(高清版)GBT 40455-2021 蓝莓休克病毒检疫鉴定方法

蓝莓休克病毒检疫鉴定方法DetectionandidentificationofBlueberryshockvirus国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会IGB/T40455—2021本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。本文件起草单位：中华人民共和国福州海关、福建省农业科学院果树研究所、中国检验检疫科学研GB/T40455—2021蓝莓休克病毒检疫鉴定方法1范围本文件规定了蓝莓休克病毒(Blueberryshockvirus)的检疫鉴定方法。本文件适用于可能携带蓝莓休克病毒的蓝莓检疫鉴定。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样方法3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4蓝莓休克病毒分类信息分类地位：雀麦花叶病毒科(Bromoviridae)、等轴不稳环斑病毒属(Ilarvirus)。蓝莓休克病毒的寄主范围、病害症状、分布地区、传播途径、粒体形态、基因组等其他信息参见附5方法原理蓝莓休克病毒的血清学、分子生物学特性是制定本检疫鉴定方法的主要依据。根据BIShV与抗体之间的特异性反应，对样品进行双抗体夹心酶联免疫吸附测定(DAS-ELISA)、免疫层析试纸条检测；根据BIShV基因组特征进行巢式RT-PCR、免疫捕获巢式RT-PCR、实时荧光RT-PCR检测；通过这些方法的有效组合，判断样品是否携带BIShV。6.2用具—2GB/T40455—2021试剂应符合附录B的要求；免疫层析试纸条检测试剂应符合附录C的要求；巢式RT-PCR检测试剂应符合附录D的要求；免疫捕获巢式RT-PCR检测试剂应符合附录E的要求；实时荧光RT-PCR检测试剂应符合附录F的要求。尽量抽取有病毒危害症状的植物材料，BIShV的危害症状描述参见附录A;抽样方法按照7.2样品制备称取0.5g～1.0g待测样品按1:10(W/V)加入抽提缓冲液研磨，4℃下8000g离心10min,上清8检测鉴定以含BIShV材料作为阳性对照，以不含BIShV的健康植物组织(其种类和材料应尽量与检测样品免疫层析试纸条检测的对照设置同8.1,具体检测方法见附录C。8.3巢式RT-PCR检测巢式RT-PCR检测的阳性对照、阴性对照设置同8.1,同时以ddH₂O代替模板作为空白对照，具体检测方法见附录D。如采用商品化一步法试剂盒，则cDNA合成和第1轮PCR按照试剂盒说明进行。8.4免疫捕获巢式RT-PCR检测免疫捕获巢式RT-PCR检测的对照设置同8.1,具体检测方法见附录E。如采用商品化一步法试剂盒，则cDNA合成和第1轮PCR按照试剂盒说明进行。8.5实时荧光RT-PCR检测实时荧光RT-PCR检测的阳性对照、阴性对照设置同8.1,同时以ddH₂O代替模板作为空白对照，8.6序列测定与比对PCR产物纯化后，直接测序或者克隆测序，利用NCBI网站上的BLAST软件把测序所得到的核苷酸序列与已知BIShV序列进行比对。3GB/T40455—20219结果判定样品检测时，检测结果判定按下述原则进行：—-—样品血清学检测(DAS-ELISA或免疫层析试纸条)初筛结果为阳性，且任一种分子生物学方法(巢式RT-PCR、免疫捕获巢式RT-PCR或实时荧光RT-PCR)检测结果为阳性，则判定为检——样品巢式RT-PCR或免疫捕获巢式RT-PCR检测结果为阳性，且序列测定结果经比对分析为BIShV,则判定为检出BIShV。———样品巢式RT-PCR或免疫捕获巢式RT-PCR检测结果为阳性，且实时荧光RT-PCR检测结果为阳性，则判定为检出BIShV。10样品保存与结果记录经检测确定检出BIShV的样品应保存在适合的条件下以备复核。活的种苗在隔离温室或光照培养箱中培养，组织、叶片等样品保存在-80℃冰箱中，做好登记和标记工作，保存期限至少1年。应原始数值；免疫层析试纸条应有试纸条检测图片；巢式RT-PCR和免疫捕获巢式RT-PCR检测应有电泳图片；实时荧光RT-PCR检测应有实时荧光结果图片；序列测定应有测序报告。4GB/T40455—2021(资料性)蓝莓休克病毒相关资料A.1寄主范围已报道的自然寄主为越橘属的蓝莓(Vacciniumspp.)。A.2病害症状典型症状是花和叶片在开花期时突然完全坏死，导致不结果。据统计，该病毒侵染蓝莓造成的损失可达34%～90%。BlShV几乎可侵染所有的蓝莓品种，并表现相似的症状(见图A.1)。图A.1BIShV侵染蓝莓后引起的症状(引自/projects/pest-alerts1/blueberry-shock-virus-bromoviridae-harvirus)A.3分布地区A.4传播途径主要通过蜜蜂携带感染的花粉传播。病毒粒体呈等轴对称球状，直径约27nm。A.6病毒基因组正义单链RNA。5(规范性)双抗体夹心酶联免疫吸附测定(DAS-ELISA)B.1试剂特异性的蓝莓休克病毒抗体。B.1.2酶标抗体碱性磷酸酯酶标记的蓝莓休克病毒抗体。B.1.3底物对硝基苯磷酸二钠(pNPP)。氯化钠(NaCl)磷酸二氢钾(KH₂PO₄)磷酸氢二钠(Na₂HPO₄)氯化钾(KCl)吐温-20(Tween-20)溶于900mL灭菌双蒸水中，并定容至1000mL,4亚硫酸钠(Na₂SO₃)24000-40000)聚乙烯基吡咯烷酮(PVP,MW24000-40000)0.5mL20.0g溶于900mL的1×PBST中，并用1×PBST定容至1000mL,4℃储存。碳酸钠(Na₂CO₃)1.59g碳酸氢钠(NaHCO₃)2.93g溶于900mL灭菌双蒸水中，并定容至1000mL,4℃储存。牛血清白蛋白(BSA)2.0g聚乙烯基吡咯烷酮(PVP,MW24000-40000)20.0g溶于900mL1×PBST中，并用1×PBST定容至1000mL,4℃储存。二乙醇胺氯化镁(MgCl₂)6GB/T40455—2021溶于800mL灭菌双蒸水中，用浓盐酸(HCl)调pH至9.8,定容至1000mL,4℃储存。B.2程序B.2.1包被抗体37℃孵育2h或4℃冰箱孵育过夜，倒去酶联板孔中溶液，按每孔100μL的量用PBST洗涤4～6次，每次1min。B.2.3加酶标抗体B.2.5读数B.3.1质量控制要求满足阴性对照孔的OD₄₀5值<0.15、阳性对照孔的OD₄o5值/阴性对照孔的OD₄₀5值>5;同一样品的在满足B.3.1的质量控制要求下，若样品OD₄o5值/阴性对照OD₄₀5值>2,判定为阳性；样品OD₄05值/阴性对照OD₄05值<2,判定为阴性。7GB/T40455—2021(规范性)免疫层析试纸条检测方法C.1试剂样品抽提缓冲液配制方法见B.1.5。C.2试纸条保存试纸条应密封干燥保存于2℃~8℃冰箱内。C.3检测步骤待测样品按6.2步骤制备，取300μL样品提取液至1.5mL的离心管中。C.3.2样品检测检测前先将试纸条恢复至室温。将试纸条T线一端垂直插入到样品液中，样品液高度不要超过试纸条上的MAX线。测试观察的时间以5min～10min为宜。对于病毒浓度低的样品，测试观察的时间可适当延长。C.4结果判定——质控C线显红色，测试T线未显色，则判定为阴性；C.5试纸条是否有效的判断方法——用阳性对照进行测试，测试T——用阳性对照进行测试，测试T——用阳性对照进行测试，测试T线显红色，质控C线显红色，说明整个系统工作正常；线未显色，质控C线显红色，说明测试T线的特异性抗体失效；线未显色，质控C线也未显色，说明整个测试纸条失效8(规范性)巢式RT-PCR检测方法D.1.25×TBE缓冲液补充蒸馏水至1000mL。用时加蒸馏水稀释至0.5×TBE。D.1.36×加样缓冲液0.25%溴酚蓝40%(W/V)蔗糖水溶液。D.1.4引物序列基因序列，设计2对用于特异性扩增的巢式引物，引物序列表D.1引物序列引物名称引物序列目的片段/bp外侧正向引物BIShV-F5'-CGAGTAATCATGGTTTGCAAG-3'外侧反向引物BIShV-R5'-GACCGGTATCGAACCTTCAC-3′内侧正向引物BIShV-15'-GTGGTCAGTGTAAGAAGTGC-3'内侧反向引物BIShV-25'-CGTACTCCAAATCGGATGG-3'取样品提取液200μL放入1.5mL离心管中，再加入1mLTrizoL试剂，剧烈振荡摇匀3min;4℃,12000g离心10min,取上清；加入氯仿300μL,剧烈振荡15s,室温静置5min,4℃,12000g离心15min,取上层水相；加入等体积的异丙醇，颠倒混匀后室温下静置15min,4℃,12000g离心10min,弃上清；加入1mL75%的乙醇洗涤沉淀2次，每次4℃,7500g离心3min,弃上清；RNA沉淀干燥后，用20μL～40μL经DEPC(焦碳酸二乙酯)处理过的ddH₂O溶解，-80℃保存备用。在PCR管中加入3μL总RNA、1μL外侧反向引物BIShV-R(10μmol/L)、7μLddH₂O,70℃水9GB/T40455—2021浴10min,迅速冰浴5min,再加入下列试剂：5×RT缓冲液5pL、dNTPs(10mmol/L)2μL、M-MLVRT(200U/μL)1pL、RNasin(40U/μL)1μL。42℃水浴60min,70℃水浴10min,自然冷却至室温，第1轮PCR反应体系见表D.2,每个反应设置2个重复。PCR反应条件：94℃5min;94℃30s,51℃45s,72℃1min,35个循环，最后一个循环结束后表D.2PCR反应体系名称加样量/μL外侧正向引物BIShV-F(10μmol/L)外侧反向引物BIShV-R(10μmol/L)2×TaqPCRmixddH₂O总体积取第1轮PCR产物0.5μL作为模板，进行第2轮PCR扩增。PCR反应体系为：内侧正向引物BIShV-1(10μmol/L)1μL、内侧反向引物BIShV-2(10μmol/L)1μL、2×TaqPCRmix12.5pL、循环结束后72℃延伸10min。D.2.5琼脂糖凝胶电泳制备1.5%的琼脂糖凝胶，对PCR产物进行电泳，电压3V/cm～5V/cm,缓冲液0.5×TBE。电泳D.3结果判定如果阴性对照和空白对照无特异性扩增，待测样品第1轮PCR扩增出与阳性对照一致的目的片段(746bp)或第2轮PCR扩增出与阳性对照一致的目的片段(486bp),则判定为阳性。GB/T40455—2021(规范性)免疫捕获巢式RT-PCR检测方法E.1试剂E.1.2抽提缓冲液(pH7.4):见B.1.5。E.1.3包被缓冲液(pH9.6):见B.1.6。E.2免疫捕获巢式RT-PCR检测E.2.1免疫捕获将BIShV抗体用包被缓冲液按说明稀释，取100μL加入PCR管中，37℃孵育2h;倒去PCR管中溶液，用PBST洗涤3次；待测样品按6.2步骤制备，取100μL样品提取液加入PCR管中，4℃包被过夜或37℃孵育2h。E.2.2cDNA合成PCR管中进行反转录。先向PCR管中加入外侧反向引物BIShV-R(10μmol/L)1pL、ddH₂O10μL,70℃水浴10min后立即冰浴5min,再加入下列试剂：5×RT缓冲液5μL、dNTPs(10mmol/L)2μL、E.3结果判定如果阴性对照和空白对照无特异性扩增，待测样品第1轮PCR扩增出与阳性对照一致的目的片段(746bp)或第2轮PCR扩增出与阳性对照一致的目的片段(486bp),则判定为阳性。GB/T40455—2021(规范性)实时荧光RT-PCR检测方法F.1试剂F.1.2TaqManPCRmix。F.1.3引物及探针序列根据已报道的BIShV外壳蛋白(CP)和依赖于RNA的RNA聚合酶(RdRp)基因序列设计特异性引物/探针名称序列BIShV-f15'-CRTCCGATTTGGAGTACGATAAGTT-3′BIShV-rl5'-TCGGGTAGTCAGACTTAAATTCGA-3′BIShV-P15'-(FAM)TCCGAAGAATACGAATTAGTA(MGB)-3BIShV-f25'-TGCCTCTAGCGAGTTTTTGCA-3'BIShV-r25'-CCACAAGGTCCGTCACTAATRTGT-3'BIShV-P25'-(FAM)ATGTGGTTTGGTTCTCAC(MGB)-3′注：R=A/G。F.2实时荧光RT-PCR检测F.2.1总RNA提取见D.2.1。F.2.2cDNA合成F.2.3实时荧光PCR反应反应体系：在荧光定量PCR管中加入cDNA2μL、BIShV-f1(10μmol/L)1μL、BIShV-r1(10μmol/L)1pμL、BIShV-P1(10μmol/L)1μL、BIShV-f2(10μmol/L)1μL、BIShV-r2(10μmol/L)1pL、BIShV-P2(10μmol/L)1μL、2×TaqManPCRmix12.5μL、ddH₂O4.5μL。每个反应设置2个重复。如果阳性对照Ct值<35,且出现典型的扩增曲线，阴性对照和空白对照的Ct值≥40,且无扩增GB/T40455—2021待测样品Ct值≤35时，且出现典型的扩增曲线，则判定为阳性；待测样品Ct值≥40时，且无扩增曲线，则判定为阴性；待测样品Ct值介于35和40之间时，应重新提取样品RNA进行测试，若重新测试的Ct值≥40,且[1]Adkar-PurushothamaCR,MaheshwarPK,SanoT,JreliableRT-nestedPCRaplants.CurrentMicrobiology,2011,62(5):1455-1459.[2]MacDonaldSG,MartinRR,BristowPR.