衍生化HPLC-MS 法测定血浆中超微量炔雌醇

报告人：谭文明硕士研究生

指导老师：丁黎(中国药科大学)

丹酰氯柱前衍生化HPLC-APCI-MS法测定血浆中超微量炔雌醇及其人体药动学研究1、论文简介：

本论文研究的是复方醋酸环丙孕酮片（达英-35，参比制剂，由德国先灵公司生产，每片含醋酸环丙孕酮（CPA）2mg和炔雌醇(EE)35

g）。

临床用途：用于消除或减轻男性化，治疗痤疮、多毛等皮肤症状，还可降低女性多囊卵巢综合症及用于妇女的避孕。口服剂量：1片／天

醋酸环丙孕酮为17-羟孕酮类药物炔雌醇是雌二醇的

17α-乙炔基衍生物

由于CPA和EE血药浓度相差150倍，由分子式看出二者的理化性质也有较大差异，同时测定有难度，所以需要分开测定之。

这里主要讨论

丹酰氯柱前衍生化、LC-APCI-MS测定人血浆中pg/ml级炔雌醇的方法

2、血浆中pg/ml级炔雌醇测定方法的介绍

2.1外国文献报道受试者口服低剂量的炔雌醇后，其血药浓度测定常用放射免疫法，最低定量限为8～20pg·ml-1。优点：具有较高的检测灵敏度缺点:精密度、重现性、准确度都不如LC-MS,GC-MS法。

2.2外国文献报道GC-MS法测定人血浆中炔雌醇,其LLOQ为10pg·ml-1。每个样品分析时间长达几十分钟，并不适合于大批量血浆样本的高通量测定要求。而且该文献并没有炔雌醇人体药代动力学数据。2.3外国文献报道采用LC-MS法测定炔雌醇甲醇溶液，LLOQ为50ng/ml。

我们根据文献初步折算，提取浓缩10倍后其血药浓度LLOQ最多为5ng/ml。距离血药浓度为10pg/ml的要求相差了500倍。---灵敏度太低！2.4我们的初步尝试

我们仍然采用较为普及的LC-ESI-MS,LC-APCI-MS单级质谱测定炔雌醇的甲醇溶液。检测离子:[M-H]-

结果与外国文献报道相近，LLOQ为30ng·ml-1，远远达不到检测的要求,有300倍的差距。酚羟基容易失去一个H+3、难点：人血浆中pg/ml级炔雌醇的测定

如何利用现有的、比较普及的LC-MS测定pg/ml的炔雌醇呢？

进一步文献调研外国有将雌激素类用丹酰氯衍生化后进行紫外、荧光、电化学检测的报道。3.1衍生化试剂-丹酰氯的分子结构：Weber于1952年合成了丹酰氯(Dns-Cl)，最早用来测定N-末端氨基酸及用于对蛋白质结构的确定。C12H12CINO2S分子量269.75具有强烈荧光、紫外吸收的萘环，作为衍生化紫外、荧光标记试剂以提高待测物的检测灵敏度及色谱保留行为。已大量的应用于生物样本中氨基酸类及多胺化合物等含有伯、仲胺基、酚羟基的化合物的衍生化含量测定和临床的疾病诊断。

3.2丹酰氯的应用介绍含有伯、仲胺基、酚羟基的化合物丹酰氯衍生化HPLC-紫外检测器

荧光检测器

3.3常识：含有仲、叔氮原子的化合物由于碱性较强，在质谱测定中易于结合氢离子，化合物的质子化效率较高。具有较高的质谱响应。

恰好丹酰氯分子中含有叔氮原子，磺酰氯基能与炔雌醇的酚羟基发生反应。

而丹酰氯作为衍生化试剂提高化合物离子化效率而增强质谱响应却未见报道。

我们考虑用丹酰氯将炔雌醇衍生化后，引入碱性较强的叔氮原子。将质谱响应较低的酚羟基，转变为响应很强的叔氮原子，产生新的质谱响应活性中心。

提高炔雌醇的离子化效率增强质谱响应。[M-H]-[M+H]+3.4炔雌醇的丹酰氯衍生化方程式：新的检测分子3.5对羟基联苯(内标)的衍生化方程式：36新的检测离子的产生

结果如前所料：衍生化以后，炔雌醇和内标引入了丹酰氯的叔氮原子，其碱性较强，所以与H+形成[M+H]+正离子。3.7.1炔雌醇的丹酰氯衍生物正离子质谱扫描图3.7.2内标的丹酰氯衍生物正离子质谱扫描图H6血浆样品中炔雌醇的LC-MS测定法的建立与考证实验条件血浆样品的处理炔雌醇的本底方法特异性方法学实验结果6.1实验条件色谱条件流动相：甲醇：含1%甲酸的10mmol/L醋酸铵水溶液=97：3色谱柱：LichrospherC18dp5μ4.6mmID×25cm(淮阴汉邦科技)流速：1ml/min柱温：25℃质谱条件

MSD：选择性离子监测；离子极性：正离子；离子化方式：大气压化学离子（APCI）；检测对象：炔雌醇的衍生物，[M+H]+，m/z530.3；内标的衍生物，[M+H]+，m/z403.3；传输区电压：150V干燥气流速：4.0L·min-1;雾化室压力：60psig干燥气温度：350℃。

6.2血浆样品的处理血浆样品1.0

ml→内标(20ng/ml)50ul→涡旋混匀→乙酸乙酯5ml→涡旋3min→3000r/min,离心10min

取有机层→50℃水浴,氮气流吹干→残渣进行衍生化反应→将反应液于16000r/min离心2min→直接取上清液进样。

6.3残渣衍生化反应的详细步骤

提取残渣→100mmol·L-1的碳酸氢钠缓冲液100

l（2mol·L-1氢氧化钠水溶液调节至pH10.5）→加塞→涡旋1min→加入3mg·ml-1的丹酰氯丙酮溶液100

l→加塞→涡旋1min→55℃水浴反应50min。

6.4炔雌醇的本底外国文献报道，没有服用炔雌醇人体内也可能会存在一定浓度的本底。范围为0～30pg/ml。推测炔雌醇本底可能来源人体内源性类固醇或者由食物中（特别是饮用水和肉类）引入，计算药动学参数时必须扣除本底的影响。4份来源不同的空白血浆提取物的衍生物色谱图6.5

方法的特异性(B)(C)(A)炔雌醇对照品的衍生物色谱图

(B)对羟基联苯对照品的衍生物色谱图(A)(B)

(D)(C)(C)空白血浆加入炔雌醇（104.3pg/ml）、对羟基联苯对照品的标准含药血浆色谱图；(D)健康受试者口服复方醋酸环丙孕酮片后的炔雌醇(53.52pg/ml)血浆样品（加入内标）色谱图。

6.5炔雌醇标准含药血浆最低定量限

(LLOQ)

10.43pg/ml

衍生化后炔雌醇的质谱响应增大了300倍！炔雌醇标准含药血浆LLOQ为10.43pg/ml

丹酰氯衍生化

炔雌醇6.6炔雌醇方法学实验结果炔雌醇的标准曲线线性范围为：10.43

pg·ml-1～625.8pg·ml-1r=0.99876；最低定量限为10.43pg/ml；高、中、低三种浓度的日间和日内精密度均小于15%；7复方醋酸环丙孕酮片在人体药代动力学及生物等效性研究7.1采用双交叉实验设计受试者例数:20名健康女性(体检合格）。实验方案:受试者按体重配对,随机分组,交叉口服受试制剂（浙江仙琚制药公司，淑普靓）或参比制剂（达英-35R

）。7.2炔雌醇的采血样时间

炔雌醇采血样时间:受试者于服药前及服药后0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、10、14、24h分别采血5ml于肝素化试管中，分离出血浆，于-18℃保存待测。

7.3炔雌醇数据分析和结果20名受试者分别口服参比和受试两制剂后的炔雌醇的平均血药浓度－时间曲线

7.420名女性受试者两轮空白血浆中炔雌醇的本底血药浓度曲线。

浓度范围为0～33pg/ml与外国文献报道一致。7.5口服受试和参比制剂后炔雌醇的药动学参数7.6炔雌醇在人体中药代动力学小结

用面积法(AUC0-τ)估算浙江仙琚制药股份有限公司的复方醋酸环丙孕酮片（淑普靓）相对生物利用度。

以炔雌醇计为98.1％

18.7％，可以看出

个体差异比较大。

8讨论

依据炔雌醇肠肝循环指导临床合理用药的讨论

关于丹酰氯衍生化试剂在质谱测定中新应用的讨论

8.1对于炔雌醇肝肠循环的讨论

文献报道炔雌醇有肠肝循环，我们在实验中也发现有60％的受试者炔雌醇血药浓度－时间曲线有双峰现象。

肠肝循环是指胆汁中排泄的药物或代谢物在小肠移动期间重新被吸收返回肝门静脉，并经过肝脏重新进入全身循环，然后再分泌，直至排出的现象。由于肠肝循环的存在，药物在血液中持续时间延长，因此，在给药方案设计时应充分给予考虑。正常情况下，炔雌醇以硫酸、葡萄糖醛酸结合物的形式，借助于肠道细菌释放出水解酶水解成为原形药物，在小肠中被重新吸收。长期使用抗生素如青霉素、红霉素、氯霉素以及抗结核药物利福平等，一旦阻断了这种肠肝循环，就可能导致避孕失败。安定属于肝脏微粒体酶的诱导剂，可加快口服避孕药在体内的代谢，从而降低避孕作用。

8.2关于丹酰氯在质谱中新应用的讨论

8.2.1

丹酰氯常用于氨基酸等含有伯、仲氨基和酚羟基的化合物的柱前衍生化含量测定，能化合物的紫外和荧光吸收（提高了检测灵敏度），增强色谱保留行为。我们可以查阅到大量的丹酰氯应用于HPLC-UV和HPLC-FID检测的报道。

8.2.2同时丹酰氯还有一个叔氮原子，有较强的碱性很容易与氢离子结合为正离子，极大的增加了化合物的离子化效率，从而增强了质谱响应；待测化合物的m/z

还会因为引入丹酰氯而增大，检测时