肉制品中的微生物检测技术课件

接种及培养系列稀释一接种培养二目录页食品中菌落总数测定程序步骤接种及培养1.系列稀释：用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1mL，沿管壁缓慢注于盛有9mL稀释液的无菌试管中，振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1次1mL无菌吸管或吸头。

25ml1ml检样225ml生理盐水9ml生理盐水食品中菌落总数测定程序步骤接种及培养2.接种培养：选择2个～3个适宜稀释度的样品匀液，吸取1mL样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。同时，作空白对照。将46℃的平板计数琼脂培养基倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。凝固后的平板翻转，36℃±1℃培养48h±2h。菌落计数菌落总数的计算方法一菌落总数的报告二目录页菌落总数的计算方法一1.一个稀释度菌落数在计数范围内2.两个连续稀释度菌落数在计数范围内3.所有稀释度菌落数均大于300CFU4.所有稀释度菌落数均小于30CFU5.所有稀释度均无菌落生长6.所有稀释度均不在30～300CFU之间食品中菌落总数测定结果及报告菌落总数的计算方法1.只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每g（mL）样品中菌落总数结果。稀释度及菌落数空白对照菌落总数/[cfu/g（mL）]报告方式/[cfu/g（mL）]10-110-210-3多不可计120，12425，28

0

122001.2×104食品中菌落总数测定结果及报告菌落总数的计算方法2.有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内：稀释度及菌落数空白对照菌落总数/[cfu/g（mL）]报告方式/[cfu/g（mL）]10-110-210-3多不可计246，25045，49

0

268182.7×104食品中菌落总数测定结果及报告菌落总数的计算方法3.所有稀释度的平板上菌落数均大于300CFU：对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。稀释度及菌落数空白对照菌落总数/[cfu/g（mL）]报告方式/[cfu/g（mL）]10-110-210-3多不可计多不可计320

0

3200003.2×105食品中菌落总数测定结果及报告菌落总数的计算方法4.所有稀释度的平板菌落数均小于30CFU：应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。稀释度及菌落数空白对照菌落总数/[cfu/g（mL）]报告方式/[cfu/g（mL）]10-110-210-328121

0

2.8×102280食品中菌落总数测定结果及报告菌落总数的计算方法5.所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长：以小于1乘以最低稀释倍数计算。稀释度及菌落数空白对照菌落总数/[cfu/g（mL）]报告方式/[cfu/g（mL）]10-110-210-3000

0

<10<1×10食品中菌落总数测定结果及报告菌落总数的计算方法6.所有稀释度的平板菌落数均不在30CFU～300CFU之间：其中一部分小于30CFU或大于300CFU时，则以最接近30CFU或300CFU的平均菌落数乘以稀释倍数计算。稀释度及菌落数空白对照菌落总数/[cfu/g（mL）]报告方式/[cfu/g（mL）]10-110-210-3多不可计31015

0

3.1×10431000菌落总数的报告二1.菌落数小于100CFU2.菌落数小于100CFU3.所有平板上为蔓延菌落4.空白对照上有菌落生长5.单位报告食品中菌落总数测定结果及报告菌落总数的报告1.菌落数小于100CFU时，按“四舍五入”原则修约，以整数报告。2.菌落数大于或等于100CFU时，第3位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前2位数字，后面用0代替位数；也可用10的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后，采用两位有效数字。3.所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。

食品中菌落总数测定结果及报告菌落总数的报告4.空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。5.称重取样以CFU/g为单位报告，体积取样以CFU/mL为单位报告。稀释度及菌落数空白对照菌落总数/[cfu/g（mL）]报告方式/[cfu/g（mL）]10-110-210-3多不可计180，18440，42

3

无效培养基的制作加热溶解一包扎灭菌二目录页食品中菌落总数测定程序步骤培养基的制备1.加热溶解：平板计数琼脂（platecountagar，PCA）1.1成分胰蛋白胨5.0g酵母浸膏2.5g葡萄糖1.0g琼脂15.0g蒸馏水1000mLpH7.0±0.21.2制法将上述成分加于蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH。分装试管或锥形瓶，121℃高压灭菌15min。或直接将干粉加于蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH，分装于试管或锥形瓶。食品中菌落总数测定程序步骤培养基的制备2.包扎灭菌：121℃高压灭菌15min。无菌器材的准备检验设备的准备一无菌器皿的准备二目录页食品中菌落总数测定程序步骤无菌器材的准备1.检验设备的准备：恒温培养箱：36℃±1℃，30℃±1℃

恒温水浴箱：46℃±1℃感量为0.1g均质器振荡器菌落计数器食品中菌落总数测定程序步骤无菌器材的准备2.无菌器皿的准备：无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头。无菌锥形瓶：容量250mL、500mL。无菌培养皿：直径90mm。样品的制备固体和半固体样品的制备一液体样品的制备二目录页食品中菌落总数测定程序步骤样品的制备1.固体和半固体样品的制备：固体和半固体样品：称取25g样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000r/min～10000r/min均质1min～2min，或放入盛有225mL稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min，制成1:10的样品匀液。

食品中菌落总数测定程序步骤样品的制备2.液体样品的制备：以无菌吸管吸取25mL样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。菌落总数检测的方法菌落总数检测的依据一菌落总数检测的方法二目录页菌落总数的测定概述菌落总数检测的方法1.菌落总数检测的依据：食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定GB4789.2-2016菌落总数的测定概述菌落总数检测的方法2.菌落总数检测的方法

基本操作一般包括：样品的稀释－－倾注平皿－－培养48小时－－计数报告。菌落总数的测定，一般将被检样品制成几个不同的10倍递增稀释液，然后从每个稀释液中分别取出1mL置于灭菌平皿中与营养琼脂培养基混合，在一定温度下，培养一定时间后（一般为48小时），记录每个平皿中形成的菌落数量，依据稀释倍数，计算出每克（或每ml）原始样品中所含细菌菌落总数。菌落总数检测的意义菌落总数的定义一菌落总数的范围二

菌落总数检测的意义三目录页菌落总数检测的意义菌落总数的定义菌落总数的定义菌落总数（aerobicplatecount）是指食品检样经过处理，在一定条件下（如培养基、培养温度和培养时间等）培养后，所得每g（mL）检样中形成的微生物菌落总数。菌落总数检测的意义菌落总数的范围菌落总数的范围现标准规定的培养条件下所得结果，只包括一群在平板计数琼脂上生长发育的嗜中温性需氧或兼性厌氧菌的菌落总数，因此菌落总数并不表示实际中的所有微生物总数。菌落总数检测的意义菌落总数检测的意义1.作为食品被细菌污染程度即清洁状态的标志，对被检样品进行卫生学评价时提供依据。食品中细菌数量越多，说明被污染的程度就越严重，对人体健康威胁越大，即病原菌污染的可能性越大。它反映了食品加工、贮存、运输过程中是否符合卫生要求。菌落总数检测的意义菌落总数检测的意义2.用来预测食品耐存放程度或期限。一般讲，细菌数越少，食品耐放时间越长。例如用0℃保存牛肉，菌落总数为103cfu／cm2时，可保存18天，而当菌落总数增至l05cfu／cm2时则只能保存7天。食品中菌落总数测定标准（GB4789.2-2016)及解读器材的准备一培养基的制备二稀释液的准备三操作过程四计数报告五目录页菌落总数测定标准及解读菌落总数测定国标解读1.器材的准备：菌落总数测定标准及解读菌落总数测定国标解读1.器材的准备：菌落总数测定标准及解读菌落总数测定国标解读2.培养基的制备：培养基由营养琼脂改为平板计数琼脂，更加容易观察计数。菌落总数测定标准及解读菌落总数测定国标解读3.稀释液的准备：样品稀释液主要是无菌生理盐水，有的采用磷酸盐缓冲液，后者对食品已受损伤的细菌细胞有一定的保护作用。如对含盐量较高的食品（如酱油）进行稀释，可以采用灭菌蒸馏水。菌落总数测定标准及解读菌落总数测定国标解读4.操作步骤：菌落总数测定标准及解读菌落总数测定国标解读5.计数报告：沙门氏菌分离及培养分离一培养二目录页分离培养基三菌落特征四分离培养中的注意要点五一.分离

分别用直径3mm的接种环取增菌液1环,划线接种于一个BS琼脂平板和一个XLD琼脂平板(或HE琼脂平板或沙门氏菌属显色培养基平板),于36℃±1℃分别培养40h~48h(BS琼脂平板)或18h~24h(XLD琼脂平板、HE琼脂平板、沙门氏菌属显色培养基平板),观察各个平板上生长的菌落,各个平板上的菌落特征见表。二.培养

轻轻摇动培养过的样品混合物,移取1mL,转种于10mLTTB内,于42℃±1℃培养18h~24h。同时,另取1mL,转种于10mLSC内,于36℃±1℃培养18h~24h。二.培养

轻轻摇动培养过的样品混合物,移取1mL,转种于10mLTTB内,于42℃±1℃培养18h~24h。同时,另取1mL,转种于10mLSC内,于36℃±1℃培养18h~24h。二.培养

轻轻摇动培养过的样品混合物,移取1mL,转种于10mLTTB内,于42℃±1℃培养18h~24h。同时,另取1mL,转种于10mLSC内,于36℃±1℃培养18h~24h。三：分离培养基1.亚硫酸铋(BS)琼脂2.HE琼脂ektoenEntericAgar)3.木糖赖氨酸脱氧胆盐(XLD)琼脂1.亚硫酸铋(BS)琼脂（亚硫酸(铋BS)琼脂）成分蛋白胨10.0g牛肉膏5.0g葡萄糖5.0g硫酸亚铁0.3g磷酸氢二钠4.0g煌绿0.025g或5.0g/L水溶液5.0mL柠檬酸铋铵2.0g亚硫酸钠6.0g琼脂18.0g~20.0g蒸馏水1000mL制法将前三种成分加入300mL蒸馏水(制作基础液),硫酸亚铁和磷酸氢二钠分别加入20mL和30mL蒸馏水中,柠檬酸铋铵和亚硫酸钠分别加入另一20mL和30mL蒸馏水中,琼脂加入600mL蒸馏水中。然后分别搅拌均匀,煮沸溶解。冷至80℃左右时,先将硫酸亚铁和磷酸氢二钠混匀,倒入基础液中,混匀。将柠檬酸铋铵和亚硫酸钠混匀,倒入基础液中,再混匀。调节pH至7.5±0.2,随即倾入琼脂液中,混合均匀,冷至50℃~55℃。加入煌绿溶液,充分混匀后立即倾注平皿。

注:本培养基不需要高压灭菌,在制备过程中不宜过分加热,避免降低其选择性,贮于室温暗处,超过48h会降低其选择性,本培养基宜于当天制备,第二天使用。2.HE琼脂(HektoenEntericAgar)成分蛋白胨12.0g牛肉膏3.0g乳糖12.0g蔗糖12.0g水杨素2.0g胆盐20.0g氯化钠5.0g琼脂18.0g~20.0g蒸馏水1000mL0.4%溴麝香草酚蓝溶液16.0mLAndrade指示剂20.0mL甲液20.0mL乙液20.0mL制法将前面七种成分溶解于400mL蒸馏水内作为基础液;将琼脂加入于600mL蒸馏水内。然后分别搅拌均匀,煮沸溶解。加入甲液和乙液于基础液内,调节pH至7.5±0.2。再加入指示剂,并与琼脂液合并,待冷至50℃~55℃倾注平皿。注:①本培养基不需要高压灭菌,在制备过程中不宜过分加热,避免降低其选择性。②甲液的配制：硫代硫酸钠34.0g柠檬酸铁铵4.0g蒸馏水100mL③乙液的配制：去氧胆酸钠10.0g蒸馏水100mL④Andrade指示剂：酸性复红0.5g1mol/L氢氧化钠溶液16.0mL蒸馏水100mL将复红溶解于蒸馏水中,加入氢氧化钠溶液。数小时后如复红褪色不全,再加氢氧化钠溶液1mL~2mL。3.木糖赖氨酸脱氧胆盐(XLD)琼脂（木糖赖氨酸脱氧胆盐(XLD)琼脂）成分酵母膏3.0gL-赖氨酸5.0g木糖3.75g乳糖7.5g蔗糖7.5g去氧胆酸钠2.5g柠檬酸铁铵0.8g硫代硫酸钠6.8g氯化钠5.0g琼脂15.0g酚红0.08g蒸馏水1000mL制法除酚红和琼脂外,将其他成分加入400mL蒸馏水中,煮沸溶解,调节pH至7.4±0.2。另将琼脂加入600mL蒸馏水中,煮沸溶解。将上述两溶液混合均匀后,再加入指示剂,待冷至50℃~55℃倾注平皿。注:本培养基不需要高压灭菌,在制备过程中不宜过分加热,避免降低其选择性,贮于室温暗处。本培养基宜于当天制备,第二天使用。四、菌落特征表1沙门氏菌属在不同选择性琼脂平板上的菌落特征

选择性琼脂平板沙门氏菌BS琼脂（36℃±1℃40h～48h）菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色，菌落周围培养基可呈黑色或棕色；有些菌株形成灰绿色的菌落，周围培养基不变。HE琼脂（36℃±1℃18h～24h）蓝绿色或蓝色，多数菌落中心黑色或几乎全黑色；有些菌株为黄色，中心黑色或几乎全黑色。XLD琼脂（36℃±1℃18h～24h）菌落呈粉红色，带或不带黑色中心，有些菌株可呈现大的带光泽的黑色中心，或呈现全部黑色的菌落；有些菌株为黄色菌落，带或不带黑色中心。

l沙门氏菌菌落形态：黑色有金属光泽、棕褐色或灰色，菌落周围培养基可呈黑色或棕色；有些菌株形成灰绿色的菌落，周围培养基不变。lHE琼脂：在保证细菌所需营养的基础上，加入了一些抑制剂，如：胆盐、柠檬酸盐、去氧胆酸钠等，可抑制某些肠道致病菌和革兰氏阳性菌的生长，但对革兰氏染色阴性的肠道致病菌则无抑制作用。l沙门氏菌在HE琼脂上的菌落形态：蓝绿 色或蓝色，多数菌落中心黑色或几乎全黑 色；有些菌株为黄色，中心黑色或几乎全 黑色。lXLD琼脂：粉红色，带或不带黑色中心，有 些菌株可呈现大的带光泽的黑色中心，或呈现 全部黑色的菌落；有些菌株为黄色菌落，带或 不带黑色中心。lXLD培养基分离沙门氏菌和志贺氏菌的敏感 性超过了传统培养基，如：EMB、SS。因这 些培养基尚有抑制志贺氏菌属生长的潜在因 素，故本培养 基是分离鉴定 沙门氏菌及志 贺氏菌属的可 靠培养基。在国外广泛使用。五.分离培养中的注意要点

非典型的沙门氏菌菌落形态：不存在典型或可疑沙门氏菌菌落时，按如下步骤检验非典型的沙门氏菌菌落。

HE和XLD琼脂：非典型的沙门氏菌在HE和XLD琼脂上呈黄色菌落，带或不带黑色中心。HE和XLD平板经24±2h培养后，有典型的沙门氏菌菌落，则挑取2个或更多个非典型的沙门氏菌菌落。显色琼脂另外。五.分离培养中的注意要点

BS琼脂：某些非典型菌株产生绿色菌落， 其周围培养基稍微或不呈暗色。如果BS平板培养24±2h后，没有出现典型菌落，则不挑取任何菌落，让平板继续培养24±2h。 如果经48±2h培养后，仍没有典型或可疑 的菌落出现，则挑取2个或更多个非典型的菌落。沙门氏菌检测结果与报告记录一报告二检验后样品处理三目录页原始记录单四检测报告单五报告说明六（记录与报告）记录检验过程中应即时、客观地记录观察到的现象、结果和数据等信息。报告实验室应按照检验方法中规定的要求，准确、客观地报告检验结果。（结果与报告）检验后样品的处理1.检验结果报告后，被检样品方能处理。2.检出致病菌的样品要经过无害化处理。3.检验结果报告后，剩余样品和同批产品不进行微生物项目的复检。样品编号

样品名称

检验依据GB4789.4-2010检验环境温度℃湿度%RH检验日期

仪器设备名称、规格、精度、编号电子天平:YP-10020.01g105有计量合格标识，并在检定有效期内.恒温培养箱:DH60000.1℃88有计量合格标识，并在检定有效期内.样品复苏_月__日_____无菌操作，将待检样品磁珠置于10mL无菌营养肉汤中37℃温育24h复苏。前增菌__月__日_____按无菌操作取待检肉汤1mL，加入到10mLBPW增菌液中，充分混匀，于36±1℃培养4h。增菌__月__日_____取1mLBPW增菌液，转种于10mLSC增菌液中，于36±1℃培养18~24h。检验项目现象结果分离培养BS琼脂平板要求36±1℃，40h-48h

培养___日

时至__日____时。

HE琼脂平板要求36±1℃，18h-24h

培养___日___时至__日____时。

____显色平板要求36±1℃，18h-24h

培养___日___时至__日____时。

生化试验三糖铁琼脂要求36±1℃，18h-24h

培养___日___时至__日____时。

普通琼脂平板要求36±1℃，18h-24h

培养___日___时至__日____时。

赖氨酸脱羧酶试验

API20E生化试剂盒要求36±1℃，18h-24h编码结果培养___日___时至__日____时。

血清学鉴定实验结果样品中沙门氏菌备注

检验者：审核者：年月日

（原始记录单）（检测报告单）检测报告防（食）检字（2017）第号共2页，第1页检品名称检测类别送检单位样品编号生产厂家检测目的卫生质量生产日期检品数量5点包装情况管装采样日期采样地点东盛伊思德食品检品状态液体送检日期检测项目沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌共3项检测结果：检品名称沙门氏菌结论及评价：不评价本栏以下空白。报告编制：签发：盖章校对：二〇一七年三月十二日报告书包括正文和附页，并盖有计量认证章、检测章和骑缝章。检测报告书附页（食）防检字（2008）第号共2页，第2页检测及评价依据：GB/T4789.1-2016食品卫生微生物学检验沙门氏菌检验评价指标：项目名称化学描述及单位评价指标沙门氏菌不得检出检测环境条件：温度：20℃相对湿度：40%气压：101.30kPa主要检测仪器设备：结果与报告综合以上生化试验和血清学鉴定的结果,报告25g(mL)样品中检出或未检出沙门氏菌。（报告书说明）一、对检测结果如有异议，请于收到报告之日起15日内向本站提出。二、委托检测，系委托者自带检品送检，本站不对检品来源负责。检测结果，仅对送检检品负责，不得做鉴定、评优、审批及商品宣传用。三、监督检测，系按有关法规进行的监督性检测。四、鉴定检测，系对新产品、新工艺、新资源的卫生质量检测。五、未经实验室书面批准，不得复制检验证书或报告。六、本报告书改动无效。沙门氏菌检测前的准备设备和材料二培养基和试剂三熟悉检验程序四样品采集五目录页GB4789.4—2016说明一本标准代替GB4789.4—2010《食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验》、SN0170—1992《出口食品沙门氏菌属(包括亚利桑那菌)检验方法》、SN/T2552.5—2010《乳及乳制品卫生微生物学检验方法第5部分:沙门氏菌检验》。整合后的标准与GB4789.4—2010相比,主要变化如下:———修改了检测流程和血清学检测操作程序;———修改了附录A和附录B。本标准规定了食品中沙门氏菌(Salmonella)的检验方法。本标准适用于食品中沙门氏菌的检验1.GB4789.4—2016说明（GB4789.4—2016说明）2.设备和材料2.1冰箱:2℃~5℃。2.2恒温培养箱:36℃±1℃,42℃±1℃。2.3均质器。2.4振荡器。2.5电子天平:感量0.1g。2.6无菌锥形瓶:容量500mL,250mL。2.7无菌吸管:1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器及吸头。2.8无菌培养皿:直径60mm,90mm。2.9无菌试管:3mm×50mm、10mm×75mm。2.10pH计或pH比色管或精密pH试纸。2.11全自动微生物生化鉴定系统。2.12无菌毛细管。3.培养基和试剂3.1缓冲蛋白胨水(BPW)。3.2四硫磺酸钠煌绿(TTB)增菌液。3.3亚硒酸盐胱氨酸(SC)增菌液。3.4亚硫酸铋(BS)琼脂。3.5HE琼脂。3.6木糖赖氨酸脱氧胆盐(XLD)琼脂。3.7沙门氏菌属显色培养基。3.8三糖铁(TSI)琼脂。3.9蛋白胨水、靛基质试剂。3.10尿素琼脂(pH7.2)。3.11氰化钾(KCN)培养基。3.12赖氨酸脱羧酶试验培养基。3.13糖发酵管。3.14邻硝基酚β-D半乳糖苷(ONPG)培养基。3.15半固体琼脂。3.16丙二酸钠培养基。3.17沙门氏菌O、H和Vi诊断血清。3.18生化鉴定试剂盒。4.熟悉检验程序5.样品采集三5.1采样原则5.2采样方案5.3采样方法5.4采集样品的标记5.5采集样品的贮存和运输5.1样品采集原则5.1.1样品的采集应遵循随机性、代表性的原则。5.1.2采样过程遵循无菌操作程序,防止一切可能的外来污染。5.2样品采集方案5.2.1根据检验目的、食品特点、批量、检验方法、微生物的危害程度等确定采样方案。5.2.2采样方案分为二级和三级采样方案。二级采样方案设有n、c和m值,三级采样方案设有n、c、m和M值。n:同一批次产品应采集的样品件数;c:最大可允许超出m值的样品数;m:微生物指标可接受水平限量值(三级采样方案)或最高安全限量值(二级采样方案);M:微生物指标的最高安全限量值。5.2.3各类食品的采样方案按食品安全相关标准的规定执行。5.2.4食品安全事故中食品样品的采集:a)由批量生产加工的食品污染导致的食品安全事故,食品样品的采集和判定原则按3.2.2和3.2.3执行。重点采集同批次食品样品。b)由餐饮单位或家庭烹调加工的食品导致的食品安全事故,重点采集现场剩余食品样品,以满足食品安全事故病因判定和病原确证的要求。5.3采样方法5.3.1预包装食品5.3.1.1应采集相同批次、独立包装、适量件数的食品样品,每件样品的采样量应满足微生物指标检验的要求。5.3.1.2独立包装小于、等于1000g的固态食品或小于、等于1000mL的液态食品,取相同批次的包装。5.3.1.3独立包装大于1000mL的液态食品,应在采样前摇动或用无菌棒搅拌液体,使其达到均质后采集适量样品,放入同一个无菌采样容器内作为一件食品样品;大于1000g的固态食品,应用无菌采样器从同一包装的不同部位分别采取适量样品,放入同一个无菌采样容器内作为一件食品样品。5.3.2散装食品或现场制作食品用无菌采样工具从n个不同部位现场采集样品,放入n个无菌采样容器内作为n件食品样品。每件样品的采样量应满足微生物指标检验单位的要求。5.4采集样品的标记采样标记样品名称采样地点采样时间采样数量样品编号采样方法、采样人5.5采集样品的贮存和运输5.5.1应尽快将样品送往实验室检验。5.5.2应在运输过程中保持样品完整。5.5.3应在接近原有贮存温度条件下贮存样品,或采取必要措施防止样品中微生物数量的变化。沙门氏菌检测生化试验三糖铁琼脂试验一赖氨酸脱羧酶试验二靛基质试验（吲哚试验）三目录页尿素酶试验四氰化钾试验（KCN）五本试验可同时观察乳糖和蔗糖发酵产酸或产酸产气（变黄）；产生硫化氢（变黑）。葡萄糖被分解产酸可使斜面先变黄，但因量少，生成的少量酸，因接触空气而氧化，加之细菌利用培养基中含氮物质，生成碱性产物，故使斜面后来又变红，底部由于是在厌氧状态下，酸类不被氧化，所以仍保持黄色。a.uninoculated

b.littlechange/alkaline/-/-

c.alkaline/acid/-/+

d.acid/acid/+/+

e.acid/acid/+/-

slantcolor/buttcolor/gasproduction/hydrogensulfideproduction制好的培养基对照管斜面红色，底面黄色培养基全黄色斜面、底部黄色，并产生H2S斜面红色，底部黑色，产生H2S底面黄色，并产生CO2培养基变黑三糖铁琼脂培养基中亦含有硫代硫酸钠，若微生物有硫化氢产生，会与亚铁离子作用生成不溶性硫化亚铁之沉淀，进而使培养基变黑。三糖铁琼脂及赖氨酸脱羧酶试验（三糖铁及赖氨酸脱羧酶试验）自选择性琼脂平板上分别挑取2个以上典型或可疑菌落,接种三糖铁琼脂,先在斜面划线,再于底层穿刺;接种针不要灭菌,直接接种赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板,于36℃±1℃培养18h~24h,必要时可延长至48h。在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内,沙门氏菌属的反应结果见表2。三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内,沙门氏菌属的反应结果注：本试验的阳性反应为培养基不改变颜色，而培养基变黄色者为阴性反应。本试验一定要设空白对照。培养基需用液体石蜡封盖，阻止空气的氧化作用。赖氨酸脱羧酶试验靛基质（吲哚）试验尿素酶试验

阴性（黄）阳性（红）氰化钾试验l氰化钾试验培养基：蛋白胨、磷酸盐缓冲液、氯化钠、氰化钾。l原理：氰化钾是剧毒药物，可抑制某些细菌的呼吸酶系统，使这些酶失去活性，细菌的生长因此受到抑制。而某些细菌可对氰化钾产生抗性，能在氰化钾培养中生长。本试验常用于沙门氏菌与柠檬酸杆菌的鉴定。l沙门氏菌生长情况：阴性（不生长）。注：本试验必需设置对照管（不加氰化钾），若对照管细菌生长良好，试验管细菌不生长，可判定为阴性。若对照管与试验管均无细菌生长，则应重复试验。试验失败的主要原因是封口不严，氰化钾逐渐分解，生成氢氰酸气体逸出，以致药物浓度降低细菌生长，呈假阳性反应。鉴定结果注：反应序号A1:典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、KCN和赖氨酸脱羧酶3项中有1项异常,按表4可判定为沙门氏菌。如有2项异常为非沙门氏菌。补做试验反应序号A2:补做甘露醇和山梨醇试验,沙门氏菌靛基质阳性变体两项试验结果均为阳性,但需要结合血清学鉴定结果进行判定。反应序号A3:补做ONPG。ONPG阴性为沙门氏菌,同时赖氨酸脱羧酶阳性,甲型副伤寒沙门氏菌为赖氨酸脱羧酶阴性。必要时按表5进行沙门氏菌生化群的鉴别。

说明

如选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统,可根据5.4.1的初步判断结果,从营养琼脂平板上挑取可疑菌落,用生理盐水制备成浊度适当的菌悬液,使用生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统进行鉴定。冷冻样品解冻需在45℃以下，有自动调温器自控的水浴锅内不断搅拌进行15min或在2-8℃，18小时内软化。为保证检验的准确性，必须在选择性培养基上挑取足够数量的菌落进行生化和血清学鉴定。进行生化反应时，应以纯培养物进行试验，如出现血清学阳性，而生化反应特征不符合时，应对接种物进行纯化，用纯化后的培养物重新进行生化试验。测试中应同时接种阳性对照菌株。

沙门氏菌检验——几点注意沙门氏菌检测血清学分型血清分型一抗原介绍二血清学凝集试验原理三血清学凝集试验四目录页（血清分型）血清分型

沙门氏菌抗原结构是分类的重要依据。其抗原可分为菌体抗原(O抗原)、鞭毛抗原(H抗原)和表面抗原(Vi抗原)三种。该类菌，按菌体抗原结构的不同，可分为A、B、C、D、E、F、G、H、I等血清群，再按鞭毛抗原的不同而鉴别组内的各血清型。目前，已知沙门氏菌共有2000多种血清型，在我国已发现有161个血清型，但从人类和动物经常分离出的血清型却只有40～50种，其中仅有10种是主要血清型。与人类有关的血清型主要隶属于A～E组，即伤寒杆菌、甲、乙、丙型副伤寒杆菌、鼠伤寒杆菌、猪霍乱杆菌、肠炎杆菌、鸭沙门氏菌、新港沙门氏菌等，仅少数几种对人致病，其中以鼠伤寒杆菌、肠炎杆菌及猪霍乱沙门菌为最常见。沙门氏菌抗原介绍O抗原

为脂多糖，性质稳定。能耐100℃达数小时，不被乙醇或0.1%石炭酸破坏。决定o型原特异性的是脂多糖中的多糖侧链部分，以1、2、3等阿拉伯数字表示。例如乙型副伤寒杆菌有4、5、12三个。鼠伤寒杆菌有1、4、5、12四个；猪霍乱杆菌有6、7二个。其中有些o抗原是几种菌所共有，如4、5为乙型副伤寒杆菌和鼠伤寒杆菌共有，将具有共同o抗原沙门氏菌归为一组，这样可将沙门杆氏菌属分为a～z、o51～o63、o65～o67共有42组。中国已发现26个菌组、161个血清型。使人类致病的沙门氏杆菌大多属于a～e组。o抗原刺激机体主要产生lgm抗体H抗原

为蛋白质，对热不稳定，60℃经15分钟或乙醇处理被破坏。具有鞭毛的细菌经甲醇液固定后，其o抗原全部被h抗原遮盖，而不能与相应抗o抗体反应。h抗原的特异性取决于多肽链上氨基酸的排列顺序和空间构型。沙门氏杆菌的h抗原有两种，称为第1相和第2相。第1相特异性高，又称特异相，用a、b、c等表示，第2相特异性低，为数种沙门氏杆菌所共有，也称非特异相，用1、2、3等表示。具有第1相和第2相h抗原的细菌称为双相菌，仅有一相者称单相菌。每一组沙门氏杆菌根据h抗原不同，可进一步分种或型。h抗原刺激机体主要产生lgg抗体。

沙门氏菌抗原介绍沙门氏菌抗原介绍vi抗原

因与毒力有关而命名为vi抗原。由聚-n-乙酰-d-半乳糖胺糖醛酸组成。不稳定，经60℃加热、石碳酸处理或人工传代培养易破坏或丢失。新从患者标本中分离出的伤寒杆菌、丙型副伤寒杆菌等有此抗原。vi抗原存在于细菌表面，可阻止o抗原与其相应抗体的反应。vi抗原的抗原性弱。当体内菌存在时可产生一定量抗体；细菌被清除后，抗体也随之消失。故测定vi抗体有助于对伤寒带菌者的检出。血清学凝集试验原理

颗粒性抗原（如细胞、红细胞等）与相应抗体结合，在电解质参与下所形成肉眼可见的凝集现象，称为凝集反应。其中抗原为凝集原，抗体称为凝集素。玻片凝集法是一种定性试验方法，其原理是用已知抗体来检测未知抗原，常用于鉴定菌种、血型。95%以上的沙门菌属于A~F6个O群，常见的菌型在二十个左右，所以选用O多价A-I血清。血清学凝集试验沙门氏菌血清学菌体（O）试验（用已知沙门氏菌培养物同所有抗血清做予试验）。

a、多价菌体（O）试验：

用A~F多价O血清做玻片凝集试验,同时用生理盐水做对照。在生理盐水中自凝者为粗糙型菌株,不能分型。被A~F多价O血清凝集者,依次用O4;O3、O10;O7;O8;O9;O2和O11因子血清做凝集试验。根据试验结果,判定O群。被O3、O10血清凝集的菌株,再用O10、O15、O34、O19单因子血清做凝集试验,判定E1、E4各亚群,每一个O抗原成分的最后确定均应根据O单因子血清的检查结果,没有O单因子血清的要用两个O复合因子血清进行核对。不被A~F多价O血清凝集者,先用9种多价O血清检查,如有其中一种血清凝集,则用这种血清所包括的O群血清逐一检查,以确定O群。

血清学凝集试验

每种多价O血清所包括的O因子如下:O多价1A,B,C,D,E,F群(并包括6,14群)O多价213,16,17,18,21群O多价328,30,35,38,39群O多价440,41,42,43群O多价544,45,47,48群O多价650,51,52,53群O多价755,56,57,58群O多价859,60,61,62群O多价963,65,66,67群血清学凝集试验

b、H抗原的鉴定

属于A~F各O群的常见菌型,依次用表6所述H因子血清检查第1相和第2相的H抗原。血清学凝集试验

不常见的菌型,先用8种多价H血清检查,如有其中一种或两种血清凝集,则再用这一种或两种血清所包括的各种H因子血清逐一检查,以第1相和第2项的H抗原。8种多价H血清所包括的H因子如下:H多价1a,b,c,d,iH多价2eh,enx,enz15,fg,gms,gpu,gp,gq,mt,gz51H多价3k,r,y,z,z10,lv,lw,lz13,lz28,lz40H多价41,2;1,5;1,6;1,7;z6H多价5z4z23,z4z24,z4z32,z29,z35,z36,z38H多价6z39,z41,z42,z44H多价7z52,z53,z54,z55H多价8z56,z57,z60,z61,z62血清学凝集试验

每种多价O血清所包括的O因子如下:O多价1A,B,C,D,E,F群(并包括6,14群)O多价213,16,17,18,21群O多价328,30,35,38,39群O多价440,41,42,43群O多价544,45,47,48群O多价650,51,52,53群O多价755,56,57,58群O多价859,60,61,62群O多价963,65,66,67群每一个H抗原成分的最后确定均应根据H单因子血清的检查结果,没有H单因子血清的要用两个H复合因子血清进行核对。检出第1相H抗原而未检出第2相H抗原的或检出第2相H抗原而未检出第1相H抗原的,可在琼脂斜面上移种1代~2代后再检查。如仍只检出一个相的H抗原,要用位相变异的方法检查其另一个相。单相菌不必做位相变异检查。血清学凝集试验简易平板法:

将0.35%~0.4%半固体琼脂平板烘干表面水分,挑取因子血清1环,滴在半固体平板表面,放置片刻,待血清吸收到琼脂内,在血清部位的中央点种待检菌株,培养后,在形成蔓延生长的菌苔边缘取菌检查。位相变异试验方法小玻管法:

将半固体管(每管约1mL~2mL)在酒精灯上溶化并冷至50℃,取已知相的H因子血清0.05mL~0.1mL,加入于溶化的半固体内,混匀后,用毛细吸管吸取分装于供位相变异试验的小玻管内,待凝固后,用接种针挑取待检菌,接种于一端。将小玻管平放在平皿内,并在其旁放一团湿棉花,以防琼脂中水分蒸发而干缩,每天检查结果,待另一相细菌解离后,可以从另一端挑取细菌进行检查。位相变异试验方法API20E第1位数第2位数第3位数第4位数第5位数第6位数第7位数结果判定ONPGADHLDCODCCITH2SURETDAINDVPGELGLUMANINOSORRGASACMELAMYARAOX124124124124124124124反应结果-+++++-----+++++-+-+-沙门氏菌应得树枝024124000004124104020组合编码6704752小倒管法:将两端开口的小玻管(下端开口要留一个缺口,不要平齐)放在半固体管内,小玻管的上端应高出于培养基的表面,灭菌后备用。临用时在酒精灯上加热溶化,冷至50℃,挑取因子血清1环,加入小套管中的半固体内,略加搅动,使其混匀,待凝固后,将待检菌株接种于小套管中的半固体表层内,每天检查结果,待另一相细菌解离后,可从套管外的半固体表面取菌检查,或转种1%软琼脂斜面,于36℃培养后再做凝集试验。。位相变异试验方法血清学凝集试验

CVi抗原的鉴定用Vi因子血清检查。已知具有Vi抗原的菌型有:伤寒沙门氏菌,丙型副伤寒沙门氏菌,都柏林沙门氏菌。血清学凝集试验

D

菌型的判定根据血清学分型鉴定的结果,按照附录B或有关沙门氏菌属抗原表判定菌型。沙门氏菌检测血清学鉴定实验目的及原理一实验材料二沙门氏菌血清特性三实验方法四结果判断五目录页（实验目的及原理）实验目的及原理

实验目的：

掌握细菌的血清学鉴定法。

实验原理：根据抗原抗体反应具有高度特异性的特点，用已知抗体来检测未知抗原（细菌）。实验材料1.菌种待检细菌2.试剂多价沙门菌O(A-F)诊断血清3.其他载玻片血清学特性---O抗原沙门氏菌具有复杂的抗原结构。虽然沙门氏菌具有O、H、K和其它表面物质(如菌毛)四种抗原，但只有O抗原是每个菌株均有的成分。O抗原（菌体抗原）*存在于菌体表面，为脂多糖，多糖部分决定其特异性，*O抗原耐热(100℃、2.5h或121℃、2h加热均不破坏其抗原性)，其特异性不易丧失或变异。*一个菌体具有一种或多种不同的O抗原。血清学特性---H抗原H抗原（鞭毛抗原）*H抗原存在于鞭毛中，不耐热，化学成分蛋白质，其抗原性可以被酒精所破坏。*H抗原可分为两相:第1相：为特异相，用小写英文字母表示，a～z，Z以后则从z1、z2……，已编到z83。第2相：为非特异相以阿拉伯数字表示，共7种。具有第1相和第2相H抗原的细菌称为双相菌，大多数沙门氏菌属于此；仅有一相者称单相菌，如肠炎沙门氏菌。极少数无鞭毛菌两相抗原都不具有，称为无相菌，如鸡白痢沙门氏菌。血清学特性---Vi抗原Vi抗原（包膜抗原）少数菌沙门氏菌中尚有一种表面包膜抗原，功能与大肠杆菌的K抗原类同，因一般认为它与毒力(Virulence)有关，故称Vi抗原。经过几次传代、60℃热处理或石炭酸处理后容易消失。实验方法——检查培养物有无自凝性

一般采用1.2%~1.5%琼脂培养物作为玻片凝集试验用的抗原。首先排除自凝集反应,在洁净的玻片上滴加一滴生理盐水,将待试培养物混合于生理盐水滴内,使成为均一性的混浊悬液,将玻片轻轻摇动30s~60s,在黑色背景下观察反应(必要时用放大镜观察),若出现可见的菌体凝集,即认为有自凝性,反之无自凝性。对无自凝的培养物参照下面方法进行血清学鉴定。实验方法——多价菌体抗原(O)鉴定

在玻片上划出2个约1cm×2cm的区域,挑取1环待测菌,各放1/2环于玻片上的每一区域上部,在其中一个区域下部加1滴多价菌体(O)抗血清,在另一区域下部加入1滴生理盐水,作为对照。再用无菌的接种环或针分别将两个区域内的菌苔研成乳状液。将玻片倾斜摇动混合1min,并对着黑暗背景进行观察,任何程度的凝集现象皆为阳性反应。O血清不凝集时,将菌株接种在琼脂量较高的(如2%~3%)培养基上再检查;如果是由于Vi抗原的存在而阻止了O凝集反应时,可挑取菌苔于1mL生理盐水中做成浓菌液,于酒精灯火焰上煮沸后再检查。结果判断沙门氏菌O多价血清凝集试验

左为阳性

右为阴性对照实验方法——多价鞭毛抗原(H)鉴定多价鞭毛抗原(H)鉴定操作同抗原（0）鉴定。H抗原发育不良时,将菌株接种在0.55%~0.65%半固体琼脂平板的中央,待菌落蔓延生长时,在其边缘部分取菌检查;或将菌株通过接种装有0.3%~0.4%半固体琼脂的小玻管1次~2次,自远端取菌培养后再检查。沙门氏菌检测样品处理及预增菌样品处理一预增菌二预增菌培养基三目录页1.样品处理

无菌操作称取25g(mL)样品,置于盛有225mLBPW的无菌均质杯或合适容器内,以8000r/min~10000r/min均质1min~2min,或置于盛有225mLBPW的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打1min~2min。若样品为液态,不需要均质,振荡混匀。如需调整pH,用1mol/mL无菌NaOH或HCl调pH至6.8±0.2。2.预增菌

预增菌使食品加工过程中受伤的沙门菌细胞恢复活力，未经加工过的食品，检验前不需要前增菌。

无菌操作将样品转至500mL锥形瓶或其他合适容器内(如均质杯本身具有无孔盖,可不转移样品),如使用均质袋,可直接进行培养,于36℃±1℃培养8h~18h。如为冷冻产品,应在45℃以下不超过15min,或2℃~5℃不超过18h解冻。3.预增菌培养基——缓冲蛋白胨水(BPW)（预增菌培养）基）3.1成分蛋白胨10.0g氯化钠5.0g磷酸氢二钠(含12个结晶水)9.0g磷酸二氢钾1.5g蒸馏水1000mL3.2制法将各成分加入蒸馏水中,搅混均匀,静置约10min,煮沸溶解,调节pH至7.2±0.2,高压灭菌121℃,15min。沙门氏菌检测增菌及培养增菌目的及原则一增菌培养基配制二增菌三目录页培养四沙门氏菌菌落特征五1.增菌目的及原则

选择性增菌的目的是最大可能的检出沙门氏菌，原则上必须使用两种选择性分离增菌液，一种是抑制除沙门氏菌以外其肠道菌的生长，一种是在不影响其他肠道菌生长的情况下促进沙门氏菌的生长。2.增菌培养基配制四硫磺酸钠煌绿(TTB)增菌液亚硒酸盐胱氨酸(SC)增菌液四硫磺酸钠煌绿(TTB)增菌液（四硫磺酸钠煌绿(TTB)增菌液））(1)基础液蛋白胨10.0g牛肉膏5.0g氯化钠3.0g碳酸钙45.0g蒸馏水1000mL除碳酸钙外,将各成分加入蒸馏水中,煮沸溶解,再加入碳酸钙,调节pH至7.0±0.2,高压灭菌121℃,20min。四硫磺酸钠煌绿(TTB)增菌液（四硫磺酸钠煌绿(TTB)增菌液）(2)硫代硫酸钠溶液硫代硫酸钠(含5个结晶水)50.0g蒸馏水加至100mL高压灭菌121℃,20min。四硫磺酸钠煌绿(TTB)增菌液(3)碘溶液碘片20.0g碘化钾25.0g蒸馏水加至100mL将碘化钾充分溶解于少量的蒸馏水中,再投入碘片,振摇玻瓶至碘片全部溶解为止,然后加蒸馏水至规定的总量,贮存于棕色瓶内,塞紧瓶盖备用。（四硫磺酸钠煌绿(TTB)增菌液））四硫磺酸钠煌绿(TTB)增菌液(4)0.5%煌绿水溶液煌绿0.5g蒸馏水100mL溶解后,存放暗处,不少于1d,使其自然灭菌。（四硫磺酸钠煌绿(TTB)增菌液））四硫磺酸钠煌绿(TTB)增菌液(5)牛胆盐溶液牛胆盐10.0g蒸馏水100mL加热煮沸至完全溶解,高压灭菌121℃,20min。（四硫磺酸钠煌绿(TTB)增菌液））四硫磺酸钠煌绿(TTB)增菌液(6)制法基础液900mL硫代硫酸钠溶液100mL碘溶液20.0mL煌绿水溶液2.0mL牛胆盐溶液50.0mL临用前,按上列顺序,以无菌操作依次加入基础液中,每加入一种成分,均应摇匀后再加入另一种成分。（四硫磺酸钠煌绿(TTB)增菌液））亚硒酸盐胱氨酸(SC)增菌液（亚硒酸盐胱氨酸(SC)增菌液）(1)成分蛋白胨5.0g乳糖4.0g磷酸氢二钠10.0g亚硒酸氢钠4.0gL-胱氨酸0.01g蒸馏水1000mL亚硒酸盐胱氨酸(SC)增菌液（2）制法除亚硒酸氢钠和L-胱氨酸外,将各成分加入蒸馏水中,煮沸溶解,冷至55℃以下,以无菌操作加入亚硒酸氢钠和1g/LL-胱氨酸溶液10mL(称取0.1gL-胱氨酸,加1mol/L氢氧化钠溶液15mL,使溶解,再加无菌蒸馏水至100mL即成,如为DL-胱氨酸,用量应加倍)。摇匀,调节pH至7.0±0.2。（亚硒酸盐胱氨酸(SC)增菌液）

（TTB)增菌液培养基允许沙门氏菌持续增菌，同时阻止大多数其他细菌的增殖。未经加工的食品不必经过前增菌而直接增菌选择性平板分离：采用固体选择培养基，抑制非沙门氏菌的生长，提供肉眼可见的疑似沙门氏菌纯菌落的识别。3.增菌4.培养

轻轻摇动培养过的样品混合物,移取1mL,转种于10mLTTB内,于42℃±1℃培养18h~24h。同时,另取1mL,转种于10mLSC内,于36℃±1℃培养18h~24h。5.沙门氏菌菌落特征沙门氏菌属在不同选择性琼脂平板上的菌落特征食品中沙门氏菌检验标准（GB4789.4-2016)及解读检验必备物品二检验程序三目录页标准说明及适用范围一本标准代替GB4789.4—2010《食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验》、SN0170—1992《出口食品沙门氏菌属(包括亚利桑那菌)检验方法》、SN/T2552.5—2010《乳及乳制品卫生微生物学检验方法第5部分:沙门氏菌检验》。整合后的标准与GB4789.4—2010相比,主要变化如下:———修改了检测流程和血清学检测操作程序;———修改了附录A和附录B。一、标准说明及适用范围范围本标准规定了食品中沙门氏菌(Salmonella)的检验方法。本标准适用于食品中沙门氏菌的检验。二、检验必备物品1.检验所需仪器设备：高压蒸汽灭菌锅、超净工作台、冰箱（2℃~5℃）、恒温培养箱（36℃±1℃,42℃）±1℃、均质器、振荡器、电子天平（感量0.1g）、无菌锥形瓶（容量500mL,250mL）、无菌吸管（1mL、具0.01mL刻度；10mL、具0.1mL刻度)或微量移液器及吸头、无菌培养皿（直径60mm,90mm）、无菌试管（3mm×50mm、10mm×75mm）、pH计或pH比色管或精密pH试纸、全自动微生物生化鉴定系统。（检验必备物品）2.检验所需培养基、试剂：缓冲蛋白胨水(BPW)、四硫磺酸钠煌绿(TTB)增菌液、亚硒酸盐胱氨酸(SC)增菌液、亚硫酸铋(BS)琼脂、HE琼脂、木糖赖氨酸脱氧胆盐(XLD)琼脂、沙门氏菌属显色培养基、三糖铁(TSI)琼脂、蛋白胨水、靛基质试剂、尿素琼脂(pH7.2)、氰化钾(KCN)培养基、赖氨酸脱羧酶试验培养基、糖发酵管、邻硝基酚β-D半乳糖苷(ONPG)培养基、半固体琼脂、丙二酸钠培养基、沙门氏菌O、H和Vi诊断血清、生化鉴定试剂盒。三、检验程序（一）检验流程：预增菌增菌分离样品预处理血清学鉴定血清学分型(选做)生化试验结果与报告（二）检验步骤检测前的准备：尽可能缩短解冻时间，使竟争菌群生长最少，并减小对沙门氏菌的损伤致病菌取样一定要均匀并具有代表性。培养基配制应按照说明书上的用量进行换算，称取准确分量的合成培养基粉末；加热煮沸溶解培养基时，留意锅内水位的变化，水位下降可再添加适量的水，以免水分蒸发过多，导致后面分装不够量；往试管中放小导管时，注意处理气泡。（二）检验步骤1.预增菌无菌操作称取25g(mL)样品,置于盛有225mLBPW的无菌均质杯或合适容器均质,若样品为液态,不需要均质,振荡混匀。如需调整pH至6.8±0.2。于36℃±1℃培养8h~18h。如为冷冻产品,应在45℃以下不超过15min,或2℃~5℃不超过18h解冻。注意:对所有样品均进行8-18h预增菌，强调无菌操作称取样品。（二）检验步骤2.增菌

移取培养过的样品混合物1mL,转种于10mLTTB内,于42℃±1℃培养18h~24h。同时,另取1mL,转种于10mLSC内,于36℃±1℃培养18h~24h。在含选择性抑制剂的促生长培养基中间，样品进一步增菌的一个步骤。此培养基允许沙门氏菌持续增殖，同时阻止大多数其他细菌的增殖。（二）检验步骤3.分离用直径3mm的接种环取增菌液划线接种于一个BS琼脂平板和一个XLD琼脂平板(或HE琼脂平板或沙门氏菌属显色培养基平板),于36℃±1℃分别培养40h~48h(BS琼脂平板)或18h~24h(XLD琼脂平板、HE琼脂平板、沙门氏菌属显色培养基平板),观察各个平板上生长的菌落。这一步采用固体选择性培养基，抑制非沙门氏菌的生长，提供肉眼可见的疑似沙门氏菌纯菌落的识别。BS琼脂：菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色，菌落周围培养基可呈黑色或棕色；有些菌株形成灰绿色的菌落。周围培养基不变。HE琼脂：蓝绿色或蓝色，多数菌落中心黑色或几乎全黑色；有些菌株为黄色，中心黑色或几乎全黑色。XLD琼脂：菌落呈粉红色，带或不带黑色中心，有些菌株可呈现大的带光泽的黑色中心，或呈现全部黑色的菌落；有些菌株为黄色菌落，带或不带黑色中心。沙门氏菌属显色培养基：按照显色培养基的说明进行判定。（二）检验步骤4.生物化学筛选

自选择性琼脂平板上分别挑取2个以上典型或可疑菌落,接种三糖铁琼脂，后直接接种赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板，于36℃±1℃培养18h~24h,必要时可延长至48h。同时，可直接接种蛋白胨水(供做靛基质试验)、尿素琼脂(pH7.2)、氰化钾(KCN)培养基，也可在初步判断结果后从营养琼脂平板上挑取可疑菌落接种。于36℃±1℃培养18h~24h，必要时可延长至48h，将已挑菌落的平板储存于2℃~5℃或室温至少保留24h，以备必要时复查，必要时可进行沙门氏菌生化群的鉴别。本步骤排除大多数非沙门氏菌。也提供了沙门氏菌培养物菌属的初步鉴定。三糖铁琼脂：沙门氏菌反应为：斜面产碱，底层产酸，产H2S。尿素琼脂试验：变红色为阳性，不变色或者变黄色为阴性。沙门氏菌为阴性。靛基质(吲哚)试验：沙门氏菌为阴性。ONPG试验：溶液变黄色为阳性，不变色为阴性。沙门氏菌ONPG试验为阴性。

赖氨酸脱羧酶试验：赖氨酸脱羧酶肉汤和氨基酸脱羧酶对照均变黄为阴性，赖氨酸脱羧酶肉汤变紫，氨基酸脱羧酶对照变黄为阳性。沙门氏菌为阳性。如果选择系统生化做生化试验,可根据初步判断结果,从营养琼脂平板上挑取可疑菌落,用生理盐水制备成浊度适当菌悬液,使用生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统,进行鉴定。（二）检验步骤5.血清学技术提供了培养物菌种的鉴定。血清学试验必须基于生化试验的结果，不能单纯以血清学实验结果来报告最终结果。检查培养物有无自凝性、多价菌体抗原(O)鉴定、多价鞭毛抗原(H)鉴定6.血清学分型(选做项目)必要时进行沙门氏菌群的鉴别。血清学分型有利于诊断病情，有利于进行流行病学监测，进行流行病暴发溯源。1)O抗原的鉴定2)H抗原的鉴定3)Vi抗原的鉴定4)菌型的判定致病菌检测的方法

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沙门氏菌检验方法二致病菌检验方法1.大肠埃希氏菌检验方法2.志贺氏菌检验方法3.金黄色葡萄球菌检验方法4.副溶血性弧菌检验方法5.蜡样芽孢杆菌检验方法（大肠埃希氏菌检验方法）大肠埃希氏菌检验方法国标法参看食品卫生微生物学检验致泻大肠埃希氏菌检验(GB/T4789.6)。检测大肠杆菌及其肠毒素的新技术、新方法很多。如用K88单抗血清对粪中K88菌检出率比常规培养法提高1倍，最小检测菌量为10000cfu/mL。987P酶标单抗对粪便和肠内容物最小检出菌量为2000cfu/mL。对致病性大肠杆菌毒力基因检测，过去多用动物或细胞培养测定，现可用其单抗以多种免疫学手段检出。如用免疫磁分离法检测牛粪便和食品标本的大肠杆菌O157：H7，可提高了大肠杆菌O157：H7感染病例的检出率。（志贺氏菌检验方法志贺氏菌检验方法目前志贺氏菌检验多采用国标法(GB/T4789.5)。（金黄色葡萄球菌检验方法金黄色葡萄球菌检验方法MPN法：适用于检测带有大量竞争菌的食品及其原料和未经处理的含少量金黄色葡萄球菌的食品。直接平板计数法：适用于检查金黄色葡萄球菌数不小于10/g（ml）的食品增菌培养法：适用于检查含有受损伤的金黄色葡萄球菌的加工食品。定量方法定性方法（副溶血性弧菌检验方法副溶血性弧菌检验方法副溶血性弧菌的检验多采用国标法(GB/T4789.7)（蜡样芽孢杆菌检验方法）蜡样芽孢杆菌检验方法蜡样芽孢杆菌检验多采用国标法(GB/T4789.28)。国标法免疫学标记检测方法

分子生物学方法其他检测沙门氏菌的方法沙门氏菌检验方法（国标法）国标法GB4789.4—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验》对沙门氏菌的常规检验包括以下5个基本步骤：预增菌和增菌；分离；生化试验；血清学鉴定；血清学分型(选做项目)；结果与报告。免疫学标记检测方法.酶联免疫吸附法(ELISA).斑点酶联免疫吸附法（Dot-ELISA）.免疫荧光抗体技术.其它免疫学标记检测方法（免疫学标记检测方法）（免疫学标记检测方法）免疫学标记检测方法免疫标记技术就是将已知抗体或者抗原上标记上易显示的物质(标记分子)，通过检测标记物反映有无抗原抗体反应,从而间接检测出微量的抗原或者抗体。

所谓的标记分子是那些即使在超微量时也能通过特殊的方法将其检测出来，高敏感性的标记分子主要有突光素、酶、放射性同位素3种。免疫标记技术不仅大大提高了试验的敏感性，和光镜或电镜技术结合后，能对待检物质做精细定位，为临床研究和诊断提供了极大的方便。（酶联免疫吸附法）

酶联免疫吸附法(ELISA)ELISA的原理是是把抗原或抗体预先结合在某种固相载体表面，然后加入受检样品和酶标抗原或抗体使其与结合在固相载体上的抗原或抗体起反应形成抗原抗体复合物，经洗涤去除反应液中其他物质，加入酶反应底物后，底物被固相载体上的酶催化变为有色产物，最后通过定性或定量分析有色产物即可确定样品中待测物质含量。该法灵敏度高、特异性强，可避免人为因素造成的假阴性，且能在短时间内快速筛去大量的阴性样品，（斑点酶联免疫吸附法）斑点酶联免疫吸附法（Dot-ELISA）Dot-ELISA是以纤维素膜作为固相载体的一种新型免疫检测技术，其原理与常规ELISA法相同，可用于抗原或抗体的定性或定量检测。其与ELISA的不同之处在于：一是将固相载体以硝酸纤维素滤膜、确酸醋酸混合纤维素滤膜、重氮节氧甲基化纸等固相化基质膜代替，用以吸附抗原或抗体；二是显色底物的供氢体为不溶性的，结果在基质膜上出现有色斑点进行判定。该方法具有简单、快速、灵敏、特异性强等特点,并具有较高的可重复性，而且阳性反应色斑易于观察,阳性检出率也高于常规分离培养法，且整个操作过程不需要任何特殊仪器，适用于大批量样品的快速检测，可以节省大量人力、物力、财力，便于在基层单位推广应用（免疫荧光抗体技术）免疫荧光抗体技术免疫荧光抗体技术是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素，制成荧光抗体，再用这种荧光抗体作为探针检测组织或细胞内的相应抗原。在组织或细胞内形成的抗原抗体复合物上含有标记的荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受外来激发光的照射而发生明亮的荧光(黄绿色或橘红色)，可以看见荧光所在的组织细胞，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。（其它免疫学标记检测方法）其它免疫学标记检测方法免疫磁性分离法是将特异性抗体偶联在磁性颗粒表面，通过与样品中靶细菌的特异性结合和外加磁场的作用，使靶细菌得到分离、浓缩。此技术直接检测细菌特异性好，但灵敏度低。分子生物学方法.核酸探针.聚合酶链式反应技术(PCR).环介导等温扩增技术（LAMP）.基因芯片技术（分子生物学方法）（核酸探针）核酸探针通过酶切质粒DNA来进行，它主要采用一定数量的限制性内切酶，对提纯质粒的DNA酶切，分别得到不同DNA片断，用于检测食品中沙门氏菌的存在（聚合酶链式反应技术(PCR)）聚合酶链式反应技术(PCR)PCR技术是一项体外酶促扩增DNA技术，具有特异性强、敏感性高、操作简便、快速高效等特点。目前，PCR技术是一种快速、简便、特异、灵敏检测沙门氏菌的方法。（环介导等温扩增技术）环介导等温扩增技术（LAMP）LAMP技术的原理是针对靶基因的6

个区域按照规定的顺序设计4种特异的引物，因此

LAMP

技术扩增的特异性很高，只要出现扩增就可以判定靶基因存在。同时，在DNA

延伸合成过程中，从

dNTP

中析出的焦磷酸离子与反应溶液中的镁离子结合，会产生白色的焦磷酸镁沉淀。

因此只要用肉眼观察白色混浊沉淀，就能鉴定扩增与否[25]。LAMP

技术具备操作简单、特异性强、反应快速、灵敏度高的特点，LAMP

技术在微生物检测方面上得到了广泛的应用。（基因芯片技术）基因芯片技术基因芯片是一种固定有很多已知序列

DNA

探针的硅片或玻片。将经过荧光标记的样品分子与基因芯片上的

DNA探针进行杂交，通过检测每个探针分子的荧光信号强度以得到样品分子的数量和序列信息，基因芯片表面的

DNA

探针从几十到几百万个不等，可以一次性检测多种病原菌，并同时得到病原菌的耐药性等情况。（噬菌体法）噬菌体法噬菌体对细菌有特殊的裂解作用。其方法是挑取鉴别培养基上的可疑菌落，作胨水培养(37℃过夜)，若菌液浑浊，作1:200稀释，再用灭菌棉签在烘干的琼脂平皿上作条状涂布，待平板菌液干燥后，用微量加样器依次在每个区域滴加沙门氏菌噬菌体进行裂解试验。（微量热量测定法）微量热量测定法微热量计技术是通过测定细菌生长时热量的变化进行细菌的检出和鉴别。微生物在生长过程中产生热量，虽然产生的量很小，但仍能通过敏感的微热量计进行测量。用微热量计对微生物计数时，温谱图必须与绝对微生物细胞数呈相关性，一旦建立了参考温谱图，食品样品温谱图便可与之相比较而得到微生物的绝对数量。致病菌检测的意义和种类

致病菌检测的意义一致