黄曲霉毒素试剂盒说明书-

黄曲霉毒素B1酶联免疫检测试剂盒使用说明书Ⅰ．样品处理方法食品1、脂肪含量小的固体样品〔如大米、玉米、小米等〕称取5.0g样品〔已粉碎〕于100ml具塞三角瓶中，准确加入25.0ml甲醇水〔1+1〕溶液，振摇15min，过滤，弃去1/4初滤液，收集试样滤液，依据样品的国家同意量标准，用A试剂将滤液进行稀释〔见表1：样品稀释表〕。将样品稀释液进行定量或限量测定。酱油、醋称取5.0g样品于25ml小烧杯中，用5ml蒸馏水将试样转移到125ml分液漏斗中，加入20ml三氯甲烷，加塞轻轻振摇3min，静置分层。放出下层三氯甲烷层，经盛有约5g预先用三氯甲烷湿润的无水Na2SO4过滤器于100ml蒸发皿中，再加5ml三氯甲烷于分液漏斗中，重复振摇提取，三氯甲烷层一并滤于蒸发皿中，最后用少量三氯甲烷洗涤过滤器，洗液并于蒸发皿中，65℃水浴通风挥干。挥干冷却后，准确加入25.0ml甲醇水〔1+1〕，将蒸发皿中的凝结物充分溶解。依据样品的国家同意量标准，用A试剂将提取液进行稀释〔见表1：样品稀释表〕。将样品稀释液进行定量或限量测定。食用油〔如菜油、麻油、色拉油、花生油等〕〔1+1〕溶液，加塞轻轻振摇5min，静置分层，放出下层甲醇水提取液。依据样品的国家同意量标准，用A试剂将提取液进行稀释〔见表1：样品稀释表〕。将样品稀释液进行定量或限量测定。4、葡萄酒准备称取5.0g葡萄酒于125ml分液漏斗中，加入20ml三氯甲烷，加塞轻轻振摇3min，静置分层。放出下层三氯甲烷层，经盛有约5g预先用三氯甲烷湿润的的无水Na2SO4过滤器于100ml蒸发皿中，再加5ml三氯甲烷于分液漏斗中，重复振摇提取，三氯甲烷层一并滤于蒸发皿中，最后用少量三氯甲烷洗涤过滤器，洗液并于蒸发皿中，65℃水浴通风挥干。挥干冷却后，准确加入25.0ml甲醇水〔1+1〕，将蒸发皿中的凝结物充分溶解。依据样品的国家同意量标准，用A试剂将提取液进行稀释〔见表1：样品稀释表〕。将样品稀释液进行定量或限量测定。5、啤酒、黄酒准确吸取5.0ml样品于25ml容量瓶，准确加入12.5ml甲醇，再用蒸馏水定容至25ml。振摇10min，此即为待测样品液。将待测样品稀释液进行定量或限量测定。假设结果为阳性，则采纳葡萄酒中AFB1的提取方法进行测定。6、花生样品去皮粉碎〔刀切或剪切〕，称取5.0g于100ml具塞三角瓶中。加入25.0ml甲醇水〔1+1〕和20ml正乙烷〔或石油醚〕，振摇10min，过滤于分液漏斗中，静置分层。放出下层提取液，依据样品的国家同意量标准，用A试剂将提取液进行稀释〔见表1：样品稀释表〕。将样品稀释液进行定量过限量测定。7、月饼、桃酥、花生酱等称取10.0g试样于125ml具塞锥形瓶中，加入50.0ml甲醇水〔1+1〕提取液和20ml正乙烷〔或石油醚〕加塞震荡15min，过滤，收集滤液于分液漏斗中，静置分层。待下层甲醇水溶液澄清后，放出甲醇水溶液于另一锥形瓶中。准备吸取10.0ml甲醇水提取液〔相当2.0g样品〕于125ml分液漏斗中，加入20ml三氯甲烷，加塞轻轻振摇3min，静置分层。放出下层三氯甲烷层，经盛有约5g预先用三氯甲烷湿润的无水Na2SO4过滤器于100ml蒸发皿中，再加5ml三氯甲烷于分液漏斗中，重复振摇提取，三氯甲烷层一并滤于蒸发皿中，最后用少量三氯甲烷洗涤过滤器，洗液并于蒸发皿中，65℃水浴通风挥干。挥干冷却后，准确加入10.0ml甲醇水〔1+1〕，将蒸发皿中的凝结物充分溶解。依据样品的国家同意量标准，用A试剂将提取液进行稀释〔见表1：样品稀释表〕。将样品稀释液进行定量或限量测定。8、面粉称取10.0g面粉样于100ml具塞三角瓶中，准确加入50.0ml甲醇水〔1+1〕溶液，震荡15min,过滤，收集试样滤液。准确吸取10.0ml滤液〔相当于2.0g样品〕125ml分液漏斗中，加入20ml三氯甲烷层，加塞轻轻振摇3min，静置分层。放出下层三氯甲烷层，经盛有约5g预先用三氯甲烷湿润的无水Na2SO4过滤器于100ml蒸发皿中，再加5ml三氯甲烷于分液漏斗中，重复振摇提取，三氯甲烷层一并滤于蒸发皿中，最后用少量三氯甲烷洗涤过滤器，洗液并于蒸发皿中，65℃水浴通风挥干。挥干冷却后，准确加入10.0ml甲醇水〔1+1〕，将蒸发皿中的凝结物充分溶解。依据样品的国家同意量标准，用A试剂将提取液进行稀释〔见表1：样品稀释表〕。将样品稀释液进行定量或限量测定。二、饲料1、一般饲料及原料称取5.0g样品于100ml具塞三角瓶中，准确加入25.0ml甲醇水〔1+1〕溶液，振荡15min，过滤，弃去初滤液。收集滤液。依据样品的国家同意量标准，用A试剂将滤液进行稀释〔见表1：样品稀释表〕。将样品稀释液进行定量或限量测定。2、饲料浓缩料称取10.0g样品于100ml具塞三角瓶中，准确加入50.0ml甲醇水〔1+1〕溶液，振荡15min,过滤，收集试样过滤。准备吸取10.0ml甲醇水提取液〔相当2.0g样品〕于125ml分液漏斗中，加入20ml三氯甲烷，加塞轻轻振摇3min，静置分层。放出下层三氯甲烷层，经盛有约5g预先用三氯甲烷湿润的无水Na2SO4过滤器于100ml蒸发皿中，再加5ml三氯甲烷于分液漏斗中，重复振摇提取，三氯甲烷层一并滤于蒸发皿中，最后用少量三氯甲烷洗涤过滤器，洗液并于蒸发皿中，65℃水浴通风挥干。挥干冷却后，准确加入10.0ml甲醇水〔1+1〕，将蒸发皿中的凝结物充分溶解。依据样品的国家同意量标准，用A试剂将提取液进行稀释〔见表1：样品稀释表〕。将样品稀释液进行定量或限量测定。样品稀释表表1样品稀释表样品同意量〔µg/kg〕样品提取液〔ml〕A试剂〔ml〕样品稀释倍数〔D〕≤5直接量取01≤102≤153≤204≤306≤5010Ⅱ.黄曲霉毒素B1测试盒使用说明书〔定量检测〕本测试盒利用固相酶联免疫吸附〔ELISE〕原理，通过抗黄曲霉毒素B1抗体与酶标抗原、待测抗原的竞争免疫反应以及酶的催化显色反应相结合来检测AFB1，适用于食品、饲料及相关原料中AFB1的定量检测，特点是灵敏度高，特异性好，操作简便，结果易判读。测试盒组成1、包被抗体的反应板：48/24/12孔2、A试剂：样品稀释液1瓶3、B试剂：AFB1标准溶液1套〔0.1，0.5，1.5，10ng/ml〕4、C试剂：酶标抗原2/1瓶5、D试剂：酶标抗原稀释液1瓶6、E试剂：浓缩洗涤液1瓶7、F试剂：显色底物液a1瓶8、G试剂：显色底物液b1瓶9、H试剂：终止液1瓶10、反应板支架：1块实验准备样品处理：详见“Ⅰ.样品处理方法〞试剂的配制=1\*GB2⑴每瓶C试剂中准确加入1.5mlD试剂，充分溶解，配成实验用酶标抗原溶液，2-8℃储存。=2\*GB2⑵E试剂用300ml蒸馏水配制成洗涤液。实验步骤试剂平衡：将测试盒取出，放置15min以上，平衡至室温。小孔编号：依据需要截取相当孔数放置反应板支架上。设定1号孔为仪器调零孔，2号孔为阴性孔，3-7号孔为AFB1标准对照孔，其余孔为样品孔。洗涤：每孔加入250µl左右洗涤液，洗液不得溢出，放置1min后甩掉洗涤液，在吸水纸上拍干，重复洗板一次。4、反应物组成：按以下步骤所示，依次加入配制好的溶液及待测样品稀释液。第一步：1号孔和2号孔分别加入50µlA试剂，3-7号控分别加入系列浓度的B试剂〔0.1，0.5，1，5，10ng/ml〕50µl,其余孔分别加入相应的样品稀释液。第二步：1号孔加入50µlD试剂，其余各孔均加入50µlC试剂。第三步：轻轻地振摇，使各孔的反应物混匀。表2反应物组成表操作次序加入量孔号12345678910111212350µl50µlAA0.10.51510样品稀释液DCCCCCCCCCCC摇匀5、反应：将反应板放入37℃恒温培养箱中孵育30min。6、洗涤：取出反应板，用力甩掉反应液，拍手。每孔加入250µl左右洗涤液，洗液不得溢出，放置2min后，甩掉洗涤液，在吸水纸上拍干，重复洗板4次。7、显色：每孔分别加入显色低物液a〔F试剂〕和显色底物液b(G试剂)各50µl,摇匀，将反应板放入37℃恒温培养箱中显色15min。8、终止与仪器测定：每孔分别加入终止液〔H试剂〕50µl，然后用酶测定仪〔或黄曲霉毒素B1专用测定仪〕在450nm波长处测定各孔的吸光度A值。9、定量测定：将浓度为0，0.1，1，5，10ng/ml的AFB1系列标准工作溶液，按上述实验步骤测定相应的吸光度A值，并绘制成标准曲线〔见图一〕。横坐标为标准液浓度的常用对数值〔1gC〕，纵坐标为各标准液孔A值与标准液为0ng/ml的A值的比值〔A标准液/A〔0ng/ml〕〕。计算样品孔A值与A(0ng/ml)(A样品/A(0ng/ml))，查标准线，可得到相应样品稀释浓度〔C〕的常用对数值lgC，对其求反对数，可求得样品稀释液的AFB1浓度C。按以下公式计算出样品中AFB1的含量：AFB1含量〔ng/g〕=C×(V/M)×D式中：C:稀释后样品提取液中AFB1含量〔ng/ml〕V:样品提取液体积〔ml〕M:样品质量〔g〕D:样品稀释倍数四、测试盒贮存1、2-8℃贮存，忌0℃以下冻存。2、有效期6个月。五、样品同意量标准请参阅〔GB2671-81，GB8381-87〕六、批号：见测试盒Ⅲ.黄曲霉毒素B1测试盒使用说明书〔限量检测〕测试盒组成包被抗体的反应板：48/24/12孔A试剂：样品稀释液1瓶B试剂：AFB1标准溶液1瓶C试剂：酶标抗原2/1瓶D试剂：酶标抗原稀释液1瓶E试剂：浓缩洗涤液1瓶F试剂：显色底物液a1瓶G试剂：显色底物液b1瓶H试剂：终止液1瓶反应板支架：1块实验准备样品处理：祥见“Ⅰ.样品处理方法〞试剂的配制每瓶C试剂中准确加入1.5ml试剂，充分溶解，配成实验用酶标抗原溶液，2-8℃储存。E试剂用300ml蒸馏水配制成洗涤液。实验步骤试剂平衡：将测试盒取出，放置15min以上，平衡至室温。小孔编号：依据需要截取相当孔数放置反应板支架上。设定1号孔为仪器调零孔，2号孔为阴性对照孔，3号孔为阳性对照孔，其余孔为样品孔。洗涤：每孔加入250µl左右洗涤液，洗液不得溢出，放置1min后，甩掉洗液，在吸水纸上拍干，重复洗板一次。4、反应物组成：按以下步骤所示，依次加入配制好的溶液及待测样品稀释液。第1步：1号孔和2号孔分别加入50µlA试剂，3号孔加入50µlB试剂，其余孔加入相应的样品稀释液。第2步：1号孔加入50µlD试剂，其余各孔均加入50µlC试剂。第3步：轻轻地振摇，使各孔中的反应物混匀。表3反应物组成表操作次序加入量孔号12345678910111212350µl50µllAAB….………样品稀释液……..DCCCCCCCCCCC摇匀5、反应：将反应板放入37℃恒温培养箱中孵育30min。6、洗涤：取出反应板，用力甩掉反应液，拍干。每孔加入250µl左右洗涤液，洗液不得溢出，放置2min后，甩掉洗涤液，在吸水纸上拍干，重复洗板4次。7、显色：每孔分别加入显色低物液a〔F试剂〕和显色底物液b(G试剂)各50µl,摇匀，将反应板放入37℃恒温培养箱中显色15min，目视法测定。〔注：可适当延长显色时间，使颜色加深，以利目视。〕8、限量推断目视法测定：先比较1-3号孔颜色。假设2号孔〔阴性孔〕颜色最深，3号孔〔阳性孔〕次之，1号孔〔空白孔〕接近无色，说明试剂有效及操作无误。比较样品孔与3号孔〔阳性孔〕颜色，假设浅者，则为阳性，假设深者，则为阴性，假设颜色接近，则用仪器法或国标法验证。仪器法测定：每孔分别加入终止液〔H试剂〕50µl,然后用酶测定仪〔或黄曲霉素B1专用测定仪〕在450nm波长处测定各孔的吸光度A值，假设A样品孔〈A阳性孔为阳性，假设A样品孔≥A阳性孔为阴性.假设样品显阳性,则其AFB1含量可推断为:AFB1含量(ng/g)＞l.0ng/ml×(V/M×D)V:样品提取液体积〔ml〕M:样品质量〔g〕D:样品稀释倍数四、测试盒贮存1、2-8℃贮存，忌0℃以下冻存。2、有效期6个月。五、样品同意量标准请参阅〔GB2671-81，GB8381-87〕六、批号：见测试盒Ⅳ.实验操作流程图及注意事项实验操作流程图适当稀释加样37℃，30min样品提取———→试剂准备———→免疫反应————→37℃，15min目测、仪器测量显色反应————→结果判定—————→计算含量注意事项洗涤时要迅速，洗涤液不可溢出，以防交叉污染；加样时要准确，直接加到小孔底部，不可有气泡，不要加到孔壁上；试剂使用前摇匀；整个加样过程要快，确保前后反应时间一致；加样后要轻请震摇整板，使反应液混匀；每次洗涤要先用力甩干后再拍干，最后要擦干板底，以利于仪器检测；不同批次测试盒的试剂不能混用；每次测试时应尽量使用新配制的洗涤液；虽AFB1标准浓度很低，但是严格规范的实验操作不可忽视，凡接触到标样的器皿都要用5%NaCIO浸泡半天后再清洗备用。Ⅴ.主要技术指标及参数测试盒分三种规格：12孔、24孔、48孔。反应孔可拆卸，可测单份样品，亦可测多份样品，定量测定每次需要6个标准孔，假设半定量测定只需3个标准孔。测试盒的主要技术指标及参数：最低检出浓度：0.1ng/ml;回收率：87%-95%；交叉反应系数：0-0.21；检测范围：0.1-10ng/ml;重复性：条内＜10%，条间＜15%。Ⅵ.实验室基本配置酶标仪〔内置450nm滤光片〕或黄曲霉素B1专用测定仪50ul微量移液器及配套吸头恒温培养箱〔0℃-50℃〕冰箱〔4℃-8℃〕玻璃器皿：锥形瓶，烧杯，分液漏斗，蒸发皿。量筒，具塞试管，滴管，移液管等小型粉碎机或碾钵其他：滤纸，吸水纸等Ⅶ.相关文献饲料中黄曲霉毒素B1的测定方法〔GB/T17480-1998〕食品中黄曲霉毒素B1的测定方法〔GB/T5009.22-1996〕，食品卫生标准使用手册理化检验方法[M]，1998〔第一辑〕；137-161。国家质量监督检验检疫总局。关于印发小麦粉等5类食品生产许可证实施细则的通知。国质检监[2002]192号[J].粮食与饲料工业，1994，10：41-43.[J].中