第十九章 DNA复制、修复课件

第19章DNA复制、修复19.1DNA复制总观

19.1.1半保留复制

19.1.2复制子、复制起始点与方向

19.1.3DNA复制的其它模式19.2原核生物的DNA复制

19.2.1DNA聚合酶I19.2.2DNA聚合酶Ⅱ、Ⅲ19.2.3DNA复制的真实性19.2.4DNA的生物合成19.2.5DNA复制体及相关蛋白19.2.6DNA复制的起始19.2.7DNA链的延伸19.2.8复制的终止19.3真核生物DNA的复制19.4反转录19.5DNA突变与修复1第十九章DNA复制、修复2第十九章DNA复制、修复3第十九章DNA复制、修复4第十九章DNA复制、修复5第十九章DNA复制、修复中心法则基因(gene):是为生物活性产物编码的DNA功能片段，这些产物主要是蛋白质或是各种RNA6第十九章DNA复制、修复复制的要点:1半保留复制2有起始点、终止点和方向3半不连续复制5297第十九章DNA复制、修复当细胞分裂,DNA进行复制时，双螺旋结构解开而成为单链，用于合成新的互补链。子代细胞出现新的DNA双链，其中一股单链是从亲代完整地接受过来的。另一股单链完全重新合成，且按碱基配对原则互补。DNA复制总观1●半保留复制:8第十九章DNA复制、修复如果DNA全保留复制：新合成的子链全部进入子细胞第一代第二代细菌（含15N-DNA)重DNA轻DNA重DNA重DNA普通培养基普通培养基细菌DNA双链密度梯度离心15N-DNA14N-DNA轻DNA9第十九章DNA复制、修复DNA半保留复制的证据第一代第二代细菌（含15N-DNA)轻DNA轻DNA重DNA重DNA普通培养基普通培养基细菌DNA双链密度梯度离心15N-DNA14N-DNA轻DNA10第十九章DNA复制、修复复制子(Replicon)：Genome上能独立进行复制的单位，每个复制子都含有一个复制起点。原核生物的染色体和质粒、真核生物的细胞器DNA都是都是环状双链分子，都是单复制子。真核生物的染色体DNA是线形双链分子，含有许多复制起点，因此是多复制子，每个复制子长约200Kbp。病毒DNA多种多样，环状或线形，双链或单链，但都是单复制子。线粒体、叶绿体DNA一般是单复制子。●复制子、复制起点和方向11第十九章DNA复制、修复复制方向复制方向大多数是双向的（等速进行或异速进行），形成两个复制叉，少数是单向复制，形成一个复制叉。12第十九章DNA复制、修复★用放射自显影实验判断DNA的复制方向及速度a.单向b.双向等速c.双向异速13第十九章DNA复制、修复★环状DNA复制起点的genemappingP53214第十九章DNA复制、修复（一）、环式DNA复制环状单链DNA，Φx174（二）、D－环式线粒体、叶绿体DNA

不对称复制，两条链的复制起点不在同一点上，一条链先复制，另一条链保持单链而被取代：当一条链复制到一定程度时才暴露出另一条链的复制起点，另一条链才开始复制。●DNA复制的其它模式15第十九章DNA复制、修复16第十九章DNA复制、修复

DNA聚合反应必备的条件：1.底物dNTP(dATP,dGTP,dCTP,dTTP)2.聚合酶DNA聚合酶（DNA依赖的DNA聚合酶)DNA--pol3.模板单链的DNA母链4.引物寡核苷酸引物（RNA)5.其他酶和蛋白质因子解链酶，解旋酶，单链结合蛋白，连接酶原核生物DNA复制2DNA聚合酶I、II、III17第十九章DNA复制、修复DNA聚合活性（5′→3′）pppppppPPPOH＋OHOH55γβα＋PPiN1N2N3N1N2N3′5′33′′′DNA聚合酶的活性

′′5335′′3′→5′外切酶活性5′→3′外切酶活性核酸外切酶活性18第十九章DNA复制、修复DNA聚合酶的反应特点：⑴以4种dNTP为底物⑵反应需要接受模板的指导，不能催化游离的dNTP的聚合。⑶反应需有引物3，-羟基存在⑷链生长方向5，→3，⑸产物DNA的性质与模板相同DNA生物合成5’→3’，化学合成3’→5’19第十九章DNA复制、修复聚合反应总反应式n1dATPn2dGTPn3dCTPn4dTTP+DNADNApol./Mg2+

+（n1+n2+n3+n4）PPidAMPdGMP

dCMPdTMPDNAn●20第十九章DNA复制、修复（1）E.coli.DNApol.I（Kornberg）单体酶，催化活性：5，→3，聚合活性3，→5，外切活性（校对）5，→3，外切活性（修复）用蛋白水解酶将DNApol.Ⅰ部分水解可得：大片段（Klenow）：5，→3，聚合活性、3，→5，外切活性。小片段，36Kd，活性：5，→3，外切活性（只作用于双链DNA的碱基配对部分，切除修复）。●DNA聚合酶I、II、III21第十九章DNA复制、修复（2）E.coli.DNAPol.Ⅱ单体酶，催化活性：5，→3，聚合(活性很低)3，→5，外切可能在DNA的修复中起某中作用。（3）E.coli.DNApol.Ⅲ

寡聚酶。DNApol.Ⅲ是合成新链DNA主要的酶，又称复制酶(Replicase)P539表19-1E.coli三种DNA聚合酶的性质比较22第十九章DNA复制、修复DNA聚合酶催化的分子机制来源于病毒、原核生物和真核生物的聚合酶、反转录酶甚至RNA聚合酶的聚合酶区域都有一个类似手指、手掌和拇指的基本结构，存在相似的折叠结构。23第十九章DNA复制、修复24第十九章DNA复制、修复通过晶体结构和模型研究发现，

手指区域可与未复制的单链模板相互作用，同时手指区域的一部分也参与结合进入底物dNTP。

拇指亚区可与模板－引物DNA双螺旋相互作用。聚合酶通过保守的氨基酸残基与引物模板复合物相互作用使引物的3’末端定位在手掌和手指的会合点，并与dNTP相对。25第十九章DNA复制、修复26第十九章DNA复制、修复研究还发现，dNTP的进入伴随着两个Mg2＋离子的作用，由此提出了核苷酸加入（聚合）反应的双金属离子机制（twometal-ionmechanism)。核苷酸的掺入是受模板指导的，所以DNA聚合酶在每个催化循环中都要改变它的核苷酸底物专一性。27第十九章DNA复制、修复DNA聚合酶的聚合反应的保真机制dNTP的参入遵循碱基配对原则DNA聚合酶3，→5，核酸外切酶活性校对机制切除错配的碱基核苷酸代谢库调节系统和修复系统调节dNTPs的水平切除修复、错配修复系统●DNA复制的真实性28第十九章DNA复制、修复DNA聚合酶III有6个结合位点⑴模板DNA结合位点⑵引物结合位点⑶引物3，-OH位点、反应位点⑷底物dNTP结合位点⑸5，→3，外切位点⑹3，→5，外切位点(校正)●DNA聚合酶III催化DNA合成29第十九章DNA复制、修复DNA聚合酶III的亚基组成由10个亚基组成α亚基：5’→3’

聚合酶活性ε亚基：3’→5’外切酶活性θ亚基：促进ε3’→5’外切酶活性核心酶●30第十九章DNA复制、修复复制体：在DNA合成的生长点（既复制叉上）分布着许多与复制有关的酶和辅助因子，它们在DNA的模板链形成离散的复合物，彼此配合进行高度精确的复制，称为复制体。复制体沿着复制叉方向前进就合成DNA。●DNA复制体及相关蛋白31第十九章DNA复制、修复32第十九章DNA复制、修复DNA复制过程：⑴DNA解螺旋酶解开双链DNA。⑵DNA促旋酶引入负超螺旋，消除复制叉前进时带来的扭曲张力。⑶SSB结合于DNA单链。⑷DNA引物酶(在引发体中)合成RNA引物。⑸DNApol.Ⅲ在两条新生链上合成DNA。⑹DNApolⅠ切除RNA引物，并补上DNA。⑺DNAligase连接封口。●33第十九章DNA复制、修复1.解螺旋酶大肠杆菌的解螺旋酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ与rep蛋白共同作用，将DNA两条链解开。解螺旋酶I、II、III沿着模板链的5’→3’方向随着复制叉的前进而移动，而rep蛋白则在另一条模板链上沿3’→5’方向移动。●34第十九章DNA复制、修复2.单链DNA结合蛋白（SSB）复制叉上的解螺旋酶，沿双链DNA前进，产生单链区，大量的单链DNA结合蛋白与单链区结合，阻止复性和保护单链DNA不被核酸酶降解。●35第十九章DNA复制、修复3.DNA促旋酶属DNA拓扑异构酶Ⅱ，可引入负超螺旋，消除复制叉前进时带来的扭曲张力。拓扑异构酶I使DNA的一条链发生断裂和再连接，反应无须供给能量，主要集中在活性转录区，与转录有关。拓扑异构酶Ⅱ使DNA的两条链同时断裂和再连接，当它引入超螺旋时需要由ATP供给能量。分布在染色质骨架蛋白和核基质部，与复制有关。●36第十九章DNA复制、修复4.DNA连接酶（ligase）连接双链DNA上的切口。大肠杆菌连接酶只能在模板上连接DNA缺口。T4DNAligase即可连接粘性末端的DNA，又可连接平齐末端的双链DNA。●37第十九章DNA复制、修复复制过程中各酶和蛋白质因子的作用38第十九章DNA复制、修复DNA的双螺旋解开合成RNA引物的过程。由拓扑异构酶松弛超螺旋，解螺旋酶解开双链，SSB（单链结合蛋白）结合到单链上使其稳定。引发体：引物合成酶与各种蛋白质因子（dnaB、dnaC）构成的复合体，负责RNA引物的合成。引发体沿着模板链3’→5’方向移动（与冈崎片段合成的方向正好相反，而与复制叉移动的方向相同），移到一定位置上即可引发RNA引物的合成。引物的合成方向也是5´→3´方向。●DNA复制起始39第十九章DNA复制、修复

引物合成引发体引导引物酶到达适当的位置合成引物。SSB40第十九章DNA复制、修复★大肠杆菌复制原点起始复制所需蛋白质：DnaA在原点处打开双螺旋DnaB使DNA解旋DnaCDnaB结合在原点所需Hu刺激起始引物酶（DnaG）合成RNA引物SSB结合单链DNARNA聚合酶促进DNaA活性DNA促旋酶松驰DNA扭曲应力41第十九章DNA复制、修复链的延长反应由DNApol.III催化。在DNA聚合酶催化下，以解开的单链为模板，以四种dNTP为原料，进行聚合作用。即新进入的dNTP与引物3´－OH形成磷酸二酯键，由5´3´方向延长子链。●DNA链的延长42第十九章DNA复制、修复5'3'3'5'5'解链方向3'冈崎片段(Okazakifragment)43第十九章DNA复制、修复前导链：合成方向与复制叉移动方向相同的子链DNA滞后链：复制方向与解链方向相反，须等解开足够长度的模板链才能继续复制，得到的子链由不连续的片段所组成。1968年，冈崎发现DNA复制中出现一些不连续的片段，称为冈崎片段。长度：细菌：1000-2000bp，相当于一个顺反子的大小。真核：100-200bp，约等于一个核小体DNA的长度。44第十九章DNA复制、修复45第十九章DNA复制、修复滞后链的合成合成方向与复制叉移动方向相反分段合成带有引物的冈崎片段引物酶的激活滞后链合成完后，引物的去除去除引物后缺口的填补冈崎片段之间的连接●46第十九章DNA复制、修复5′3′3′5′polⅠpolⅠ5′→3′外切酶活性水解引物polⅠ聚合活性填补空隙DNA连接酶连接缺口。47第十九章DNA复制、修复 1.原核生物在复制终止点的汇合

2.真核生物复制的终止●DNA合成的终止48第十九章DNA复制、修复细菌环状DNA，复制叉相遇即终止。单向复制的环形DNA，复制的终点就是起点。大肠杆菌的7个终止位点1原核生物在复制终止点的汇合49第十九章DNA复制、修复

真核生物复制的终止 染色体DNA呈线性，复制在末端停止。50第十九章DNA复制、修复端粒(telomere)真核生物染色体线性DNA分子末端的结构。 结构特点：

1.由末端单链DNA序列和蛋白质构成

2.末端DNA序列是多次重复的富含G、C

碱基的短序列功能：1.维持染色体的稳定性

2.维持DNA复制的完整性51第十九章DNA复制、修复端粒酶(telomerase)

特点：

1.由RNA和蛋白质构成的复合物

2.为特殊的逆转录酶，能以自身的RNA为模板逆转录合成端粒DNA功能： 合成端粒DNA，维持端粒的长度 52第十九章DNA复制、修复爬行模型：53第十九章DNA复制、修复染色体末端复制-端粒与端粒酶后随链中RNA引物的切除与gap产生及由端粒酶对DNA5’端的延长54第十九章DNA复制、修复端粒及端粒酶的意义：端粒的长短及端粒酶活性变化与细胞水平的老化(aging)及肿瘤的发生有一定关系。55第十九章DNA复制、修复端粒DNA的复制与细胞衰老端粒（telomeres）：是真核细胞染色体末端所特有的结构，一段DNA序列与蛋白质形成的一种复合体，。功能：⑴保证线性DNA的完整复制⑵保护染色体末端⑶决定细胞寿命，胚系细胞含端粒酶，体细胞不表达端粒酶。●56第十九章DNA复制、修复真核生物DNA的复制3核小体（nucleosome）真核生物染色质DNA是线性双螺旋，它缠绕在组蛋白的八聚体上形成核小体。57第十九章DNA复制、修复真核生物DNA复制的特点真核生物染色体DNA是多复制子，有多个复制起点，可以多点起始，分段进行复制。每个复制子大多在100-200bp之间，比细菌染色体DNA（单复制子）小得多。真核生物DNA复制叉移动的速度此原核的慢。（1000~3000bp/min）（50000bp/min）原核生物快速生长时，采用多复制叉复制。真核生物快速生长时，采用多起点复制。●58第十九章DNA复制、修复真核生物DNA聚合酶⑴DNA聚合酶α：多亚基，是真核DNA的复制酶。⑵DNA聚合酶β：主要在DNA损伤的修复中起作用。⑶DNA聚合酶γ：从线粒体得到，可能与线粒体DNA的复制有关。⑷DNA聚合酶δ：有3，→5，外切活力●55159第十九章DNA复制、修复反转录（reversetranscription）：以RNA为模板，合成DNA。与通常转录过程中遗传信息流从DNA到RNA的方向相反。反转录酶具有三种酶活力：（1）RNA指导的DNA聚合酶活力（以RNA为模板，形成RNA—DNA杂种分子）。（2）RNaseH酶活力，水解RNA—DNA杂种分子中的RNA。（3）DNA指导的DNA聚合酶活力。模板：RNA或DNA引物：RNA或DNA底物：dNTP二价阳离子：Mg2+或Mn2+反转录460第十九章DNA复制、修复反转录病毒的基因组结构（1）反转录病毒基因组通常由两条相同的（+）RNA链组成。5’端附近区域以氢键结合在一起，全长7-10Kb。（2）每一条RNA链的两端具有相同的序列，形成正向重复序列。（3）5’端有帽子结构，3’端有polyA，与真核mRNA相似。（4）5’端带有1分子的宿主tRNA，作为反转录时的引物。某些鸟类反转录病毒携带的是tRNAtrp，鼠类是tRNApro●61第十九章DNA复制、修复RNA病毒的反转录过程反转录病毒的生活周期（1）病毒粒子侵染细胞，病毒RNA和反转录酶一起进入细胞。（2）RNA被反转录成双链DNA（前病毒），环化，进入细胞核。（3）反转录病毒的DNA整合到宿主染色体DNA中。（4）前病毒DNA进行复制，转录出功能基因、基因组RNA和病毒蛋白。（5）基因组RNA和病毒蛋白在胞质中组装成新病毒粒子，转移到质膜，通过出芽方式释放新病毒粒子。●62第十九章DNA复制、修复反转录的生物学意义理论意义1.是Crick中心法则的补充2.为致癌RNA病毒、肝炎病毒防治提供基础3.真核生物细胞中也有逆转录酶存在（逆假基因、假基因）实践意义指导肿瘤的防治和药物设计应用于基因工程●63第十九章DNA复制、修复突变(mutation)：遗传物质结构改变而引起的遗传信息的改变，也称为DNA损伤(DNAdamage)。从分子水平来看，突变就是DNA分子上碱基的改变。自发突变、人工诱变突变的意义突变是进化、分化的分子基础只有基因型改变的突变致死性的突变突变是某些疾病的发病基础DNA的突变及修复564第十九章DNA复制、修复诱变剂：●65第十九章DNA复制、修复突变的类型：点突变：DNA错配碱基在复制后被固定下来，由原来的一个碱基对被另外一个碱基对所取代。移码突变：缺失和插入引起的三联体密码的阅读方式改变，造成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变。●66第十九章DNA复制、修复点突变(pointmutation)转换(transition)：发生在同型碱基之间的置换。两种嘌呤之间，两种碱基之间颠换(transversion)：发生在异型碱基之间的置换。一种嘌呤与一种嘧啶之间●67第十九章DNA复制、修复移码突变：正常 5´……GCA

GUA

CAU

GUC……

丙缬组缬缺失C5´……GAG

UAC

AUG

UC……

谷酪蛋丝●68第十九章DNA复制、修复DNA修复为了保证遗传信息的高度稳定性，生物细胞在进化过程中形成了一系列多步骤的修复机制。目前对DNA损伤和修复的研究还不多，仅限于辐射－生物反应方面。69第十九章DNA复制、修复一、切除修复1.碱基切除修复（baseexciserepair，BER）BER可以去除因脱氨基或碱基丢失，无氧射线辐射或内源性物质引起的环氮类的甲基化等因素产生的DNA损伤。BER是维持DNA稳定的重要修复方式，其步骤是N-糖苷键水解，从而切除发生变化的碱基。碱基释放过程是由DNA糖苷酶催化的。70第十九章DNA复制、修复71第十九章DNA复制、修复72第十九章DNA复制、修复2.核苷酸切除修复（nucleotideexciserepair,NER）NER可以修复UV照射形成的嘧啶二聚体以外，还能消除体内产生的各种嘌呤和嘧啶加合物。NER的关键特征是对损伤的DNA链的两端进行切割。NER在已研究过的真核生物中都很相似，说明其在进化过程中高度保守。73第十九章DNA复制、修复74第十九章DNA复制、修复75第十九章DNA复制、修复二、直接（回复）修复

直接修复即简单地把损伤的碱基回复到原来状态的修复，可分为以下几种：1.O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶直接修复

通过从O6-甲基鸟嘌呤上把甲基直接转移到酶的半胱氨酸残基上来直接回复DNA的损伤。76第十九章DNA复制、修复77第十九章DNA复制、修复2.光解酶复活酶学光复活过程是修复UV导致的环丁烷嘧啶二聚体的直接机制，这种修复具有高度的专一性。3.单链断裂修复DNA单链断裂是损伤的一种常见形式，可以通过DNA连接酶的重接而修复。78第十九章DNA复制、修复三、错配修复错配修复可以纠正几乎所有的错配。此外对于对于插入或删除引起的DNA遗传信息的改变也有作用。错配修复是以底物链上的信息为模板进行的，因此这个系统有区分底物链和新合成链的机制，细胞通过识别DNA链的甲基化状态来区分底物链和新合成的链。整个修复过程可以分为识别、切除和修补等步骤。79第十九章DNA复制、修复80第十九章DNA复制、修复81第十九章DNA复制、修复82第十九章DNA复制、修复四、交联修复链间交联是由多种多样的致癌剂和化疗药物等引起的。大肠杆菌和哺乳动物细胞内都存在这种修复机制，但细节还不清楚。五、双链断裂修复双链断裂（DSB）发生在体细胞重组和转座的生理条件下，也是电离辐射和氧化