细菌分离培养-细菌标本片的制备及染色方法（动物微生物课件）

掌握细菌常用标本片的制作及染色方法；认识革兰氏染色的反应特性；一、实训目的二、实训器材病料、细菌培养物、接种环、玻片、酒精灯、染色缸、染色架、染色液等。三、实训内容（一）细菌标本片的制作（二）血液推片的制作（三）常用的细菌染色方法（四）常用染色液的配制（五）注意事项（一）细菌标本片的制作1.涂片2.干燥3.固定固体培养物：取清洁载玻片一块，用吸管吸取生理盐水1滴置于玻片中央，再将接种环在火焰上灭菌，待冷后从固体培养基上挑取少许菌落，置于玻片上的生理盐水中混均匀，并在玻片上涂成直径约为1cm的涂面，要求薄而均匀。（一）细菌标本片的制作1.涂片液体培养物：取清洁载玻片一块，将接种环在火焰上灭菌，待冷后取一滴培养液或液体，置于玻片中央，混均匀，涂成直径约为1cm的涂面。病变组织抹片：做无菌切开，用切面在玻片中央触一下或压印成一薄层即可。（一）细菌标本片的制作1.涂片在室温下自然干燥，必要时将涂面向上，置火焰上方30～40cm来回微烤使其干燥。2.干燥火焰固定：将干燥后的玻片涂面向上，在火焰上快速来回通过2～3次，其温度以手背接触玻片底面感觉微烫手为宜。化学固定：将干燥后的玻片浸入甲醇（乙醇、丙酮）中，或在玻片上滴数滴甲醇，2～3分钟后自然挥发干燥。3.固定（二）血液推片的制作取一张边缘整齐的载玻片，用其一端蘸取一滴血液，在另一张干净无油脂的载玻片上，以45°角度均匀地推成一薄血涂片，以红细胞不重叠为宜。1.取血：将血液滴在载玻片上。2.推片：以左手拿该片，用另一个载玻片作推片，在左手载玻片上由前向后接触血滴，使两载玻片约成45°角，轻轻移动，使血滴成一直线，然后由前向后推为一均匀的薄片。5/11/202413让血液粘附在推片上推出均匀的血膜5/11/202415窍门：将载玻片的一端垫起，有助于推出均匀血膜。5/11/202416做细菌涂片时，不宜涂得过厚，以免影响制片效果。固定必须确实，火焰固定时不宜温度过高，以免破坏菌体结构。每种染液染色的过程中应保持染色液不干，尤其加热染色的染液，在染色过程中应随时添加，以免蒸发干，影响染色效果。每种染液染色后，应用水将染液一起冲掉，不可先将染液倾去后再用水冲洗。注意事项：细菌标本片制备及染色方法

掌握细菌常用标本片的制作及染色方法；认识革兰氏染色的反应特性；一、实训目的二、实训器材病料、细菌培养物、接种环、玻片、酒精灯、染色缸、染色架、染色液等。三、实训内容（一）细菌标本片的制作（二）血液推片的制作（三）常用的细菌染色方法（四）常用染色液的配制（五）注意事项（一）细菌标本片的制作1.涂片2.干燥3.固定固体培养物：取清洁载玻片一块，用吸管吸取生理盐水1滴置于玻片中央，再将接种环在火焰上灭菌，待冷后从固体培养基上挑取少许菌落，置于玻片上的生理盐水中混均匀，并在玻片上涂成直径约为1cm的涂面，要求薄而均匀。（一）细菌标本片的制作1.涂片液体培养物：取清洁载玻片一块，将接种环在火焰上灭菌，待冷后取一滴培养液或液体，置于玻片中央，混均匀，涂成直径约为1cm的涂面。病变组织抹片：做无菌切开，用切面在玻片中央触一下或压印成一薄层即可。（一）细菌标本片的制作1.涂片在室温下自然干燥，必要时将涂面向上，置火焰上方30～40cm来回微烤使其干燥。2.干燥火焰固定：将干燥后的玻片涂面向上，在火焰上快速来回通过2～3次，其温度以手背接触玻片底面感觉微烫手为宜。化学固定：将干燥后的玻片浸入甲醇（乙醇、丙酮）中，或在玻片上滴数滴甲醇，2～3分钟后自然挥发干燥。3.固定（二）血液推片的制作取一张边缘整齐的载玻片，用其一端蘸取一滴血液，在另一张干净无油脂的载玻片上，以45°角度均匀地推成一薄血涂片，以红细胞不重叠为宜。1.取血：将血液滴在载玻片上。2.推片：以左手拿该片，用另一个载玻片作推片，在左手载玻片上由前向后接触血滴，使两载玻片约成45°角，轻轻移动，使血滴成一直线，然后由前向后推为一均匀的薄片。5/11/202431让血液粘附在推片上推出均匀的血膜5/11/202433窍门：将载玻片的一端垫起，有助于推出均匀血膜。5/11/202434（三）常用的细菌染色方法（三）常用的细菌染色方法1.单染法：又叫简单染色法，即只用一种染料进行染色。（1）美蓝染色法染色液配制：甲液：美蓝0.3g、95%酒精30mL；乙液：0.01%苛性钾溶液100mL。先配甲液，将美蓝放入研钵中，徐徐加入酒精研磨均匀后，把甲、乙两液混合，过夜后用滤纸过滤即成。新鲜配制的美蓝液染色不好，陈旧的染色好。（三）常用的细菌染色方法1.单染法：又叫简单染色法，即只用一种染料进行染色。染色方法：在已固定好的抹片上，滴加适量美蓝染色液覆盖涂面，染色2～3min，水洗，吸水纸轻压吸干或晾干和镜检，结果菌体呈蓝色。（1）美蓝染色法（2）瑞氏染色法：染色液的配制：取瑞氏染料0.1g，纯中性甘油1ml，在研钵中混合研磨，再加入甲醇60ml，使其溶解，装入中性瓶中过夜，次日过滤，盛入棕色瓶中，暗处保存。保存越久，染色越好。染色方法：细菌抹片自然干燥后，滴加瑞氏染色液于涂片上以固定标本，1～3min后，再滴加与染色液等量的磷酸缓冲液或中性蒸馏水于玻片上，轻轻摇晃使与染色液混和均匀，5min左右水洗，干后镜检，结果菌体呈蓝色，组织细胞等物呈其他颜色。（2）瑞氏染色法：2.复染（三）常用的细菌染色方法革兰氏染色原理革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-

）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法（KOH溶解试验和氨基肽酶试验可用作辅助试验）。该染色法所以能将细菌分为G+菌和G-菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。2.复染（三）常用的细菌染色方法革兰氏染色原理G-的细胞壁中脂类较多，肽聚糖少,用洒精脱脂时，脂类易除去使得细胞壁的孔隙变大，从而使结晶紫染料从细胞壁中洗脱出来，最后用红色的染料复染时而显红色；G+的细胞壁含脂类较少，肽聚糖多且交联紧密，酒精作用后肽聚糖收宿，细胞壁的孔隙变小使得结晶紫与碘的复合物不能脱出，经红色染料复染后仍为紫色。

革兰氏染色染色：初染（结晶紫）媒染（碘液）脱色（酒精）复染（复红）滤纸吸干油镜镜检safraninCrystalviolet5/11/202442涂片

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干燥

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固定

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草酸铵结晶紫染色1min

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水洗干燥

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碘液媒1min

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水洗干燥

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95%乙醇脱脂15~20s

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水洗干燥→

番红复染1min

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水洗干燥→镜检。革兰式染色流程路线：5/11/202443实训三：细菌标本片制备及染色方法染色步骤5/11/2024（２）（３）（１）（４）１分钟水洗１分钟水洗15-３０秒水洗３０-60秒水洗吸干复红复染95％乙醇脱色结晶紫初染卢戈碘液媒染（1）涂片→干燥→固定215/11/202445固定的目的和方法使细菌的细胞凝固，使菌体与玻片粘得更牢固可改变菌体对染料的通透性加热固定可杀死细菌，比较安全固定的方法将制成的标本匀速通过火焰三次5/11/202446（2）草酸铵结晶紫染色1min→

水洗干燥5/11/202447结晶紫初染１分钟水洗

5/11/202448

（3）碘液媒染1min水洗→干燥5/11/202449碘液媒染１分钟

水洗

（3）碘液媒染1min水洗→干燥5/11/202450

（4）95%乙醇脱色15～30秒→水洗干燥5/11/202451酒精脱色３０秒水洗5/11/202452

（4）95%乙醇脱色15～30秒→水洗干燥（5）番红复染30S～1min→水洗干燥→镜检5/11/202453番红复染３０秒水洗5/11/20