真菌基础检验课件

欢迎进入真菌世界WellcometotheworldofFungi临床真菌学及

医学真菌检验技术进展---临床真菌学

---研究真菌病诊断和治疗的临床学科病原体的确定-诊断的关键诊断-准确、快速敏感药物的选择治疗-高效.低毒临床真菌检验学技术----通过直接和间接方法帮助临床医生对真菌感染做出判断真菌镜检真菌培养组织病理生理生化血清学方法分子生物学感染是一个永远都不能忽视的话题

感染病原菌的动态变化感染原包括：细菌、真菌、病毒、支原体、衣原体等60年代：革兰氏阳性菌感染为主70年代：革兰氏阴性菌感染为主90年代迄今：深部真菌的感染逐渐增多，USA近10年增加2倍耐药菌株增多（细菌和真菌）少见的病毒的出现：禽流感和SARS等免疫缺陷病如AIDS发病的增多白血病和再生障碍贫血增多医院真菌感染不容忽视医院感染发生率约10％，其中细菌感染占首位，真菌感染也占很大比例。随着广谱抗生素、细胞毒性药物及免疫抑制剂的广泛应用，真菌感染的发病率迅速升高，成为医院感染的重要原因之一。医院真菌感染可导致死亡率增高和住院时间延长，因此加强对医院真菌感染的防治研究具有重要意义。主要原因：频繁使用免疫抑制疗法、抗癌和器官移植、骨髓移植，过度使用广谱抗生素、免疫功能低下、糖尿病、烧伤、静脉高营养、接受造血干细胞移植的个体。主要感染真菌为：酵母或酵母样菌（白念珠菌为主，其次为曲霉菌、隐球菌、接合菌属）80年代唑类药物的出现，对念珠菌血症的病原菌分布产生了影响，非白念珠菌引起的感染增多。自然界广泛存在的腐生真菌通过外伤侵入人体，引起的少见真菌感染不容忽视，因其对免疫缺陷的个体危害更大，常导致严重的系统感染。近年侵袭性真菌感染成为医院感染的严重问题全球性侵袭性真菌病的流行病学改变白念珠菌所引起的感染仍占首位，但非白念珠菌的感染比重增多。主要为光滑、热带、近平滑和都柏林念珠菌等，其他酵母菌如毛孢子菌，红酵母，Pichiaanomala(必赤酵母),马拉色菌、酿酒酵母等。引起透明丝孢霉病的菌种的改变，除暗色真菌外，镰刀菌、拟青霉属、波氏霉样菌、枝顶孢等正在增多。以往常引起皮下感染或过敏性窦炎，但近年常见引起系统性感染和播散性感染并威胁生命。这些病原菌一些是嗜神经的并且常引起正常人或衰弱病人中枢神经系统感染。地方流行性双相真菌：播散性马尔尼菲青霉病是东南亚艾滋病人的第三大特征性真菌感染病。但此菌的自然界分布情况尚不清楚，竹鼠是自然宿主，但与人类疾病的关系尚不清楚。全球性侵袭性真菌病的流行病学改变白念珠菌的感染仍占首位，但非白念珠菌的比重增多主要为光滑、热带、近平滑和都柏林念珠菌等，其他酵母菌如毛孢子菌，红酵母，Pichiaanomala(必赤酵母),马拉色菌、酿酒酵母等。引起透明丝孢霉病的菌种的改变，除暗色真菌外，镰刀菌、拟青霉属、波氏霉样菌、枝顶孢等正在增多。以往常引起皮下感染或过敏性窦炎，但近年常见引起系统性感染和播散性感染并威胁生命。这些病原菌一些是嗜神经的并且常引起正常人或衰弱病人中枢神经系统感染。地方流行性双相真菌：播散性马尔尼菲青霉病是东南亚艾滋病人的第三大特征性真菌感染病。但此菌的自然界分布情况尚不清楚，竹鼠是自然宿主，但与人类疾病的关系尚不清楚。美国医院内血液感染10种最常见的分离出的病原菌(DianMicrobiolInfectDis,1998;30:121-129);Coagulase(-)staphylococciS.aureusEnterococcussppCandidaspp.EscherichialcoliKlebsiellasppPseudomonasspp北京协和医院统计3447例尸解的深部真菌感染率5.23％1.04％华西医科大学附属一院1988.1～1997.12医院真菌感染调查结果我们所面临的任务收集流行病学资料，发现新致病菌研究生物学特性，探索诊断新方法发现耐药菌株，帮助指导治疗条件致病真菌感染危险因素国外：血液系统肿瘤病人

—粒细胞减少、

__骨髓移植器官移植ICUHIV感染国内：广谱抗生素应用ICU皮质激素糖尿病静脉插管流行病学—病原菌过去20年间大量文献报道引起医院真菌感染的主要致病菌为念珠菌属、毛霉属、曲霉属、酵母属。美国CDC发现医院里最具威胁性的病菌是念珠菌，占医院真菌感染的80％；国内报道为74.5％，亦有报道为96.09％。我国系统性真菌感染的致病菌—条件致病菌—致病性双相真菌念珠菌组织胞浆菌曲霉球孢子菌隐球菌芽生菌接合菌马尔尼菲青霉镰刀菌孢子丝菌暗色真菌酵母菌毛孢子菌枝顶孢霉条件致病菌AspergillusCandida机会来了！念珠菌的感染—注意非白念珠菌的增多带来的问题---天然耐药株和获得性耐药株的增多医院真菌感染菌种分布

（北京大学第一医院）72.6%12.1％

医院真菌感染菌种分布

（华西医科大学第一附属医院）59.46％20.95％8.11％尿培养阳性标本中念珠菌菌种分布（北京大学第一医院）-----新出现的病原菌相对带给真菌工作者的问题——

常常难于诊断并且难鉴定到属。——

一些菌对抗真菌药物治疗抵抗——

引起的疾病常有较高的致死率。——流行病学较难解释。医学真菌学面临严峻挑战----免疫功能受损患者的增加真菌感染日益严峻的问题病原菌种类不断变化，新出现的致病菌缺乏早期快速的实验室诊断方法现有的实验室检测阳性率低，结果很难解释。医学真菌检验工作者面临机遇和挑战

——深入研究病原真菌的特性

——提高真菌检验水平

——帮助临床医生尽早作出诊断

——鉴定病原菌株，寻找敏感药物

——提高治愈率，降低死亡率真菌感染流行病学

——探讨危险因素，了解病原菌类别病原菌种类：白念珠菌占首位、其次为热带念珠菌、光滑念珠菌和近平滑念珠菌。非白念珠菌的比例有所上升；曲霉感染在血液系统肿瘤患者中十分突出；隐球菌性脑膜炎感染免疫缺陷者增多，偶可感染免疫功能正常的个体。其它少见菌深部感染引人注目。真菌感染逐年增加带来问题：耐抗真菌药的非白念珠菌在增加（光滑念珠菌，近平滑念珠菌）非曲霉属的真菌也在增加对两性霉素B耐药的非烟曲霉菌在临床出现深部真菌感染目前存在的问题真菌广泛定殖于人体的各个部位及存在于周围环境中，在免疫缺陷者引起感染。临床医师诊断困难：没有典型症状和体征较难作出实验室诊断：缺乏良好的检查方法，或检查的价格昂贵临床医师送检的标本不注重真菌的监测送检的标本不合乎真菌检验的要求实验室的检测阳性率不高，如血培养（30%）实验室的结果在临床上难以解释：污染？定植？致病？了解病原真菌生物学特性—至关重要形态学温度试验营养需求血清学特性分子生物学特性药敏特性从临床标本中发现真菌并确定其意义医师对实验室诊断的反映关键是什么?阳性结果只能证明医师的判断阴性结果不能改变要进行的治疗方案.痰中发现真菌：定植或污染？机会性真菌感染当前的两大机会性真菌：系统性念珠菌感染侵袭性曲霉菌病严重的地方性流行性真菌感染：马尔尼菲青霉感染伴随AIDS逐渐——检验工作者首先应该了解

真菌的概念、分类、结构及特征。真菌的有性生殖、无性生殖。真菌的致病性（毒素、致敏性、侵入性）宿主的抵抗力真菌的概念真菌（Fungi）是原始的真核生物，其系统研究至今已有300年历史具有真正的细胞核通常分为枝繁叶茂的丝状体，菌丝呈顶端生长有坚硬的细胞壁—几丁质通过细胞壁吸收营养，分泌胞外酶降解不被吸收的多聚物，是异养型通过有性和无性繁殖方式迅速产生孢子延续种族真菌在生物界的地位

五界分类系统原生生物界原核生物界壶菌门真菌界接合菌门植物界担子菌门动物界子囊菌门真菌

酵母菌丝状真菌—微形丝状真菌（霉菌）原形丝状真菌（蘑菇、木耳）

真菌的致病方式真菌毒素变态反应浅部真菌感染深部真菌感染（系统性真菌感染：侵犯2个器官以上）

常见：念珠菌病曲霉菌病隐球菌病病原真菌的常见检验方法常用器械和材料直接镜检法培养法血清学方法分子生物学鉴定方法真菌的直接镜检技术常用器械皮肤取材方法

刮取法粘贴法钻孔法湿片法1氢氧化钾法KOH:10~30gdH2O:100mL长期保存可加入10~20%的甘油（丙三醇）2复方氢氧化钾法

KOH:10gDMSO:40mL

甘油：5mLdH2O:加至100mL3氢氧化钾刚果红法A液：刚果红100mg,dH2O100mLB液：KOH10g，dH2O100mL染色时A先染1~2min，如角质层较厚再加1滴B液，加盖玻片观察。实验室诊断方法

样本组织：活检体液：尿、血液、脑脊液人体分泌物：痰液、粘液体表：口腔、伤口、皮肤、阴道检测方法：直接法：镜检、光镜和荧光培养免疫组化间接法：微生物物质（代谢物如1-3-ß-D-葡聚糖，酶如烯醇化酶，细胞壁如内毒素，半乳甘露聚糖）核酸如PCR。血清学，全细胞裂解物，特异性抗体染色法糖原染色法（PAS法）：革兰氏染色法抗酸染色法镀银染色法瑞氏-姬氏染色法：主要用于荚膜组织胞浆菌和马尔尼菲青霉的染色各种检查方法及其相应的适应症

检查方法适应症湿片法

KOH法皮肤癣菌，念珠菌，花斑癣菌，头癣，暗色真菌，等KOH刚果红法:皮肤癣菌，念珠菌，花斑癣菌等复方KOH法:角质层较厚的标本如甲癣等生理盐水法:生殖道念珠菌派克黑水KOH法:糠秕孢子菌墨汁法:新生隐球菌乳酸酚棉兰法:阴道分泌物、脓等真菌标本染色法

沙黄染色法：糠秕孢子菌PAS：深部真菌涂片检查如孢子丝菌等革兰氏染色：放线菌，诺卡氏菌，念珠菌等抗酸染色：放线菌，诺卡氏菌瑞氏染色：荚膜组织胞浆菌，马尔尼菲青霉菌等镀银染色：目前真菌病诊断方法——乳胶凝集试验检测新生隐球菌抗原ELISA法检测念珠菌和曲霉抗原免疫组化、原位杂交技术用于深部真菌病诊断种特异性引物并应用于菌种鉴定

——曲霉、外瓶霉、镰刀菌、孢子丝菌

PCR？？稳定、特异问题系统性念珠菌感染在发生感染前，念珠菌首先在异物或细胞表面黏附，一旦定居完成，即通过多种机制（包括移位）进入血液。由某种原因导致正常肠道念珠菌大量繁殖，加之肠道黏膜屏障功能障碍，真菌进入血流。可以随血流进入多个脏器，--肾、心、肺、脑。念珠菌感染的危险因素念珠菌感染伴随高死亡率念珠菌血症的死亡率确诊后48小时内治疗，40%48小时后治疗：78%病原性酵母的鉴定程序及方法鉴定目的：确定感染及传染源选择敏感的抗真菌药监视治疗效果病原性酵母的鉴定程序及方法培养特征：菌落颜色、形状和质地无性的结构：细胞的形状和大小出芽方式：双极、裂殖、多极或单极方式有性结构：排列、细胞壁结构、子囊孢子和芽生孢子的数目形状及大小。生理学特征：同化试验放线菌酮耐受试验发酵试验明胶液化试验生长试验：高渗培养基，缺乏维生素的培养基硝酸盐同化利用试验：温度试验分解尿素酶试验:念珠菌的鉴定25°C与37°C皆生长厚膜孢子形成试验血清芽管试验生化试验（发酵与同化试验）API20、ID32科马嘉色原鉴定平板血培养：心内膜炎80％（＋）尿培养：（＋）常表示严重感染血清学试验：应有合理解释PCR：防止假阳性代谢产物检测：D/L阿拉伯糖醇，(1→3)-β-D-glucan

念珠菌的鉴定1970止念珠菌分81个种，7个变种主要致病念珠菌包括白念珠菌非白念珠菌CandidatropicalisC.kruseiC.stellatoideaC.parapsilosisC.pseudotropicalisC.guilliermondiiC.dubliniensis

血清芽管试验作法：菌接种于0.5~1ml正常人血清，

37℃培养，30min~3h，显微镜下观察，出芽现象意义：鉴定白念珠菌（98%为白念，2%为类星型）

TZC（沙氏琼脂加入0.0005%氮化三苯基四氮唑）白念珠菌不使培养基变色或仅呈淡红色其他念珠菌使培基变红，热带变深红或紫色米粉土温琼脂培养基成份：米粉10g琼脂20g

土温8010g蒸馏水1000ml制法：先将米粉用蒸馏水稀释（若米粉太粗可过筛）再加琼脂溶化，两者混均，最后加入土温80，分装高压灭菌用途：观察白念菌的厚膜孢子，用于鉴定白念菌生化试验白念星型热带付热带克柔付克柔季也蒙沙氏管底管底表面气泡管底管壁管底管底米粉厚膜孢子少数－－－－－TZC不变或淡红红紫红淡红红红血清芽管芽管－－－－－发酵葡萄糖******/+*麦芽糖***--+/-+蔗糖+-**-+/-*乳糖---+---同化葡萄糖＋＋＋＋＋＋＋麦芽糖＋＋＋－－＋＋蔗糖＋－＋＋－＋＋乳糖－－－＋－－－尿沉渣涂片革兰氏染色Gram-stainedslidefromabloodculture曲霉菌感染——日益严重的问题曲霉菌是继念珠菌之后的第二大常见感染真菌免疫抑制患者发病较高。缺乏较好的诊断方法生前诊断困难，初期症状不明显。分离数■烟曲霉■其他曲霉19931994199519961997199819992000年图1994-1999年某医学中心烟曲霉及非烟曲霉分离数(DiagMicrobiolInfectDis,2001;41:211-214)是目前医学真菌学迫切需要解决的问题宿主免疫性以及病原体毒力因子之间的相互作用宿主免疫毒力因子烟曲霉的致病机理与色素合成有关的基因烟曲霉产生的胞外酶烟曲霉的代谢酶组氨酸激酶基因烟曲霉的毒力因子曲霉菌病的实验室诊断手段血培养：肺泡灌洗液或支冲液的真菌培养当曲霉在体内和体外生长时，可以释放外抗原，侵袭性曲霉病患者的体液中可以检测到。侵袭性曲霉病的抗原检测包括：乳胶凝集试验，放免法，酶联免疫吸附抑制试验及sandwich-ELISA等血清中半乳甘露聚糖抗原的检测可预测肺曲霉菌病。PCR法GM抗原检测用于侵袭性曲霉病诊断与临床诊断和疗效反应有良好的一致性。检测方法有ELISA、放射免疫分析（RIA）和乳胶凝集试验等，但敏感性低。ELISA检测24只兔中(王莉，等。2003)：检测敏感性和特异性血清95%和78%

尿液90%和51.4%检测曲霉GM抗原的ELISA试验JunZhaoetal.JCM2001NestedPCRinAnimalModels余进，等。中华检验医学杂志，2003种特异引物巢式PCR扩增烟曲霉rRNA基因动物模型中巢式PCR方法检测的灵敏度

动物模型（只数）巢式PCR阳性结果（百分比）血培养阳性结果（百分比）侵袭性肺烟曲霉感染小鼠（29）23（79.3%）2（6.9%）烟曲霉血症小鼠（25）19（76%）7（28%）总计（54）42（77.8%）9（16.7%）灵敏度=77.8%半乳甘露聚糖抗原组织中生长的曲霉释放半乳甘露聚糖，可以在血、尿、BALF、心包液、脑脊液中测的。以病理活检对照研究，敏感性92.6%，特异性95.4%，先于临床和影像学改变，可能与预后相关。假阳性：细胞膜药物治疗，损伤黏膜屏障，GCM吸收。假阴性：不同菌株释放GCM能力不同，宿主因素产生高滴度抗体，影响测定。血管损伤程度不同。半乳甘露聚糖抗原的检测至少每周2次临界值：嗜中性粒细胞减少者0.5~0.8推荐方法：频繁重复检测结合其他方法（CT,BAL,培养，病理活检）试验性治疗隐球菌与隐球菌病

隐球菌广泛存在于自然界中，吸入孢子为主要感染途径病原菌为新生隐球菌及其变种（上海变种与格特变种新生隐球菌按血清型分A、B、C、D及AD五型我国A型最多，尚未发现D型鸽粪被认为是最重要的传染源马、奶牛、猫、狗、猪、山羚羊等动物也可分离出此菌

隐球菌病是由隐球菌属中某些种及变种引起的一种深部真菌病隐球菌感染占机会性真菌感染的第三位中枢神经系统隐球菌病占80％原发肺部感染常无症状（占1/3），或上感样症状侵犯CNS最常见，症状也最重还可引起皮肤隐球菌病、骨隐球菌病、隐球菌性败血症近年艾滋病人群中隐球菌感染发生率呈上升趋势，与肺孢子虫病、念珠菌病、侵袭性曲霉菌病等成为该病的主要死因隐球菌的鉴定技术直接镜检：标本中直接找到隐球菌（墨汁涂片、Gram、PAS、姬姆萨染色法）真菌培养：可加氯霉素，不可加放线菌酮病理检查：肉芽肿形成，炎细胞浸润，发现菌体抗原检查：乳胶凝集试验抗体检查：阳性率不高PCR检查：不确定隐球菌病的诊断要点临床症状：主要是脑膜脑炎的表现。实验室检查：直接镜检标本中直接找到隐球菌培养有隐球菌生长。病理检查：肉芽肿形成，炎细胞浸润，发现菌体抗原检查：乳胶凝集试验阳性新生隐球菌乳胶凝集试验第三世界与AIDS有关的真菌病副球孢子菌病组织胞浆菌病侵袭性曲菌感染马尔尼菲青霉病芽生菌病孢子丝菌病皮肤癣菌病接合菌病马尔尼菲青霉感染与艾滋病

PenicilliosismarniffeiinChina

马尔尼菲青霉病定义与地理分布是一种由马尔尼菲青霉感染所引起，主要累及单核—巨噬细胞系统引起全身广泛播散的严重的深部真菌病。病死率高。自1973年首例报道以来，对此菌引起的感染引起重视，但发生有一定的地域性，在艾滋病流行以前，我国仍较为罕见，主要在东南亚地区，如泰国、越南、柬埔寨、老挝、香港和我国南方的广西等地。但近年来随着艾滋病发病率的升高，该病报道也日渐增多，尤以泰国发病率为高，仅ChiangMai一地就已有1300例以上AIDS伴发马尔尼菲青霉感染的病例，成为AIDS的标志之一。也为泰国艾滋病患者中继肺结核（31.3％）、隐球菌病脑膜炎（24.1％）之后第三大条件致病菌感染。马尔尼菲青霉感染也已成为曾经居住过或访问过东南亚或中国南部的AIDS患者的最常见的机会性感染之一。艾滋病患者即使短时间暴露于病原菌即可被感染。广东省近年来马尔尼菲青霉感染的报道也逐渐增多，已超过20余例，其中50%与AIDS有关。流行区域可能比已知的更广泛。致病菌及其生存环境马尔尼菲青霉为双相真菌，在自然界以菌体形式存在在组织中为小的圆形到椭圆形细胞通过分裂进行增殖自然生存环境至今尚未确定，从发病的地理分布看，主要来自东南亚及中国的南部，约赤道以北至北纬25~30º的地区。该区自然条件的特点除温度和湿度外还适于甘蔗、竹子和竹鼠的生长。

传染源传染源尚未明了，竹鼠与马尔尼菲青霉关系密切。已发现广西境内的银星竹鼠普遍带有马尔尼菲青霉。但该鼠生活于深山，少与人接触。又有推测可能与人和竹鼠皆喜食甘蔗和竹笋（可能为菌的滋生地植物）另外，土壤也是该菌的主要生存地，可能也是人类感染的主要来源。银星竹鼠马尔尼菲青霉的双相性菌丝相酵母相37℃Culture26℃Culture马尔尼菲青霉的双相性26℃Culture37℃Culture马尔尼菲青霉感染感染途径：通过吸入已经存在于空气中的孢子而致病的肺通常是最早受累的器官但大多数患者表现为广泛的播散性损害。也是最常见的临床表现一些病例的感染可能由于免疫抑制而使陈旧性病灶重新活动。另一些病灶的感染可在暴露于流行区区域后几周内出现。发病机制本菌主要寄生于细胞内，主要靠细胞免疫清除病菌，若细胞免疫缺陷极易感染发病。个体易感性也是主要原因。该菌有明显的嗜单核吞噬细胞系统倾向，无论由何处入侵都难逃单核吞噬细胞的吞噬，可能单核吞噬细胞具有相应的受体。艾滋病患者如果出现发热、皮疹、肺部病变、广泛的淋巴结炎或肝脾肿大应考虑马内青霉感染进一步检查

镜检培养骨髓涂片皮肤印片淋巴结活检37℃培养

26℃培养瑞氏染色真菌培养双相性表现：

26℃Culture特殊的葡萄酒红色色素37℃Culture生长缓慢的灰褐色或奶色蜡样菌落26℃Culture37℃CultureCase1皮疹直接涂片PAS染色皮疹直接涂片PAS染色Case1抗