水稻稻瘟病菌抗药性风险评估技术规范

1水稻稻瘟病菌抗药性风险评估技术规范本文件规定了水稻稻瘟病菌抗药性风险评估技术规范，包括病原菌的分离、敏感性测定、抗药性风险评估、抗性风险管理等。本文件适用于水稻稻瘟病菌抗药性风险评价。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。NY/T1156.1-2006农药室内生物测定试验准则杀菌剂第1部分：抑制病原真菌孢子萌发试验凹玻片法NY/T1156.2-2006农药室内生物测定试验准则杀菌剂第2部分：抑制病原真菌菌丝生长试验平皿法NY/T1859.6-2014农药抗性风险评估第6部分：灰霉病菌抗药性风险评估NY/T3257-2018水稻稻瘟病抗性室内离体叶片鉴定技术规程3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1稻瘟病菌fungiofriceblast引起水稻稻瘟病的丝状真菌稻瘟病菌，有性态为Magnaportheoryzae，无性态为Pyriculariaoryzae。3.2敏感性基线sensitivebaseline通过生物测定方法得到的有害生物敏感品系（或株系或生物型）对药剂的剂量反应曲线。3.3敏感菌株sensitivestrain在未接触过某种药剂的地区采集或在室内多代隔离培养获得的菌株，即为该药剂的敏感菌株。3.4抗性菌株resistancestrain指长期施用杀菌剂，出现对某种药物反应敏感性降低的病原菌，即为对该药剂的抗性菌株。3.5药剂驯化fungicideadaption用杀菌药剂连续对稻瘟病菌处理，使其对杀菌剂的耐受能力发生改变的过程。3.6紫外诱变UV-mutagenesis2用紫外线照射稻瘟病菌菌丝或者孢子，使其发生与抗药性相关的突变。3.7抗性突变体resistantmutant病原菌经过杀菌药剂或者紫外线处理后，对药剂敏感性发生改变的菌株。3.8抗性指数resistancefactor抗性菌株对该药剂的敏感性与其亲本菌株敏感性或与敏感基线的平均EC50的比值。3.9交互抗药性cross-resistance稻瘟病菌由于相同的抗药性机制，对靶标药剂以外的其它杀菌剂产生的抗药性。4试验方法4.1病原菌的分离于水稻分蘖末期采集稻瘟病病样，病原菌的分离按照NY/T3257-2018执行。4.2敏感性测定4.2.1药剂配制将有效含量90%以上的药剂原药使用合适的溶剂进行溶解稀释，配制成1×104μg/mL的母液，现配现用，溶剂的最终含量不超2%。4.2.2药剂浓度梯度设置药剂可配置5~7个浓度，浓度梯度应呈等比递进关系。浓度设置理论上应使最低浓度对病原菌的抑制率在15%左右，最高浓度对病原菌的抑制率在85%左右。4.2.3测定方法4.2.3.1菌丝生长速率测定法本方法适用于作用机制为抑制菌丝生长的药剂。将分离的稻瘟病菌接种至含不同浓度的含药培养基上，同时设置不含药培养基作为空白对照，28℃黑暗培养8天，采用十字交叉法测量菌落直径，并计算抑菌率。具体步骤参照NY/T1156.2-2006执行。4.2.3.2孢子萌发测定法本方法适用于作用机制为抑制孢子萌发的药剂。使用番茄燕麦培养基制备稻瘟病菌孢子，并使用无菌水将浓度调节至105个/mL孢子悬浮液，吸取100μL孢子悬浮液均匀涂布在含有不同药剂浓度的水琼脂培养基平板上，28ºC下光暗交替培养8~12h（空白对照孢子萌发95%时），显微镜下检查孢子的萌发率（芽管长度达孢子宽度的1/2视为萌发）。具体步骤参照NY/T1156.1-2006执行。4.2.4敏感性基线确定在未使用过待评估药剂及与其相同作用机制药剂的多个代表性地区采集供试稻瘟病菌（50~100株）。按照NY/T1156.1~1156.2-2006中的方法测定其对该药剂的敏感性（EC50值）。供试菌株的敏感性分布频率中的正态分布单峰内的药剂敏感性（EC50值）平均值可作为稻瘟病菌对该药剂的敏感性基线。35抗药性风险评估5.1药剂持效期长、作用位点单一、与已知具有高风险药剂抗性机制相同的药剂普遍具有较高抗性风险。5.2交互抗性当测定到抗性菌株时，则进一步测定其对其它杀菌剂的交互抗性。具体按照NY/T1859.6-2014执行。若与其它药剂有交互抗性，则一定程度上加大了抗性风险。5.3抗性突变体的获得采用紫外诱变和药剂驯化的方法在室内进行抗药性菌株的筛选，使稻瘟病菌发生与抗药性相关的突变。具体方法参照NY/T1859.6-2014执行。5.4抗性突变体适合度比较敏感菌株和抗性菌株的菌丝生长速率、产孢能力、致病力及遗传稳定性等适合度相关的生物学指标性状是否存在差异，具体方法见附录A。如果抗性群体的适合度明显低于敏感菌群，则该药剂田间使用后靶标菌对其产生抗药性的风险较低。如果抗性群体的适合度接近或高于敏感菌群，则该药剂具有一定的田间抗性风险。如果抗性群体的适合度明显高于敏感群体，则该药剂产生田间抗性风险较高。5.5抗药性风险级别评估根据药剂的作用机制及活性、菌群抗性指数和适合度测定结果，并结合交互抗性、抗性突变体的获得难易程度等研究结果，综合分析药剂在田间推广使用后产生抗药性的风险。5.5.1低水平抗性风险如果药剂为多作用位点，田间没有相同作用机制药剂使用的历史、靶标病原菌抗性突变体菌株获得较难、抗性菌株的适合度显著低于敏感群体菌株，则该药剂的田间使用风险级别为低水平抗性风险。5.5.2中等水平抗性风险如果药剂作用位点单一、田间有相同作用机制药剂使用的历史、靶标病原菌可产生抗性突变、抗药性菌株适合度接近敏感群体，则该药剂的田间使用风险级别为中等水平抗性风险。5.5.3高水平抗性风险推过药剂持效期长、作为位点单一、田间有长时间使用同类药剂使用的历史、靶标病原菌抗性突变体菌株获得较易、抗药性菌株适合度接近或高于敏感群体，则该药剂的田间使用风险级别为高水平抗性风险。6抗性风险管理6.1一般原则确定抗性风险的级别后，要考虑抗性风险的可接受性。属于低抗性风险级别的药剂，可不需要采取抗性管理措施；属于中等抗性风险的药剂，可采取必要的抗性风险管理措施；属于髙等抗性风险级别的4药剂，需要采取抗性管理措施。对于中、高抗性风险的药剂，农药生产企业应为登记的农药产品提供抗性风险评估资料及管理措施，并在产品标签和使用说明书上注明如何规避抗性风险。对高等抗药性风险的药剂，其抗性风险管理应由农药生产(经营)企业、登记管理部门、科研和植保推广部门及使用者共同参与。6.2抗性风险管理措施6.2.1水稻稻瘟病综合治理利用抗病品种、生物防治及合理的农业措施及其它有利于减轻稻瘟病发生和危害的非化学防治措施。6.2.2药剂使用技术应限定相同作用机制的杀菌剂连续使用次数及年限。低水平抗性风险的药剂在水稻上每年连续使用次数不多于3~5次；中等抗性水平风险的药剂年使用次数不多于2~3次；高水平抗性风险的药剂年使用次数不多于1~2次。同时应注意不同作用机制药剂轮换使用，以延缓稻瘟病菌抗药性的产生。6.2.3负交互抗性药剂的使用使用已证实的与靶标药剂具有负交互抗性的杀菌剂，以治理稻瘟病菌对靶标杀菌剂抗药性的发展及积累。6.2.4产品声明在产品标签上标注抗药性风险级别，并标明相应抗性风险管理的措施。5（规范性）抗药性菌株的适合度测定适合度是指抗药性突变体在遗传稳定性、生长、致病、繁殖及竞争力等方面与敏感群体的生存竞争能力。试验中通过稻瘟病菌的遗传稳定性、菌丝生长能力、孢子产生能力、致病力、竞争力等适合度相关的生物学性状指标，比较不同抗性水平的抗药性菌株和敏感菌株(包括亲本菌株)有无差异，来评价抗药性菌株的适合度。如果抗性群体的适合度明显低于敏感群体(包括亲本菌株)，则该药剂田间使用后靶标菌对其产生抗药性的风险较低。如果抗性群体的适合度接近或高于敏感群体(包括亲本菌株），则该药剂具有一定的田间抗性风险。如果抗性群体的适合度明显高于敏感群体(包括亲本菌株），该药剂产生田间抗性风险较高。A.1遗传稳定性将抗药性突变体菌株在无药PDA平板中连续继代培养10代，室温保存10d后，测定突变体菌株第1代至第10代对靶标药剂的敏感性，比较培养不同代数后抗性突变体对药剂敏感性有无变化。A.2菌丝生长能力野生型敏感菌株及抗性突变体菌株均接种于无菌PDA培养基平板上，28℃培养8d，每隔2d采用十字交叉法测量菌落直径，每个菌株重复三次。记录结果并计算差值，得到菌丝生长速率，比较调查时间内抗性突变体及敏感菌株生长速率有无变化。A.3孢子产生能力将稻瘟病菌孢子悬浮液稀释至105个孢子/mL，取50μL于凹玻片中，26℃培养3d，使用血球计数板测定孢子浓度，统计分析抗药性菌株与敏感菌株的产孢能力是否有差异。A.4致病能力使用离体叶片划伤接种法对敏感菌株及抗性菌株致病能力进行测定。取4叶期水稻新叶4cm，使用接种针划伤叶表，以不穿透叶片为宜。将叶片置于铺有双层湿润滤纸的培养皿中，表面均匀喷洒0.025%Tween-20水溶液，使用移液器将制备好的孢子悬浮液接种于划伤处，接种量20