植物组织中可溶性蛋白和MDA的测定

植物衰老生理1植物组织中可溶性蛋白和MDA的测定

一、实验目的掌握植物组织中蛋白和丙二醛（MDA，malonyldialdehyde）提取掌握用比色法测定组织粗提液蛋白质和MDADevelopmentalsignalsEnvironmentalsignalsDisassemblyofcellularcontentsanddegradationofmacromoleculesCelldeathDecreaseinphotosynthesis,activationofsenescenceprogram二、实验原理衰老是指细胞、器官或整个植株生理功能自然衰退，最终导致死亡的过程。衰老时的生理生化变化

蛋白质含量下降，生物膜降解，核酸含量的变化,光合速率下降,呼吸速率下降，植物内源激素的变化等。实验原理植物叶片衰老过程中，叶绿素含量下降，叶色变黄，蛋白质含量减少（可溶性蛋白）。自由基代谢失调,并在体内积累膜脂过氧化的产物之一：MDA（一）可溶性蛋白测定的原理考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合后，溶液的吸收光谱发生变化，从465nm偏转到595nm，并表现出在595nm处的吸收值与溶液中的蛋白质含量有线性关系，其范围从0~1000

g/ml。据此可制作蛋白质的标准曲线，牛血清蛋白为常用的标准蛋白。待测样品经缓冲液提取后，可溶性蛋白溶于上清液中，蛋白质提取液与考马斯亮蓝G-250反应呈蓝色。测定595nm吸收值，并根据蛋白质的标准曲线，得到样品中可溶性蛋白的含量。（二）MDA测定原理MDA在高温、酸性条件下与硫代巴比妥酸(TBA)反应，形成粉红色复合物（3，5，5－三甲基噁唑2，4-二酮），该复合物在532nm处有最大吸收峰；600nm处是最小吸收峰，两峰差值的消光系数为155(mM)-1cm-1。三、实验步骤实验材料：八仙绣球（一）植物组织中可溶性蛋白及MDA的提取称叶龄差异明显的叶片各0.50g，分别加入5ml磷酸缓冲液（50mmol，pH值为7.8），于冰浴中研磨成匀浆；各取1.5ml，在4C10000×g下离心10min，其上清液即为蛋白和MDA提取液。注意：磨样时可一组磨老叶，一组磨新功能叶。离心前平衡（二）可溶性蛋白含量测定

取40l提取液+160l磷酸缓冲液于玻璃试管中，加入4.8ml考马斯亮蓝溶液，混匀后放置2min，用10mm厚的比色杯在595nm下比色读取OD值。对照为空白的磷酸缓冲液200l加上4.8ml考马斯亮蓝溶液。（三）MDA含量测定取上清液1.0ml于7ml离心管中,加硫代巴比妥酸（TBA）与三氯乙酸（TCA）混合液4.0ml，然后在离心管盖上戳一小孔，92ºC水浴保温30min；空白管：1mL磷酸缓冲液+TBA与TCA混合液4.0ml，置92ºC水浴30min，冷却后，在8000×g离心5min;测定A532,A450和A600OD值。四、结果计算

（一）蛋白标准曲线的制作

蛋白质标准溶液的配制：称取牛血清蛋白（电泳纯）溶于0.15MNaCl溶液中，制成1mg/ml的母液，再用磷酸缓冲液配成各含0、40、80、120、160μg/200μl的牛血清蛋白的标准溶液。0~100

g/ml蛋白标准曲线的制作准确吸取0.2ml各含0、40、80、120、160μg牛血清蛋白的标准溶液，分别放入10ml的试管中，加入4.8ml考马斯亮蓝G-250蛋白染色试剂，混合后放置2min，用10mm厚的比色杯在595nm下比色读取OD值，制作通过原点的直线即为其标准曲线。（二）可溶性蛋白质含量的计算可溶性蛋白含量(μg/g.FW)=标准曲线上查得的蛋白质量（μg

）×提取液体积/（测定加样量*鲜重）（三）MDA含量计算公式L为比色杯厚度(cm)MDA(mM)=——————155xLA532-A600•••••••••Equ.1蔗糖对MBA-TBA反应有干扰，可用下式消除：MDA(µM)=6.45(A532-A600)-0.56A450

•••••••••Equ.2进一步求出单位鲜重植物组织中的MDA含量比较新老叶片可溶性蛋白和MDA的差异