2016食品实验室检测作业指导书

食品（酱、酱腌菜、调味油）检测作业指导书

文件编号：S"%S（P/3CZY2016

受控状态：因受控口非受控

版本号：（B/0

发放编号：AM-001

令舄珍恻行Q族焉名

编制：宛）穹

审核：哮耒建

批推：#晓?

2016-09-18发布2016-10-18实施

复於笏㈤爱仄金晶布限公司

目录

第一部分酱品检测.........................................................1

第1章水分的测定........................................................1

第2章食盐的测定........................................................5

第3章氨基酸态氮的测定..................................................6

第4章总酸的测定........................................................7

第5章过氨化值的测定....................................................8

第6章还原糖的测定......................................................9

第7章大肠菌群的检测...................................................11

第8章菌落总数的测定...................................................16

第二部分酱腌菜检测.....................................................20

第1章水分的测定.......................................................20

第2章食盐的测定.......................................................24

第3章总酸的测定.......................................................27

第4章还原糖和总糖的测定...............................................28

第5章二氧化硫残留的检测...............................................30

第6章亚硝酸盐和硝酸盐的测定...........................................31

第7章总碑的测定.......................................................35

第8章铅的测定.........................................................37

第9章大肠菌群的检测...................................................39

第10章菌落总数的测定..................................................44

第11章沙门氏菌检验....................................................48

第三部分调味油检测.....................................................66

第1水分及挥发物测定....................................................66

第2酸价的测定..........................................................68

第3过氧化值的测定......................................................69

第1页共72页

第一部分酱品检测

第1章水分的测定

执行标准：GB5009.3—2011食品安全国家标准食品中水分的测定

第一法直接干燥法

1原理

利用食品中水分的物理性质，在101.3kPa（一个大气压），温度101C〜105℃下采用挥发方法

测定样品中干燥减失的重量，包括吸湿水、部分结晶水和该条件下能挥发的物质，再通过干燥前后

的称量数值计算出水分的含量。

2试剂和材料

除非另有规定，本方法中所用试剂均为分析纯。

盐酸溶液（6mol/L）：量取50mL盐酸,加水稀释至100mL。

氢氧化钠溶液（6mol/L）：称取24g氢氧化钠，加水溶解并稀释至100mL。

海砂：取用水洗去泥土的海砂或河砂，先用盐酸煮沸0.5h,用水洗至中性，再用氢氧化钠溶

液煮沸0.5h,用水洗至中性，经105℃干燥备用。

3仪器和设备

扁形铝制或玻璃制称量瓶、电热恒温干燥箱、干燥器（内附有效干燥剂）、天平（感量为O.lmg）

4分析步骤

4.1固体试样：取洁净铝制或玻璃制的扁形称量瓶，置于101℃〜105℃干燥箱中，瓶盖斜支于瓶边,

加热LOh,取出盖好，置干燥器内冷却0.5h,称量，并重复干燥至前后两次质量差不超过2mg,即

为恒重。将混合均匀的试样迅速磨细至颗粒小于2mm,不易研磨的样品应尽可能切碎，称取2g〜10g

试样（精确至0.0001g）,放入此称量瓶中，试样厚度不超过5mm,如为疏松试样，厚度不超过10mm,

加盖，精密称量后，置1010c〜105℃干燥箱中，瓶盖斜支于瓶边，干燥2h〜4h后，盖好取出，放

入干燥器内冷却0.5h后称量。然后再放入101℃〜105c干燥箱中干燥lh左右，取出，放入干燥器

内冷却0.5h后再称量。并重复以上操作至前后两次质量差不超过2mg,即为恒重。（注：两次恒重

值在最后计算中，取最后一次的称量值。）

4.2半固体或液体试样：取洁净的称量瓶，内加10g海砂及一根小玻棒，置于101℃〜105℃干燥箱

中，干燥1.Oh后取出，放入干燥器内冷却0.5h后称量，并重复干燥至恒重。然后称取5g〜10g试

样（精确至0.0001g）,置于蒸发皿中，用小玻棒搅匀放在沸水浴上蒸干，并随时搅拌，擦去皿底的

水滴，置101℃〜105℃干燥箱中干燥4h后盖好取出，放入干燥器内冷却0.5h后称量。以下按4.1

自“然后再放入101℃〜105℃干燥箱中干燥1h左右”起依法操作。

5分析结果的表述

试样中的水分的含量按式（1）进行计算。

X=100（mi-m2）/（m-m3）（1）

式中：

X——试样中水分的含量，单位为克每百克（g/100g）；

m,——称量瓶（加海砂、玻棒）和试样的质量，单位为克（g）；

叱——称量瓶（加海砂、玻棒）和试样干燥后的质量，单位为克（g）;

013——称量瓶（加海砂、玻棒）的质量，单位为克（g）。

水分含量》lg/100g时，计算结果保留三位有效数字；水分含量＜lg/100g时，结果保留两位有

效数字。

6精密度

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在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的5%。

第二法减压干燥法

7原理

利用食品中水分的物理性质，在达到40kPa〜53kPa压力后加热至60℃±5℃,采用减压烘干方

法去除试样中的水分，再通过烘干前后的称量数值计算出水分的含量。

8仪器和设备

真空干燥箱、扁形铝制或玻璃制称量瓶、干燥器（内附有效干燥剂）、天平（感量为0.1mg）

9分析步骤

9.1试样的制备：粉末和结晶试样直接称取：较大块硬糖经研钵粉碎，混匀备用。

9.2测定：取已恒重的称量瓶称取约2g〜10g（精确至0.0001g）试样，放入真空干燥箱内，将真空

干燥箱连接真空泵，抽出真空干燥箱内空气（所需压力一般为40kPa~53kpa）,并同时加热至所需温

度60℃±5℃。关闭真空泵上的活塞，停止抽气，使真空干燥箱内保持一定的温度和压力，经4h后，

打开活塞，使空气经干燥装置缓缓通入至真空干燥箱内，待压力恢复正常后再打开。取出称量瓶，

放入干燥器中0.5h后称量，并重复以上操作至前后两次质量差不超过2mg,即为恒重。

10分析结果的表述

同5o

11精密度

在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%o

第三法蒸储法

12原理

利用食品中水分的物理化学性质，使用水分测定器将食品中的水分与甲苯或二甲苯共同蒸出，

根据接收的水的体积计算出试样中水分的含量。本方法适用于含较多其他挥发性物质的食品，如油

脂、香辛料等。

13试剂和材料

甲苯或二甲苯（化学纯）：取甲苯或二甲苯，先以水饱和后，分去水层，进行蒸储，收集馈出液

备用。

14仪器和设备

14.1水分测定器：如图1所示（带可调电热套）•水分接收管容量5mL,最小刻度值0.1mL,容量误

差小于0.1mLo

1.250mL蒸储瓶：2.水分接收管，有刻度；3.冷凝管。

图1水分测定器

14.2天平：感量为0.Imgo

15分析步骤

准确称取适量试样（应使最终蒸出的水在2矶〜5mL,但最多取样量不得超过蒸储瓶的2/3）,

放入250mL锥形瓶中，加入新蒸镭的甲苯（或二甲苯）75mL,连接冷凝管与水分接收管，从冷凝管

顶端注入甲苯，装满水分接收管。加热慢慢蒸微，使每秒钟的储出液为两滴，待大部分水分蒸出后,

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加速蒸馈约每秒钟4滴，当水分全部蒸出后，接收管内的水分体积不再增加时，从冷凝管顶端加入

甲苯冲洗。如冷凝管壁附有水滴，可用附有小橡皮头的铜丝擦下，再蒸微片刻至接收管上部及冷凝

管壁无水滴附着，接收管水平面保持lOmin不变为蒸馈终点，读取接收管水层的容积。

16分析结果的表述

试样中水分的含量按式（2）进行计算。

X=lOOV/m（2）

式中：

X——试样中水分的含量，单位为毫升每百克（mL/100g）（或按水在20℃的密度0.998,2Og/mL

计算质量）；

V——接收管内水的体积，单位为毫升（mL）；

m-试样的质量，单位为克（g）o

以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。

17精密度

在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。

第四法卡尔•费休法

18原理

根据碘能与水和二氧化硫发生化学反应，在有毗咤和甲醉共存时，Imol碘只与Imol水作用，

反应式如下：

C5H5N«21+CsHsN^SOz+C5H5N+H2O+CH30H2c5H$N・HI+C5HMs0£上］

卡尔•费休水分测定法又分为库仑法和容量法。库仑法测定的碘是通过化学反应产生的，只要电

解液中存在水，所产生的碘就会和水以1：1的关系按照化学反应式进行反应。当所有的水都参与了

化学反应，过量的碘就会在电极的阳极区域形成，反应终止。容量法测定的碘是作为滴定剂加入的，

滴定剂中碘的浓度是已知的，根据消耗滴定剂的体积，计算消耗碘的量，从而计量出被测物质水的

含量。

19试剂和材料

卡尔•费休试剂、无水甲醇（C1I40）：优级纯

卡尔•费休水分测定仪、天平（感量为0.1mg）、

21分析步骤

21.1卡尔•费休试剂的标定（容量法）

在反应瓶中加一定体积（浸没伯电极）的甲醇，在搅拌下用卡尔•费休试剂滴定至终点。加入

10mg水（精确至0.0001g）,滴定至终点并记录卡尔•费休试剂的用量（V）。卡尔•费休试剂的滴定

度按式（3）计算：

T=M/V（3）

式中：

下—卡尔•费休试剂的滴定度，单位为毫克每毫升（mg/mL）；

M---水的质量，单位为毫克（mg）；

/—滴定水消耗的卡尔•费休试剂的用量，单位为毫升（mL）。

21.2试样前处理

可粉碎的固体试样要尽量粉碎，使之均匀。不易粉碎的试样可切碎。

21.3试样中水分的测定

于反应瓶中加一定体积的甲醇或卡尔•费休测定仪中规定的溶剂浸没箱电极，在搅拌下用卡

尔•费休试剂滴定至终点。迅速将易溶于上述溶剂的试样直接加入滴定杯中；对于不易溶解的试样,

应采用对滴定杯进行加热或加入已测定水分的其他溶剂辅助溶解后用卡尔•费休试剂滴定至终点。建

议采用库仑法测定试样中的含水量应大于10g,容量法应大于100g。对于某些需要较长时间滴定的试

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样，需要扣除其漂移量。

21.4漂移量的测定

在滴定杯中加入与测定样品一致的溶剂，并滴定至终点，放置不少于lOmin后再滴定至终点，

两次滴定之间的单位时间内的体积变化即为漂移量(D)»

22分析结果的表述

固体试样中水分的含量按式(4),液体试样中水分的含量按式(5)进行计算。

X=100(V-DXt)XT/M(4)

X=100(V,-DXt)XT/(V2p)(5)

式中：

X——试样中水分的含量，单位为克每百克(g/100g)；

V,——滴定样品时卡尔•费休试剂体积，单位为毫升(mL)；

T——卡尔•费休试剂的滴定度，单位为克每毫升(g/疝)；

M——样品质量，单位为克(g);

V2——液体样品体积，单位为毫升(mL)；

D—漂移量，单位为毫升每分钟(mL/min)；

t——滴定时所消耗的时间，单位为分钟(min)；

P——液体样品的密度，单位为克每毫升(g/mL)。

水分含量》lg/100g时，计算结果保留三位有效数字；水分含量＜lg/100g时，计算结果保留两

位有效数字。

23精密度

在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。

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第2章食盐的测定

执行标准GB5009.40酱卫生标准的分析方法

1试剂

硝酸银标准溶液(C(AgN03)=0.1000mol/l)：按GB601规定配制

铭酸钾指示剂(50g/l)：称取5g铝酸钾用少量水溶解后定容至100ml。

2分析步骤

称取约5.0g已研磨均匀的试样置于100ml烧杯中，加入蒸镯水50ml充分搅拌(必要时加热)，

移入100ml容量瓶中，用少量水分次洗涤烧杯，洗液并入容量瓶中，并加水至刻度，混匀。

吸取2.0ml稀释液于200ml锥形瓶中，加100ml水及1ml锯酸钾溶液(50g/l),混匀，用硝酸

银标准溶液(0.1000mol/l)滴定至初显桔红色。

量取100ml水，同时做试剂空白试验。

3计算

X=100X(V-V2)XCXO.0585X100/(5X2)

式中：

X——样品中食盐(以NaCl计)含量，g/100ml

C——硝酸银标准溶液实际浓度，mol/1；

V,——测定用试样稀释液消耗硝酸银标准溶液的体积，ml；

V2——试剂空白消耗用硝酸银标准溶液的体积，ml；

0.0585——与1.00ml硝酸银标准滴定溶液C(AgN03)=L000mol/l)相当的氯化钠的重量，g；

4精密度

在重复性条件下获得得到两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10虬

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第3章氨基酸态氮的测定

执行标准GB5009.40酱卫生标准的分析方法

第一法甲醛值法

1原理

利用氨基酸的两性作用，加入甲醛以固定氨基的碱性，使竣基显示出酸性，用氢氧化钠标准溶

液滴定后定量，以酸度计测定终点。

2试剂

甲醛(36%)：应不含聚合物、氢氧化钠标准溶液［C(NaOH)=0.050mol/l］

3仪器

酸度计、磁力搅拌器、10ml微量滴定管

4分析步骤

称取约5.0g已研磨均匀的试样置于100ml烧杯中，加入蒸储水50ml充分搅拌(必要时加热)，

移入100ml容量瓶中，用少量水分次洗涤烧杯，洗液并入容量瓶中，并加水至刻度，混匀。

吸取10.0ml,置于200ml烧杯中，加60ml水，开动磁力搅拌器，用氢氧化钠标准溶液［C(NaOH)

=0.050moi/I］滴定至酸度计指示pH8.2,记下消耗氢氧化钠标准溶液的毫升数，可计算总酸含量。

加入10.0ml甲醛溶液，混匀。再用氢氧化钠标准滴定溶液继续滴定至PH9.2,记下消耗氢氧化

钠标准滴定溶液的毫升数。

同时取80ml水，先用氢氧化钠标准溶液调节至PH为8.2,在加入10.0ml甲醛溶液，用氢氧化

钠标准溶液滴定至PH9.2,同时做试剂空白试验。

5结果计算

试验中氨基酸态氮的含量按下式进行计算。

X=100X(V-V2)XCXO.014X100/(5XV3)

式中：

X——试样中氨基酸态氮的含量，单位为克每百毫升(g/100ml)；

V,——测定用试样稀释液加入甲醛后消耗氢氧化钠标准溶液的体积，单位为毫升(ml)

V2——试剂空白试验加入甲醛后消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积，单位为毫升(ml)

V3——试样稀释液取用量，单位为毫升(ml)

C——氢氧化钠标准溶液的浓度，单位为莫尔每升(mol/1)

0.014——与1.00ml氢氧化钠标准溶液［C(NaOH)=L000mol/l］相当的氮的质量，单位为克(g)

计算结果保留两位有效数字。

6精密度

在重复性条件下获得得到两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10虬

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第4章总酸的测定

执行标准GB5009.40酱卫生标准的分析方法

1原理

酱油中含有多种有机酸，用氢氧化钠标准溶液滴定，以酸度计测定终点，结果以乳酸表示。

2试剂

氢氧化钠标准溶液［C（NaOH）=0.050mol/l］

3仪器

酸度计、磁力搅拌器、10ml微量滴定管

4分析步骤

称取约5.0g已研磨均匀的试样置于100ml烧杯中，加入蒸储水50ml充分搅拌（必要时加热），

移入100nli容量瓶中，用少量水分次洗涤烧杯，洗液并入容量瓶中，并加水至刻度，混匀。

吸取10.0ml上述稀释液，置于200ml烧杯中，加60ml水，开动磁力搅拌器，用氢氧化钠标准

溶液［C（NaOH）=0.050mol/l］滴定至酸度计指示p【I8.2,记下消耗氢氧化钠标准溶液的毫升数，可

计算总酸含量。称取70ml水，同时做试剂空白试验。

5结果计算

试验中总酸的含量按下式进行计算。

X=100X（V-V2）XCXO.090X100/（5XV3）

式中：

X——试样中总酸的含量（以乳酸计），单位为克每百毫升（g/IOOml）；

V,——测定用试样稀释液消耗氢氧化钠标准溶液的体积，单位为毫升（ml）

V2——试剂空白消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积，单位为毫升（ml）

V3——试样稀释液取用量，单位为毫升（ml）

C——氢氧化钠标准溶液的浓度，单位为莫尔每升（mol/1）

0.090——与1.00ml氢氧化钠标准溶液［C（Na0H）=1.000mol/l］相当的乳酸的质量，单位为克（g）

计算结果保留三位有效数字。

6精密度

在重复性条件下获得得到两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10机

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第5章过氧化值的测定

执行标准：GB/T5009.37—2003食用植物油卫生标准的分析方法

1原理

油脂氧化过程中产生过氧化物，与碘化钾作用，生成游离碘，以硫代硫酸钠溶液滴定，计算含

量。

2试剂

饱和碘化钾溶液：称取14g碘化钾，加水10ml溶解，必要时微热使其溶解，冷却后贮于棕色瓶

中。

三氯甲烷-冰乙酸混合液：两取40ml三氯甲烷，加60ml冰乙酸，混匀。

硫代硫酸钠标准滴定溶液0.0020mol/L

淀粉指示剂（10g/l）：称取可溶性淀粉0.50g,加少许水调成糊状，倒入50ml沸水中调匀，煮沸。

临用时现配。

3分析步骤

称取2.00—3.00g混匀（必要时过滤）的试样，置于250ml碘量瓶中，加30ml三氯甲烷-冰乙酸

混合液，使试样完全溶解。加入1.00ml饱和碘化钾溶液，紧密塞好瓶盖，并轻轻振摇0.5min,然后

在暗处放置3min。取出加100ml水，摇匀，立即用硫代硫酸钠标准滴定溶液滴定，至淡黄色时，加

1ml淀粉指示液，继续滴定至蓝色消失为终点，取相同量三氯甲烷-冰乙酸溶液、碘化钾溶液、水，

按同一方法，做试剂空白试验。

4计算结果

试样的过氧化值按下式进行计算。

XI=（V|-V2）XCX0.1269X100/m

X2=X］X78.8

式中：

x,——试样的过氧化值，单位为克每克（g/100g）；

X2——试样的过氧化值，单位为毫克当量每千克（meq/kg）；

V,——试样消耗硫代硫酸钠标准滴定溶液的体积，单位为毫升（ml）;

V2——试剂空白消耗硫代硫酸钠标准滴定溶液的体积，单位为毫升（ml）；

C——硫代硫酸钠标准滴定的实际浓度，单位为莫尔每升（mol/1）；

m---试样质量，单位为克（g）；

0.1269——与1.0ml硫代硫酸钠标准滴定溶液［c=1.000mol/l］相当的碘的质量，单位为克（g）；

78.8——换算因子

计算结果保留两位有效数字。

5精密度

在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%o

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第6章还原糖的测定

执行GB/T5009.7—2008食品中还原糖的测定

1试剂

碱性酒石酸铜甲液：称取硫酸铜15g及次甲基蓝0.05g溶解于1000ml蒸储水中；

碱性酒石酸铜乙液：称取酒石酸钾钠50g,氢氧化钠75g及亚铁氟化钾4g溶解于1000ml蒸储

水中；

葡萄糖标准溶液：lg/晨准确称取在100℃烘箱中烘至恒重的无水葡萄糖1.0000g放入100ml

烧杯中，用蒸储水溶解后倒入1000ml容量的瓶中，用蒸镭水反复冲洗烧杯，洗液一并倒入容量瓶，

加浓盐酸5ml,用蒸谯水稀释至刻度。

乙酸锌溶液（219g/l）：称取21.9g乙酸锌，加3ml冰乙酸，加水溶解并稀释至100ml。

亚铁氟化钾溶液（106g/l）：称取10.6g亚铁氟化钾，加水溶解并稀释至100ml。

盐酸溶液（1:1）：量取50ml盐酸，加水稀释至100ml。

2样品处理

样品经切碎、研磨、混合均匀后，称取2.500g〜5.000g,放入250ml容量瓶中，加入蒸储水50ml,

慢慢加入5nli乙酸锌溶液及5ml亚铁氟化钾溶液，加水至刻度，混匀，静置30min,用干燥滤纸过

滤，弃去初滤液，取续滤液备用。

3操作

3.1标定碱性酒石酸铜溶液

取碱性酒石酸铜甲、乙液各5.00ml于150ml锥形瓶中，加入10ml蒸储水，加入玻璃珠两粒，

用糖滴管加入9ml左右lg/1葡萄糖标准溶液，摇均后加热（电炉应预热15min后使用），使其在2min

内沸腾。沸腾30s后，以一滴/2s（空白滴定，预备滴定，正式滴定的速度均应保持一致）的速度匀

速滴入lg/1葡萄糖液，至蓝紫色消失即为终点。溶液沸腾后标准糖液的耗用量应控制在0.5nli〜1ml

之内，否则应重做。记录沸腾前后共耗用标准糖液的毫升数。同时平行操作三份，取其平均值，计

算每10ml（甲、乙液各5ml）碱性酒石酸铜溶液相当于葡萄糖的质量（mg）（也可按上述方法标定4

—20ml碱性酒石酸铜溶液（甲、乙液各半）来适应试样中还原糖的浓度变化）

3.2试样溶液的预备滴定

取碱性酒石酸铜甲、乙液各5.00ml于150ml锥形瓶中，加入10ml蒸储水，加入玻璃珠两粒，

摇均后加热（电炉应预热15min后使用），使其在2min内沸腾。保持沸腾以先快后慢的速度，从滴

定管中滴加试样溶液，并保持溶液沸腾状态，待溶液颜色变浅时，以一滴/2s（空白滴定，预备滴定，

正式滴定的速度均应保持一致）的速度匀速滴定，直至蓝色消失即为终点。记录样液消耗的体积。

当样液中还原糖浓度过高时，应适当稀释后再进行正式测定，使每次滴定消耗样液的体积控制在与

标定碱性酒石酸铜溶液时所消耗的还原糖标准溶液的体积相近，约10ml左右，结果按式（1）计算。

当浓度过低时则采取直接加入10ml样品液，免去加水10ml,再用还原糖标准溶液滴定至终点，记

录消耗的体积与标定时消耗的还原糖标准溶液体积之差相当于10ml样液中所含还原糖的量，结果按

式（2）计算。

3.3试样溶液的正式滴定

取碱性酒石酸铜甲、乙液各5.00ml于150ml锥形瓶中，加入10ml蒸储水，加入玻璃珠两粒，

从滴定管滴加比预测体积少1ml的试样溶液至锥形瓶中，使在2min内加入至沸，保持沸腾继续以1

滴/2S的速度滴定，直至蓝色消失即为终点，记录样液消耗的体积，同法平行操作三份，得出平均

消耗体积。

4计算

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试样中还原糖的含量按(1)式进行计算:

X=100m1/(mXV/250X1000)(1)

式中：

x——样品中还原糖的含量，g/100g；

ml——碱性酒石酸铜溶液(甲、乙液各半)相当于还原糖的质量，mg；

m---试样质量，g；

V——测定时平均消耗试样溶液的体积，ml；

当浓度过低时试样中还原糖的含量按式(2)进行计算：

X=100m2/(mX10/250X1000)(2)

式中：

x——样品中还原糖的含量，g/100g；

m2——标定时体积与加入样品后消耗的还原糖标准溶液体积之差相当于某种还原糖的质量，

mg；

m---试样质量，g；

还原糖含量210g/100g时计算结果保留三位有效数字；还原糖含量W10g/100g时计算结果保留两位

有效数字。

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第7章大肠菌群的检测

执行标准：GB4789.3—2010食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数

1设备和材料

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：

恒温培养箱（36℃±1℃）、冰箱（2℃~5℃）、恒温水浴箱（46±1℃）、天平（感量0.1

g）、均质器、振荡器、无菌吸管口mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液

器及吸头］、无菌锥形瓶（容量500mL）、无菌培养皿（直径90mm）,pH计或pH比色管或精密pH

试纸、菌落计数器

2培养基和试剂

2.1月桂基硫酸盐胰蛋白豚（LaurylSulfateTryptose,LST）肉汤：见附录A中A.1。

2.2煌绿乳糖胆盐（BrilliantGreenLactoseBile,BGLB）肉汤：见附录A中A.2。

2.3结晶紫中性红胆盐琼脂（VioletRedBileAgar,VRBA）：见附录A中23。

2.4磷酸盐缓冲液：见附录A中A.4。

2.5无菌生理盐水：见附录A中A.5。

2.6无菌1mol/LNaOH：见附录A中A.6。

2.7无菌1mol/LHC1：见附录A中A.7»

第一法大肠菌群MPN计数法

3检验程序

大肠菌群MPN计数的检验程序见图1。

图1大肠菌群MPN计数法检验程序

6操作步骤

6.1样品的稀释

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6.1.1固体和半固体样品：称取25g样品，放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质

杯内，8000r/min~10000r/min均质1min~2min,或放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水

的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min〜2min,制成1:10的样品匀液。

6.1.2液体样品：以无菌吸管吸取25ml样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形

瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。

6.1.3样品匀液的pH值应在6.5~7.5之间，必要时分别用1mol/LNaOH或1mol/LHC1调节。

6.1.4用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1mL,沿管壁缓缓注入9mL磷酸盐缓

冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支1mL

无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。

6.1.5根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀

释1次，换用1支1mL无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15mino

6.2初发酵试验

每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种

3管月桂基硫酸盐胰蛋白豚（LST）肉汤，每管接种1mL（如接种量超过1mL,则用双料LST肉汤），

36"C±l七培养24h±2h,观察倒管内是否有气泡产生，24h±2h产气者进行复发酵试验，如

未产气则继续培养至48h+2h,产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。

6.3复发酵试验

用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）管中，

36℃±1℃培养48h±2h,观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。

6.4大肠菌群最可能数（MPN）的报告

按6.3确证的大肠菌群LST阳性管数，检索MPN表（见附录B）,报告每g（mL）样品中大肠菌

群的MPN值。

第二法大肠菌群平板计数法

7检验程序

8操作步骤

8.1样品的稀释

按6.1进行。

8.2平板计数图2大肠菌群平板计数法检验程序

8.2.1选取2个〜3个适宜的连续稀释度，每个稀释度接种2个无菌平皿，每皿1mL。同时取

1mL生理盐水加入无菌平皿作空白对照。

8.2.2及时将15mL〜20mL冷至46℃的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）约倾注于每个平皿中。

小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加3mL〜4mLVRBA覆盖平板表层。翻

转平板，置于36℃±1℃培养18h〜24ho

8.3平板菌落数的选择

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选取菌落数在15CFU〜150CFU之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。

典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0.5mm或更大。

8.4证实试验

从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于BGLB肉汤管内，36℃±

1°C培养24h〜48h,观察产气情况。凡BGLB肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。

8.5大肠菌群平板计数的报告

经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以8.3中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为

每g(mL)样品中大肠菌群数。例：10-4样品稀释液1mL,在VRBA平板上有100个典型和可疑菌

落，挑取其中10个接种BGLB肉汤管，证实有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：100X6/10

X104/g(mL)=6.0X105CFU/g(mL)。

附录A

(规范性附录)

培养基和试剂

A.1月桂基硫酸盐胰蛋白豚(LST)肉汤

A.1.1成分

胰蛋白豚或胰酪腺20.0g

氯化钠5.0g

乳糖5.0g

磷酸氢二钾(K2HP04)2.75g

磷酸二氢钾(KH2P04)2.75g

月桂基硫酸钠0.1g

蒸储水1000mL

pH6.8±0.2

A.1.2制法

将上述成分溶解于蒸懦水中，调节pH。分装到有玻璃小倒管的试管中，每管10mL。121℃高

压灭菌15min。

A.2煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤

A.2.1成分

蛋白陈10.0g

乳糖10.0g

牛胆粉(oxgall或oxbile)溶液200mL

0.1%煌绿水溶液13.3mL

蒸储水800mL

pH7.2±0.1

A.2.2制法

将蛋白豚、乳糖溶于约500mL蒸锵水中，加入牛胆粉溶液200mL(将20.0g脱水牛胆粉溶于

200mL蒸播水中，调节pH至7.0~7.5),用蒸储水稀释到975mL,调节pH,再加入0.1%煌绿水溶

液13.3mL,用蒸储水补足到1000mL,用棉花过滤后，分装到有玻璃小倒管的试管中，每管10mL。

121℃高压灭菌15min。

A.3结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)

A.3.1成分

蛋白陈7.0g

酵母膏3.0g

乳糖10.0g

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氯化钠5.0g

胆盐或3号胆盐1.5g

中性红0.03g

结晶紫0.002g

琼脂15g~18g

蒸镭水1000mL

pH7.4±0.1

A.3.2制法

将上述成分溶于蒸储水中，静置几分钟，充分搅拌,调节pH。煮沸2min,将培养基冷却至45℃〜

50℃倾注平板。使用前临时制备，不得超过3ho

A.4磷酸盐缓冲液

A.4.1成分

磷酸二氢钾（KH2P04）34.0g

蒸储水500niL

pH7.2

A.4.2制法

贮存液：称取34.0g的磷酸二氢钾溶于500mL蒸偏水中，用大约175mL的1mol/L氢氧化钠

溶液调节pH,用蒸储水稀释至1000矶后贮存于冰箱。

稀释液：取贮存液1.25mL,用蒸储水稀释至1000mL,分装于适宜容器中，121℃高压灭菌

15min。

A.5无菌生理盐水

A.5.1成分

氯化钠8.5g

蒸储水1000mL

A.5.2制法

称取8.5g氯化钠溶于1000mL蒸镭水中，121℃高压灭菌15min。

A.6lmol/LNaOH

A.6.1成分

NaOH40.0g

蒸储水1000mL

A.6.2制法

称取40g氢氧化钠溶于1000mL蒸储水中，121C高压灭菌15min。

A.71mol/LHC1

A.7.1成分

HC190mL

蒸储水1000mL

A.7.2制法

移取浓盐酸90mL,用蒸储水稀释至1000mL,121℃高压灭菌15min。

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附录B

(规范性附录)

大肠菌群最可能数(MPN)检索表

B.1大肠菌群最可能数(MPN)检索表

阳性管数95%可信限阳性管数95%可信限

MPNMPN

0.100.010.001下限上限0.100.010.001下限上限

000<3.0—9.5220214.542

0013.00.159.6221288.794

0103.00.1511222358.794

0116.11.218230298.794

0206.21.218231368.794

0309.43.638300234.694

1003.60.1718301388.7110

1017.21.31830264171SH

102113.638310439180

1107.41.3203117517200

111113.63831212037420

120113.64231316040420

121154.542320931842U

130164.54232115037420

2009.21.43832221040430

201143.642323290901,000

202204.542330240421,000

210153.742331460902,000

211204.54233211001804,100

212278.794333>1100420—

注1：本表采用3个稀释度[0.1g(mL),0.01g(mL)和0.001g(mL)],每个稀释度接种3管.

注2：&内所列检样量如改用lg(mL)、0.1g(mL)和0.01g(mL)时，表内数字应相应降低10倍；如改用0.01

g(mL)、0.001g(mL),0.0001g(mL)时，则表内数字应相应增高10倍，其余类推.