暗房中，膜正面压放感光胶片，注意一旦放置好后不能移动

压膜全程不能带胶皮手套,只能带薄膜手套放射自显影时间取决于样品、靶蛋白的量、抗体质量，发光检测灵敏度等许多因素

化学发光有一定的粹灭时间,压片要及时蛋白印迹

–显色41免疫印迹实验技术5/8/2024WesternBlot成功案例42免疫印迹实验技术5/8/2024休息……43免疫印迹实验技术5/8/2024

无条带：1.实验操作：①样品制备是否有问题；上样量是否足够②电泳是否得当，电转是否完全；2.试剂问题：①电转液配制是否有问题；②抗体是否适用于做免疫印迹，稀释比例是否得当；③二抗种属的选择是否弄混淆；④发光试剂盒敏感度是否比较低或者已过期。3.目的蛋白的特性：①目的蛋白在组织中表达的丰度是否可检测②分子量过大或者过小的蛋白是否优化了条件；③目的蛋白是否是特殊蛋白，如磷酸化蛋白，膜蛋白及极少数不易溶解的蛋白

WesternBlot常见问题分析44免疫印迹实验技术5/8/2024WesternBlot常见问题分析条带之间无界限高丰度蛋白或上样量过多；蛋白变性不足；上样时间过长，样品在加样孔中弥散；曝光过度；凝胶聚合不足45免疫印迹实验技术5/8/2024WesternBlot常见问题分析背景过深或杂带过多多克隆抗体有可能出现；发光试剂盒过于敏感；封闭不够；抗体稀释比例过高，抗体过浓曝光时间过长有干膜现象发生46免疫印迹实验技术5/8/2