自然保护区陆生脊椎动物蚂蝗iDNA监测技术规程-标准草案

本文件以蚂蝗为代表性样本，规定了基于iDNA（无脊椎动物来源的DNA）对自然保护区的陆生脊椎DNA宏条形码扩增、高通量测序数据的存储本文件适用于林业系统的管理机构和进行相关研究的学术机构在可采集到吸血性蚂蝗的自然保护GB/T6682-2008分析实验室用水规GB/T30989-2014高通量基因GB/T42398-2023细胞培养洁净室SN/T4714-2016DNA条条件下，对极少量的基因组DNA或RNA样品中的特定基因片段进行选高通量测序high-throughp生物体内能够代表该物种的、标准的、有足够变异的、易扩增且相一段寡核苷酸的短序列，通常在合成引物时添加在上游和下游引物的5‘端，用于标记不同的PCR产核糖体RNA是核糖体的主要成分之一，而核糖体是细胞中的一种细胞器，由一大一小两个亚基确定不含任何物种DNA的样本（如无菌水），与正式样本同步操作，作为判断实验已知物种或已知DNA序列组成的样本，与正式可操作分类单元operationaltaxo物种不存在但是却被检测到，主要是由于实际操作中极微量的DNA污染造成的，可能来自整个工作4缩略语RNA：核糖核酸（ribonucleiPCR：聚合酶链式反应（polymerasechainrearRNA：核糖体RNA（ribosomOTU：可操作分类单元（operationaltaxonom5.1通则元均匀地划分为若干个（1-5km）×（1-5km）的样地。全区监测方案——以所有样地为工作区域对自然保护区全境样区监测方案——在每个监测单元随机抽选若干样地（不应少于5个）为工作区域进行监测，实际可行走的路线完成，并使用GPS（全球定位椎动物来获得的脊椎动物DNA，所以需要在这些无脊椎动物进食活跃的季节进行样本采集。例如蚂蝗的集到的蚂蝗数量而定，每个自封袋对应一条样线，并装有一张蚂蝗样本信息采集来到设定样线后，在样线起点就打开GPS进行定位，在整个采集过程中开启路径记录功能，直到样信息应于当天导入电脑,及时按照统一格式修改定位信息的文件名称，名称中至少应包含采样日期和样周内放入4℃冰箱冷藏，1个月内放入-20℃冷冻保存。注意在样本冻存期从事iDNA样本操作的分子实验室应该按照功能划分区域，至少应包含样本预处理区、DNA提取区、试剂准备区、PCR工作区，实验室所有分整个iDNA实验室应采用严格的单向工作流程，即只能按照试剂准备区→DNA提取纯化区→PCR工作区的方向移动，每个分区配备专用耗材和设备，任何情况下不得将样本或DNA溶液（引物、探针等试剂所有样本在进行DNA提取前都应做好相关信息登记和实验室编号，在进入DNA提取纯化区前应在样本预处理区做好去污染措施——用次氯酸钠消毒液擦拭装有样本的容器外表面，然后在容器表面标记将消毒过的样本带入DNA提取纯化区后，先用次氯酸钠消毒液和无水乙醇擦拭操作台面，并按照待处理的样本数量准备好所需要的器具耗材,再开始处理样本——用无菌镊子将蚂蝗从保存液中取出，转注意事项——以上所用镊子等器具必须保证在样本之间经过充分的消毒处理，以避免样本间的交叉污染。另外，转移用的离心管具体大小（2ml/5ml/15ml/50ml）应根据蚂蝗的数量和体积确定，这里的步骤以Qiagen的DNeasyBlood&Tissa)按照样本的称取重量（可以用相同的空离心管对天平进行去皮）加入消化液，每25mg样本需g)将纯化柱14000rpm离心2分钟，将套使用紫外分光光度计对样本DNA进行质量测定，吸光度比值OD2间，OD260/OD230的比值应该大于2.0。每份DNA应该分为2份，1份作为工作液放在4℃冷藏待用，另1份作为备份应于-20℃及以下温度条件冻存引物——选择脊椎动物类群的通用引物对iDNA进行扩增，可以根据监测区域的目标物种群对现有同样本的扩增序列。标签序列可以参考附录D，也可以自行设计，只要能保证可以区分不同样本并且不PCR扩增——为了降低PCR扩增导入的错误突变，应使用具有校正功能的高保真DNA聚使用的是TAKARA的ExTaq®HotStartVersion，具体的PCR扩增体系和程序请参见附录E。每个样本对于每对引物应至少进行3次独立PCR，这些独立PCR之间应使用不同的标签对，也就是测序结果中每个样PCR产物的纯化和定量——使用商用试剂盒进行PCR产物的纯化，具体步骤应按照所选择试剂盒的根据引物标签对PCR产物进行DNA文库的分组，基本原则就是同一个DNA文库中同一组标签对仅能出均可使用双端测序150bp的测序模式，然后使用相应的PCR产物建库试剂盒构建文库。文库构建完成后需要对文库进行质检，确定文库的片段长度分布符合预期，并且文库浓度满足相平均质量阈值应高于20，reads长度应与所选择的测序模式（例如150（2）质控——通过搜索特定序列去除reads中残余的测序接头序列，去除reads两端的低质量(<中的标签和引物序列，并根据扩增产物的预期片段大小筛除过短或者过长的序列。可用程序如DAMe或板DNA分子，这种嵌合体是需要去除的错误数据。可用程（5）OTUs聚类——由于iDNA的高度降解性和考虑到目标物种的跨类群较广，一般所记片段较短（大约为100bp）并且较为保守，所以本标准建议用99%的相似度阈值对传多样度、参考数据来源的可靠性以及参考数据库的完整性等。对于无法匹配到物种的OTU序列，需要（7）结果统计——汇总同一批次所有样本的最终结果，统计表内容应包含样本的相关信（8）数据储存——将原始数据、分析脚本和分析结果按照项目、测序批次、基因、析时间进行建档保存，存储介质可以采用移动硬盘、云存储等，存储备份不得少于2份以防出现意外损坏等情况，必须定期整理和及时更新相关数iDNA技术的高敏感性意味着很容易产生假阳性的结果，因此在整个iDNA工作流程中防污染措施尤2)进入DNA提取纯化区前必须用次氯酸钠消毒液对保存样本的容器（如采集管）进行擦拭甚6)严格遵守8.1中提及的iDNA单向工作流程，必须经过全身清洁和更换干净的衣物后才能重新进专用或保持单向流程，如果有不得不反向操作的物8)洁净室内的实验记录应提前在电脑上编写好，实验前使用wifi连接洁净室内的专用打印机将9)及时处理当日的实验垃圾，尤其对于沾染或含有DNA的垃圾应该先用阳性对照——在PCR扩增时，应设置阳性对照，阳性对照的DNA可以置过滤参数，比如3次PCR中至少应出现2次以及每次PCR中至少出现n次的序列才能够保留，通过这样的过滤可以在清除污染数据的同时，也尽可能保留DNA含量较低的稀有物种的数据。与阴性对照相比，阳性对照还有一个作用，就是在正常样本PCR或者测序失败时，可以提供判断失败根源的依据，即试剂或操作的问题，还是样本本身（如DNA浓度过低）的问题，从而在重新实验时采取合对于同一样线或样点在同一时间段采集到的样本，应按照实际的采集数量均匀的分成若干份子样其它物种DNA的检出，从而导致假阴性的结果，因此将样本分成若干份，可以增加稀有物种的检测率。另外，对于浓度越低的DNA，PCR的扩增随机性就越强，而iDNA中作为目标的脊椎动物DN附录A附录B123—4—附录CC.1.21DNAMarker：由若干不同大小的DNA组成，用于凝胶电泳中DNA长度的判断依据。C.2耗材C.2.8一次性手套：无粉乳胶手套C.3仪器设备C.3.1低温存储设备：2℃~8℃的附录D附录E用量(μL）22附录F门纲目科属种参考⽂献【1】HJ710.3-2014生物多样性观测技术导则陆生哺乳动物【3】JiYinqiu,BakerC.M.Christopher,PopescuD.Viorel,WangJiaxin,WuChunyingWu,WangZhengyang,LiYuanheng,WangLin,HuaChaolang,YangZhongxing,YangChunyan,XuY.Charles,DianaAlex,WenQingzhong,PierceE.NaomiandYuW.Douglas.Measuriprotected-areaeffecti