第三章 基因工程的载体课件

第三章基因工程的载体

基因工程三大技术发明之一1946年Lederberg开始研究细菌的性因子——F因子；一类通过细胞间接触而引起自身DNA转移的接合性质粒，它能决定所在细菌的性别。性质粒也称性因子、致育因子(fertilityfactor)或F因子。

50-60年代其它质粒的相继发现：抗药因子(R因子)、大肠杆菌素因子(coE)等。概述第三章-基因工程的载体基因克隆的本质是使目的基因在特定的条件下得到扩增或表达，而目的基因本身无法进行复制，所以就必须借助于“载体”及其“寄主细胞”来实现。载体（vector）:是指在基因工程中携带外源基因进入受体细胞的“运载工具”。其本质是DNA。第三章-基因工程的载体第三章-基因工程的载体根据来源和性质划分：质粒载体噬菌体载体粘粒载体人工染色体载体（酵母、细菌）噬菌粒载体病毒第三章-基因工程的载体根据受体细胞不同划分：原核生物载体真核生物载体大肠杆菌载体酵母载体植物基因工程载体动物基因工程载体第三章-基因工程的载体根据功能和用途划分：克隆载体（繁殖目的基因或DNA片断）表达载体（用于基因的蛋白表达）转化载体（用于基因转化）测序载体（用于基因的测序）穿梭载体（在不同的细胞中穿梭）整合载体（把一个基因插入到染色体组中）第三章-基因工程的载体运送外源基因高效转入受体细胞为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因的表达提供必要的条件载体的功能第三章-基因工程的载体自身分子量较小，在寄主细胞中的拷贝数高，易于操作和DNA的制备。

能在宿主细胞内进行独立、高效稳定的自我复制。要有合适的限制性内切酶的识别、切割位点。但限制性内切酶的切割位点最好是单一的，且不在DNA复制的必需区；具有较高的DNA装载能力。具有1-2个选择标记基因，如对抗生素的抗性基因等，易于后期重组子的选择。有时还要求载体要能启动外源基因进行转录及表达，并且尽可能是高效的表达。从安全角度考虑，要求载体不能随便转移，仅限于在某些实验室内特殊菌种内才可复制等等。载体应具备的条件第三章-基因工程的载体载体的一般结构特征多克隆位点(multiplecloningsite)ori复制起始点遗传标记pUCMCSAmprMultiplecloningsite（多克隆位点）第三章-基因工程的载体Multiplecloningsite第三章-基因工程的载体第一节质粒载体质粒是一种广泛存在于细菌细胞染色体以外的（独立的）能自主复制的裸露的环状双链DNA分子，比病毒更简单。在霉菌、蓝藻、酵母和一些动植物细胞中也发现了质粒，目前对细菌的质粒研究得比较深入，特别是大肠杆菌的质粒。第三章-基因工程的载体一.质粒载体的生物学特性（1）质粒的大小

差异很大，最小的只有1kb，只能编码中等大小的2-3种蛋白质分子，最大的达到200kb。（2）质粒的生存

在寄主细胞中“友好”地“借居”，离开了寄主它本身无法复制，它可以赋予寄主一些非染色体控制的遗传性状，以利于寄主的生存。第三章-基因工程的载体（3）质粒的复制类型一种质粒在宿主细胞中存在的数目称为该质粒的拷贝数。据拷贝数将质粒分为两种复制型：“严紧型”质粒（stigentplasmid）,拷贝数为1-3；“松弛型”质粒（relaxedplasmid）,拷贝数为10-60。不过，即使是同一质粒，其拷贝数在不同的寄主细胞间也可能有很大的变化。

应用：克隆？？？表达？？？？第三章-基因工程的载体（4）质粒的不亲和性

在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒不能在同一宿主细胞中稳定共存。已鉴别出30个以上大肠杆菌质粒的不亲和群，它们之间是不相容的。Why不亲和？有什么意义？？？第三章-基因工程的载体（5）质粒的存在形式

有超螺旋、开环双螺旋和线状双螺旋三种。双螺旋共价闭合环（超螺旋）（ccDNA）开环双螺旋（一个裂口）（ocDNA）线状双螺旋（两个裂口）（lDNA）裂口第三章-基因工程的载体LOCSC原因未知第三章-基因工程的载体（6）作为基因工程载体，质粒至少应该具备复制的起始区、选择标记基因区、多克隆位点区等部分。第三章-基因工程的载体多克隆位点：克隆载体中的一段用于插入外源DNA片段的特定区域，由一系列的紧密相连的限制性内切酶位点组成，而且每个限制性内切酶位点应该在整个载体中是唯一的。选择标记基因：用于选择转化细胞的抗性基因，通常是一些抗生素抗性基因，比如对氨苄青霉素、四环素、氯霉素、卡那霉素以及潮霉素等具有抗性的基因。这样，通过在培养基中加入特定的抗生素就可以选择得到转化的细胞（菌）。第三章-基因工程的载体二.质粒的命名规则天然质粒：第一个字母大写如F质粒、R质粒、Col(colicins)质粒等。重组质粒：通常小写字母p，后加两个大写字母表示。如pBR322

人名或研究机构实验室编号p：plasmid；SC：StanleyCohn；MT：麻省理工学院；BR：F.Bolivar和R.L.Rodriguez含有目的基因的质粒命名？？？第三章-基因工程的载体三.质粒载体的构建及改造天然质粒用作载体的局限性局限性：分子量高、拷贝数低、合适的单一酶切位点少、选择标记不适合。第三章-基因工程的载体改造通常包括如下几个方面●去掉不必要的DNA区域，保留复制子等必要部分，尽量缩小质粒分子量，以提高外源DNA片段的装载量。●减少限制性内切酶的酶切位点。●加入易于检测的选择性标记（标记基因）。●关于质粒的安全性改造，保证质粒载体不随便转移。（避免滥交质粒）●改造或增加基因表达的调控序列。第三章-基因工程的载体标记基因标记基因按其用途分为2类：选择标记基因:用于鉴别目的载体的存在，将成功转化了载体的宿主挑选出来。筛选标记基因:用于区别重组质粒与非重组质粒，可将携带了外源DNA片段的重组质粒挑选出来。第三章-基因工程的载体1.选择标记基因第三章-基因工程的载体2.筛选标记基因(1)LacZ的α-互补(α-complementation)

是指β-半乳糖苷酶基因(LacZ)上缺失操纵基因区段的突变体与带有完整的操纵基因区段的LacZ基因的突变体之间实现互补，从而产生具有β-半乳糖苷酶学活性的蛋白，这种现象就称为α-互补。第三章-基因工程的载体

-互补

大肠杆菌

-半乳糖苷酶（

-片段和-片段）可以和其底物X-Gal相互作用并且释放出一种蓝色物质，当该酶的

-片段和-片段分开时就失去了这种显色的功能。通常将编码该酶-片段的LacZ基因插入到载体的多克隆位点的侧翼序列中，而在一些人工构建的大肠杆菌株系中却只能编码产生该酶的片段。这样一来，含有功能性完整的LacZ

基因的载体导入到这类寄主细胞中时，载体编码的

-片段就能和寄主编码的片段发生互补并具有了对底物X-Gal的作用功能（发生显色反应），这种现象被称为alpha-complementation.第三章-基因工程的载体第三章-基因工程的载体

第三章-基因工程的载体2.筛选标记基因

(2)插入失活(insertionalinactivation)

在质粒pBR322的抗四环素基因上插入一个外源基因后，导致抗四环素基因失活，变成只对氨苄青霉素有抗性，这样就可通过对抗生素是双抗还是单抗来筛选是否有外源基因片段插入到载体中，这种筛选方法称为插入失活。

第三章-基因工程的载体Example

在pBR322质粒的BamHⅠ或SalⅠ位点插入外源DNA片断，切断了tetr基因编码序列的连续性，使其抗性失去活性，产生出AmprTets表型的重组质粒，转化入AmpsTets的大肠杆菌细胞后，先涂布在含Amp的选择培养基上，筛选出具Ampr菌落，再将它们影印到含Tet的选择性培养基上，不能在这种培养基上生长的菌落，即为插入外源片断的重组质粒。（两步完成）第三章-基因工程的载体质粒大小对载体特性的影响质粒越小，克隆容量越大；质粒越大，其限制性酶切图谱鉴定困难；质粒越大，其拷贝数越低；质粒越大，其杂交检测信号越低；第三章-基因工程的载体人工构建的质粒可分成如下几类高拷贝质粒

突变拷贝数控制基因,拷贝数1000-3000,扩增基因低拷贝质粒

来自pSC101,拷贝数小于10,表达某些毒性基因温敏质粒

在不同温度下表现出拷贝数、整合等不同性质测序质粒

含有测序通用引物互补序列和多酶接头整合质粒

装有整合促进基因及位点,便于外源基因的整合穿梭质粒

装有针对两种不同受体的复制子,便于基因克隆表达质粒

装有强化外源基因表达的转录、翻译、纯化的元件探针质粒

装有报告基因,便于启动子等元件的筛选及鉴定第三章-基因工程的载体

探针质粒例：克隆并验证某基因启动子基因启动子GFP启动子探针质粒转化观察GFP表达情况第三章-基因工程的载体目前实验室使用的大肠杆菌质粒大多是由少数几个基础质粒构建的：pSC1018.8kb，拷贝数5，含四环素抗性标记基因Tcr;ColE16.5kb，拷贝数20-30，含大肠杆菌内毒素标记基因E1;pSF2124

ColE1衍生质粒，含氨苄青霉素抗性标记基因Apr;第三章-基因工程的载体常用（人工改造）质粒载体

pBR322,thisisoneoftheearliestgeneralpurposecloningvectorstobedeveloped.Itisa4363bpplasmidwithtwoantibioticresistancegenes,forampicillinandtetracycline.Thereareseveraluniquerestrictionsites.pBR322generallydoesnotgivesuchahighyieldofplasmidDNAasmodernvectorssuchaspUC,pGEM，pMD，andpBluescript。（一）pBR322质粒载体（原始载体）第三章-基因工程的载体

第三章-基因工程的载体

自学：pBR322的构建过程！第三章-基因工程的载体pBR322质粒载体的优点：

1、具有较小的分子量

它的分子量为4363bp,克隆外源DNA的分子量大小不超过10kb。

2、具有两种抗生素抗性基因

pBR322DNA分子中总共有24种核酸内切酶的单一酶切识别位点。其中7种内切酶的识别位点在四环素抗性基因内部，2种识别位点在于这个基因的启动区内，所以9个限制酶切位点插入外源片断可以导致tetr

基因的失活；另外有3种限制酶在Ampr基因有单一的识别位点。第三章-基因工程的载体（二）pUC质粒载体（克隆载体）ThepUCseriesofsmall(2.7kb)plasmidscontaintheoriginofreplicationandampicillinresistancegenefrompBR322andtheE.coli

lacZgeneandmorecloningsitesonit.第三章-基因工程的载体一种典型的pUC系列的质粒载体，包括以下四个部分：

1、来自pBR322质粒的复制起点（ori）；2、氨苄青霉素抗性基因（Ampr

），但它的DNA核苷酸序列已经发生了变化，不再含有原来的限制核酸内切酶的单识别位点。

3、大肠杆菌β-半乳糖基因（lacZ）的启动子及编码α-肽链的DNA序列，此结构称之为lacZ’基因；

4、位于lacZ基因中的靠近5’-端的一段多克隆位点（MCS）区段。用于筛选含有质粒的细胞用于筛选含有目的基因的细胞插入目的基因第三章-基因工程的载体第三章-基因工程的载体pUC质粒载体的优点第一.具有较小的分子量和更高的拷贝数

平均每个细胞500-700个拷贝(甚至高达3000)。第二.适用于组织化学检测重组体

具有来自大肠杆菌lac操纵子的lacZ’基因，所编码的α-肽链可参与α-互补作用，用X-Gal显色对重组子进行鉴定，而pBR322质粒的重组子要进行两步的选择。第三.具有多克隆位点MCS区段

方便具有不同粘性末端的外源片断的插入。第三章-基因工程的载体（三）pGEM-3Z（克隆+表达）Italsohastwobacteriophagepromoters,SP6andT7inflankingthepolylinker.ThisallowstranscriptionofinsertstoproduceeithersenseorantisenseRNA.5’3’3’5’pGEM-3ZcontainstheLacZgeneandallowsalphacomplementation.Thevectoris2.9kbinsize,ampicillinselectableandcanbegrowntohighcopynumber.

第三章-基因工程的载体（四）pETvectors（表达载体）pETvectorsaredesignedtoallowtheexpressionofclonedgenestoproteins.pET-5hasaregionencodinganelevenaminoacidstretchofproteinbeforeEcoRIandBamHIrestrictionsites.Cloningintothesesitesresultsinexpressionoftheclonedinsertasafusionprotein.

UseofNdeIenzymeincuttingvectorandinsertallowsexistedcodontobereplacedbytheinitiationcodonoftheinsert,resultinginexpressionoftheinsertwithnofusionprotein.

第三章-基因工程的载体（五）Tvectors（PCR克隆载体）

pMD18-TVector、pMD19-TVector是一种高效克隆PCR产物

(TACloning)的专用载体。这两种载体分别由pUC18、pUC19载体改建而成，在pUC18、pUC19载体的多克隆位点处的XbaI和SalI识别位点之间插入了EcoRV识别位点，用EcoRV进行酶切反应后，再在两侧的3‘端添加“T”而成。因大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都有在PCR产物的3'末端添加一个"A"

的特性，所以使用这两种制品可以大大提高PCR产物的连接、克隆效率。第三章-基因工程的载体第三章-基因工程的载体

由于这两种载体是分别以pUC18、pUC19载体为基础构建而成，所以它具有同pUC18、pUC19载体相同的功能。此外，这两种制品中的高效连接液LigationMix可以在极短时间内(约5分钟)完成连接反应,且此连接液可以直接用于细菌转化，大大方便了实验操作。

pMD19-TVector与pMD18-TVector相比，pMD19-TVector的β-半乳糖苷酶的表达活性更高，菌落显示蓝色的时间缩短，菌落显示的蓝色更深。因此，克隆后更容易进行克隆体的蓝白筛选。T载体的优点：第三章-基因工程的载体第二节噬菌体载体噬菌体是比细菌还小得多的微生物，和病毒侵犯真核细胞一样，噬菌体侵犯细菌，也可以认为它是细菌里的“寄生虫”。它本身是一种核蛋白，核心是一段DNA，结构上有一个蛋白质外壳和尾巴，尾巴上的微丝可以把噬菌体的DNA注入细菌内。第三章-基因工程的载体1.

噬菌体的生物学特性

噬菌体的生长周期可分为溶菌周期和溶源周期两种类型。前者指噬菌体将DNA注入寄主细胞后环化，然后自我复制、蛋白衣壳合成和新噬菌体颗粒的组装，最后使寄主细胞破裂而释放出大量的子代噬菌体。后者指噬菌体将DNA注入寄主细胞后，噬菌体DNA整合到寄主细胞染色体上并随着寄主细胞的分裂而进行复制。只有溶菌生长周期的噬菌体被称为烈性噬菌体。有溶源周期的噬菌体被称为温和噬菌体。一.噬菌体及其载体第三章-基因工程的载体1.

噬菌体的生物学特性

Lyticcycle(溶菌周期)ofgrowth:TheinjectedDNAinhostbacteriumreplicatedmanytimes,phagestructuralproteinsareexpressedandthenewphagechromosomesarepackagedintophageheads.Newphagesarethenreleasedbylysis(溶胞)ofthehostcell.第三章-基因工程的载体烈性噬菌体溶菌生长的基本过程1、吸附吸附到位于感染细胞表面的特殊接受器上2、注入噬菌体DNA穿过细胞壁注入寄主细胞3、转变被感染的细胞成为制造噬菌体颗粒的场所4、合成大量合成噬菌体特有的核酸和蛋白质5、组装包装了DNA头部和尾部组装成噬菌体的颗粒6、释放合成的子代噬菌体颗粒从寄主细胞内释放出来第三章-基因工程的载体噬菌体属于温和噬菌体，-DNA注入寄主内，先进入溶源周期，受某些外界条件刺激及进入溶菌周期。1.

噬菌体的生物学特性第三章-基因工程的载体2.

噬菌体载体♦λ噬菌体载体为线状双链DNA，温和噬菌体，长度约48.5kb。

♦

λ噬菌体线状双链DNA分子的末端各有一个互补的长为12bp的5`端粘性末端(cohensiveendsite)。第三章-基因工程的载体λ噬菌体整个基因组分3部分:①左臂：从A到J长约20kb，其中的基因编码构成头部、尾部、尾丝对组装完整噬菌体所需要的蛋白质。②中段：长约20kb,是λDNA整合和切出,溶原生长所需序列。③右臂：长约10kb,是调控区，控制溶菌和溶原生长最重要的调控基因和序列、以及λDNA复制起始均在这区域内。

左右臂包含λDNA复制、噬菌体结构蛋白合成、组装成熟噬菌体、溶菌生长所需全部序列；对溶菌生长来说，中段是非必需的。第三章-基因工程的载体λ噬菌体的分子结构第三章-基因工程的载体λ噬菌体的基因组结构控制噬菌体从溶源到溶菌状态转变第三章-基因工程的载体♦cos位点：当λ噬菌体进入寄主细胞后，粘性末端通过碱基互补作用，形成环状DNA分子，粘性末端形成的双链区域称为cos位点。第三章-基因工程的载体

5‘-CGGGGCGGCGACCTCG-3’ 3’-GCCCCGCCGCTGGAGC-5’

CleavageLigation(duringpackaging)(afterinfection)GGGCGGCGACCTCG-3’5’-CGGC-5’3’-GCCCCGCCGCTGGAThephage

cosendsCircularformLinearform第三章-基因工程的载体cosshort(right)armcosDNAProteincoatNonessentialregionLong(left)armExogenousDNA（外源DNA）(~20-23kb)λphage12bp第三章-基因工程的载体3.

噬菌体载体的构建3.1缩短长度野生型λ-DNA包装的上限为51kb，本身长度为48.5kb，只有当插入的外源DNA片段不大于2.5kb时，才能被包装成有感染力的噬菌体颗粒。因此缩短野生型λ-DNA的长度，可以提高装载量。其实野生型λ-DNA上约有40-50%的片段是复制和裂解所非必需的。第三章-基因工程的载体3.2删除重复的酶切位点野生型的λ-DNA链上有5个EcoRI位点和7个HindIII位点，不利于重组操作，必须删除至1-2个；同时，为了便于各种来源的DNA片段的克隆，还需要增加一些单一的酶切位点；除了简单的切割外，还需要采用定点突变技术去除或增添酶位点。第三章-基因工程的载体3.3加装选择标记与质粒不同，野生型λ-DNA上缺少合适的选择标记，因此加装选择标记是λ-DNA克隆载体构建的重要内容。

λ-DNA克隆载体上的选择标记主要有下列两类：免疫功能类标记颜色反应类标记第三章-基因工程的载体(1)加装选择标记imm434第三章-基因工程的载体(2)加装选择标记lacZ第三章-基因工程的载体3.4构建琥珀密码子的突变体

琥珀型突变（sup)是指由CAG（Gln）向UAG（stop）的突变。大肠杆菌的某些菌株含有特异性的校正基因，其编码产物校正tRNA能专一性地纠正这一突变。将野生型λ-DNA上D和E两个头部包装蛋白的基因中的CAG密码子突变成UAG。当这种λ-DNA进入一般的大肠杆菌菌株后，不能合成有活性的头部蛋白，也就不能被包装和裂解细菌，这样就可以阻止有害重组体的生物污染及扩散，而基因工程实验中使用的受体则是具有琥珀型突变体校正功能的菌株。第三章-基因工程的载体3.5λ-DNA重组分子的体外包装

λ-DNA重组分子需在体外人工包装成有感染力的噬菌体重组颗粒，方可高效导入受体细胞。用于体外包装的蛋白质可直接从感染了λ噬菌体的大肠杆菌中提取，现已商品化。这些包装蛋白通常分为相互互补的两部分：一部分缺少E组份，另一部分则缺少D组份。包装时，只有这两部分包装蛋白与重组λ-DNA分子混合后，包装才能有效进行，任何一种蛋白包装液被重组λ-DNA污染后，均不能被包装成有感染力的噬菌体颗粒，这也是基于安全而设计的。第三章-基因工程的载体4.λ-DNA载体的主要类型插入型载体（insertionvector）:通过特定的酶切位点允许外源DNA片段插入的载体。Charon2、Charon6、λgt11置换型载体(replacementvector,又称取代型载体):允许外源DNA片段替换非必需DNA片段的载体。λEMBL4、Λgem-11、Charon40第三章-基因工程的载体第三章-基因工程的载体插入式载体：

cI基因插入失活：如λgt10、λNM1149等载体，在cI基因上有EcoRI及HindIII的酶切位点。外源基因插入后将导致cI基因的失活。cI基因失活后将导致噬菌体不能溶源化，产生清晰的噬菌斑。相反，产生混浊的噬菌斑。cI+cI-LysogeniccycleLyticcycleclearplaquescloudyplaquesgene第三章-基因工程的载体LacZ’基因插入失活：如charon16A载体，在非必须区段引入lacZ’基因，在lacZ’基因上有EcoRI位点，插入失活后利用X-Gal法筛选（兰白斑筛选）。第三章-基因工程的载体第三章-基因工程的载体取代型载体外源DNA取代噬菌体染色体中对于噬菌体的感染和复制非必要的片段(~25kb)高感染效率(109

转化株/ug载体DNA,比质粒高100倍)第三章-基因工程的载体例如Charon4A、λEMBL3/4、Charon40等载体，这些载体是用LacZ替换入噬菌体的中间区段，同时将LacZ作为选择标记，使用时用EcoRI等水解，去掉中间的片段，再与克隆片段在体外进行重组、包装。而后，感染E.coli使之在E.coli内繁殖，并裂解E.coli，形成空斑。取代型λ噬菌体是使用最广泛的载体。取代型载体利用LacZ反向筛选第三章-基因工程的载体取代型载体克隆外源DNA的步骤1.应用适当的核酸内切酶消化λ载体，除去可取代的DNA片段；2.将上述所得的λDNA载体臂同外源DNA片段的连接；3.对重组体的λDNA分子进行包装和增殖，以得到有感染性的λ重组噬菌体。第三章-基因工程的载体5.λ-DNA载体的优点λ-DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌；λ-DNA载体的装载能力为25kb，远远大于质粒的装载量；重组λ-DNA分子的筛选较为方便；重组λ-DNA分子的提取较为简便；λ-DNA载体适合克隆和扩增外源DNA片段，但不适合表达外源基因；第三章-基因工程的载体二.M13单链噬菌体DNA载体

M13是丝状的大肠杆菌噬菌体，颗粒内含有6.4k核苷酸的闭合环状单链DNA（+）基因组。第三章-基因工程的载体环形DNA分子从其复制起始点开始复制，导致复制泡形成。这种含有复制泡的复制中间体的形状类似于希腊字母θ型结构。“θ”θ复制第三章-基因工程的载体滚环式复制(rollingcirclereplication)是噬菌体中常见的DNA复制方式。第三章-基因工程的载体M13的生命周期M13通过大肠杆菌性菌毛进入寄主细胞（外壳蛋白脱落）ө复制200拷贝第三章-基因工程的载体M13的特点M13并不是在寄主细胞内包装成噬菌体颗粒的，（+）DNA先与结合蛋白形成复合物，转移到寄主细胞膜，然后结合蛋白脱落，最后（+）DNA从细胞膜上向胞外溢出，溢出过程中被外壳蛋白包装成噬菌体颗粒。因此，M13并不发生溶菌现象，但噬菌体的大量繁殖也干扰了寄主细菌的正常生长，所以仍可产生模糊的噬菌斑。因此，（+）DNA并不需要导入一种预先固定的结构中，被包装的（+）DNA分子量大小并无严格限制。第三章-基因工程的载体IIIVIIIVIIXVVIIIXVIII野生型M13RF-DNAIIIVIIIVIIXVVIIIXVIIIM13mp系列载体lacZ′Polylinker（MCS）M13DNA载体的构建在M13的基因II和基因IV之间有1长度为507个NN的基因间区段（IG区段），外源DNA的插入该区段中，不影响M13噬菌体DNA的复制。第三章-基因工程的载体克隆的DNA片段以单链形式输出细胞，制备单链的DNA用于测序、杂交探针、基因定点突变。M13重组分子筛选简便，被M13噬菌体感染的受体细胞生长缓慢，形成混浊斑，易于辨认挑选。而且重组分子越大，混浊斑的混浊度亦越大。M13的RFDNA在寄主细胞内以高拷贝形式存在，很容易纯化出来作为基因克隆的载体使用。M13载体的特点和用途第三章-基因工程的载体M13载体的不足1.插入的外源DNA片段不稳定，片段越大，越容易发生缺失和或重排。2.克隆外源DNA的实际能力十分有限，一般情况下其有效的最大克隆能力为1.5Kb。3.理论上，M13噬菌体中外源DNA片段有两种插入方向，但实际上外源DNA总是按1种主要方向插入。第三章-基因工程的载体第三节柯斯质粒载体

λ-DNA载体和M13-DNA载体的装载量最大分别为25kb和1.5kb，但在很多情况下，往往需要克隆更大的外源DNA片段，柯斯质粒的构建就是为了进一步提高噬菌体DNA的装载量。构建思路：

在包装上限固定的条件下，大幅度缩短噬菌体DNA的长度，就能同步增加载体的装载能力。将噬菌体DNA与包装有关的序列与质粒组装在一起，既能最大限度地缩短载体的长度，同时又能保证重组DNA分子在体外仍被包装成有感染力的颗粒。第三章-基因工程的载体柯斯质粒是一类人工构建的含有

DNA的cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体，cosmid是cossitecarryingplasmid的缩写。由3部分组成：

A.多克隆位点区

B.含有cos位点的DNA区

C.复制起始位点和抗性标记区第三章-基因工程的载体柯斯（cosmid）质粒载体：也称粘粒，是一类用于克隆大片段DNA的载体，它是由λ噬菌体的cos（cohesive）末端及质粒（plasmid）重组而成的载体。带有质粒的复制起点、克隆位点、选择性标记以及λ噬菌体用于包装的cos末端等。该载体在体外重组后，可利用噬菌体体外包装的特性进行体外包装，利用噬菌体感染的方式将重组DNA导入受体细胞。但它不会产生子代噬菌体，而是以质粒DNA的形式存在于细胞内。第三章-基因工程的载体柯斯质粒载体的特点1.具有噬菌体的特性柯斯质粒连接上适宜长度的外源DNA后可以在体外包装成噬菌体颗粒，并能高效转导寄主细胞。进入寄主细胞的DNA也能环化和复制，但是不会形成新的噬菌体颗粒，也不能发生溶菌现象。2.具有质粒载体的特性能象质粒一样在寄主细胞内复制，且带有抗性选择标记基因，有些还带有插入失活型的多克隆位点，为重组体的筛选提供了方便。3.高容量的克隆能力

cos质粒本身很小，只有复制起点、选择标记和cos位点等构成，所以其克隆上限可达45kb左右。不过由于包装的限制，其克隆片段至少要达到30kb。第三章-基因工程的载体1978年，Collins和Hone发明构建。例如：柯斯质粒pHC79系由质粒pBR322和λ噬菌体的cos位点的一段DNA构成，全长4.3kb。第三章-基因工程的载体

设计构建的柯斯质粒一般长4-6kb。其上的cos位点的一个重要作用是识别噬菌体的外壳蛋白。凡具有cos位点的任何DNA分子只要在长度相当于噬菌体基因组，就可以同外壳蛋白结合而被包装成类似λ噬菌体的颗粒。因此，插入柯斯质粒的外源DNA可达到45kb。重组的柯斯质粒可象λ噬菌体一样感染大肠杆菌，并在细菌细胞中复制。第三章-基因工程的载体第三章-基因工程的载体第三章-基因工程的载体采用柯斯质粒作载体的困难①载体自身只相当于可以插入片段的1/10左右，因此往往会出现载体同载体自身连接，结果在一个重组分子内可有几个柯斯质粒载体连在一起。但用碱性磷酸酶处理，可阻止载体分子自身连接。第三章-基因工程的载体②柯斯质粒装载能力大，可能使基因组上并非相邻小片段错乱地连接成一个片段，影响实验结果，后来专门选出35～45kb的外源DNA插入载体DNA，此时，每个载体只可能插入一个外源片段，因为如果二个片段，则将超过包装成噬菌体颗粒的限度；20kb20kbBglIIBglIIBglIIBglII酶切与载体连接第三章-基因工程的载体第四节噬菌粒载体由质粒载体和单链噬菌体载体结合而成的新型的载体系列。①具质粒的复制起点、选择性标记、多克隆位点等，方便DNA的操作，形成的双链DNA稳定又高产；②又具有单链噬菌体的复制起点、包装序列，在辅助噬菌体的存在下，可进行噬菌体的繁殖，产生单链的子代噬菌体。第三章-基因工程的载体质粒pUC19与噬菌粒pUC119第三章-基因工程的载体噬菌粒载体的特点：●能像M13-DNA那样体外包装，并高效转染受体细胞；●装载量比常规的M13mp系列要大很多（10kb）；●能像质粒那样在受体细胞中自主复制；●具有抗性标记重组操作简便，筛选容易；●通过克隆双链DNA能获得同等长度的单链DNA第三章-基因工程的载体质粒λ噬菌体柯斯质粒单链噬菌体克隆DNA大片段±*++-构建基因组文库-++-构建DNA文库+---常规的亚克隆化+---构建新型的DNA结构+---序列分析+--+单链探针+**--+外源基因在大肠杆菌中的表达+---四种常用载体的比较*外源DNA如超过10kb，则重组质粒的转化率和DNA得率都非常低**已有个别材料可用于此目的第三章-基因工程的载体第五节人工染色体载体人类、动物、植物的全基因组序列分析往往需要克隆数百甚至上千kb的DNA片段，此时，柯斯质粒和噬菌粒载体的装载量也远远不能满足需要。真核生物基因组长度，远大于质粒、噬菌体DNA等，能否将真核生物染色体去掉非必须区域，作为克隆载体，装载更大的外源DNA片段？第三章-基因工程的载体真核生物的染色体有几个关键部位：着丝粒端粒复制序列

分离这些元件并通过DNA体外重组技术将它们连接起来构成人工染色体。第三章-基因工程的载体将染色体上的复制区、分配区、稳定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体。当大片段的外源DNA克隆在这些染色体载体上后，便形成重组人造染色体，它能像天然染色体那样，在受体细胞中稳定的复制并遗传。人工染色体载体（artificialchromosomevector）:利用染色体的复制元件来驱动外源DNA片段复制的载体。第三章-基因工程的载体酵母人工染色体载体，实际上是一种“穿梭”克隆载体。其含有质粒克隆载体所必备的第一受体源(大肠杆菌)质粒复制起始位点(ori)，还含有第二受体(如酵母菌)染色体DNA着丝点、端粒和复制起始位点的序列，以及合适的选择标记基因。这样的克隆载体在第一受体细胞内可以按质粒复制形式进入高拷贝复制。这种克隆载体在体外与目的DNA片段重组后，转化第二受体细胞，可在转化的细胞内按染色体DNA复制的形式进行复制和传递。筛选第一受体的克隆子，一般采用抗菌素抗性选择标记；而筛选第二受体的克隆子，常用与受体互补的营养缺陷型。与其他的克隆载体相比，人工染色体克隆载体的特点是能容纳长达1000kb甚至3000kb的外源DNA片段。酵母人工染色体(YeastArtificialChrom