(高清版)GBT 40453-2021 柑橘黑斑病菌检疫鉴定方法

GB/T40453—2021柑橘黑斑病菌检疫鉴定方法DetectionandidentificationofPhyllostictacitricarpa(McAlpine)Aa国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会IGB/T40453—2021本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。究院华北林业实验中心、福建省农业科学院农业生物资源研究所、湖南省植物保护研究所。1GB/T40453—2021柑橘黑斑病菌检疫鉴定方法本文件规定了柑橘黑斑病菌的检疫鉴定方法。本文件适用于柑橘属及其杂交种苗木和果实中柑橘黑斑病菌的分离检测和鉴定。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文本文件。SN/T2455进出境水果检验检疫规程SN/T4648柑橘黑斑病菌检疫鉴定方法本文件没有需要界定的术语和定义。Phyllostictinacitricarpa(McAlpine)Petrak,1953分类地位：真菌界(Fungi),子囊菌门(Ascomycota),盘菌亚门(Pezizomycotina),座囊菌纲(Do-thideomycetes),葡萄座腔菌目(Botryosphaeriales),叶点霉科(Phyllostictaceae),叶点霉属(Phyllostic-5方法原理征和实时荧光PCR特异性反应进行鉴定。6仪器和用具2GB/T40453—20216.2用具7试剂和培养基Tris-HCl、EDTA、DNA提取试剂盒。7.2培养基马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)、燕麦琼脂培养基(OA)和麦芽提取物琼脂培养基(MEA),具体配制方法参见附录B。8检疫鉴定方法8.1现场检疫柑橘属及其杂交种生产与加工包装基地检疫按照SN/T4648进行，抽样与取样按照SN/T2455进行。8.2症状检查似病斑，注意病斑上是否有黑色小颗粒状分生孢子器，落叶上是否有黑褐色假囊壳。病菌为害症状参见附录A。8.3镜检如有黑色小颗粒状分生孢子器的病斑，置于体视显微镜下观察记录病斑和分生孢子器的形态、颜色及大小，对病斑组织进行徒手切片或冷冻切片，置于生物显微镜下观察记录分生孢子的形态特征，同时将分生孢子转接到PDA平板上进行分离培养。如有黑褐色假囊壳的落叶，置于体视显微镜下观察记录假囊壳的形态特征，用接种针挑取假囊壳制8.4病菌分离未发现分生孢子器的病斑进行组织分离，在病健交界处剪成大小1mm×1mm组织块，70%乙醇表面消毒30s或1%次氯酸钠溶液表面消毒10min,无菌水洗涤3次，组织块转移至PDA平板上，置于22℃黑暗条件下培养5d～7d,发现疑似菌落，转移边缘菌丝至PDA平板上纯化。3GB/T40453—20218.5实时荧光PCR检测刮取疑似分离物菌丝或切取病果、叶片、枝条上的症状组织块，用商品化试剂盒或改良的CTAB方法(见附录C)提取DNA,并进行实时荧光PCR检测。实时荧光PCR检测方法按附录C执行。8.6形态学特征观察将实时荧光PCR检测结果为阳性的分离物分别转接至PDA、OA、MEA平板上，置于25℃黑暗条件下培养14d。培养3d后开始观察记录PDA平板上菌落形态，7d后体视显微镜下观察分生孢子器产生情况，10d后生物显微镜下观察测量分生孢子的形态和大小、胶质鞘厚度、尾端附属丝长度；观察记录OA平板上是否产生黄色色素以及MEA平板上菌落形态、颜色。9.1形态学特征PDA上初生菌落白色、平铺状，菌丝致密。后期菌落中央开始变为灰橄榄色，黑灰色至黑色，逐渐明区域。7d后菌落上形成黑色隆起的硬块状子座，炭色颗粒状分生孢子器。分生孢子器半埋生，10d~14d后成熟，从中溢出乳白色黏性分生孢子团，内含大量分生孢子。OA上常产生扩散性黄色素。MEA上菌落中央黑橄榄色，边缘灰白色(参见附录A)。8.5μm),外覆盖一层透明的胶质鞘，胶质鞘厚度通常小于1.5μm,尾端常有一条无色胶状物形成的附属丝，长度4μm～10μm,胶质鞘及附属丝遇水均易溶化。培养状态及寄主落叶上，病菌有时可见小型9.2与近似种的区别柑橘黑斑病菌与近似种的区别主要表现在分生孢子大小、胶质鞘厚度、附属丝长度等形态特征以及在培养基OA、MEA上培养性状等方面(参见附录A和附录D)。其中，OA上柑橘黑斑病菌和P.paracitricarpa菌落常产生黄色色素扩散至菌落周围的培养基中，其他近似种菌落不会产生黄色素。MEA上P.paracitricarpa菌落中央由黄色逐渐变成浅橄榄色，边缘黄色；柑橘黑斑病菌和其他近似种4GB/T40453—2021病菌形态学特征与9.1.1、9.1.2描述相符合，且实时荧光PCR检测为阳性，判定检出柑橘黑斑病菌。样品经登记和经手人签字后妥善保存。阳性样品应保存高压灭菌后方可处理。阳性分离物应妥善保存，将菌丝块转入30%灭菌甘油中于-80℃下保存，或在PDA平板培养后于4℃下保存，每90d定期转接。保存期满后高压灭菌处理。5GB/T40453—2021(资料性)A.1寄主范围均感病。其中柠檬(C.limon)最易感病。A.2分布A.3传播方式A.4为害症状A.4.1果实症状病斑外围有黄色或绿色的晕圈。病斑中央凹陷，灰色至棕褐色，通常会产生凸起的黑色小颗粒(分生孢子器)。硬斑型症状参见图A.1。A.4.1.2黑星型颗粒(分生孢子器)。黑星型斑症状常在果实近成熟时表现，并常出现在硬斑周围。黑星型症状参见图6GB/T40453—2021A.1。A.4.1.3假黑点型通常发生在绿色果实上，呈小型凸起的深褐色至黑色病斑，周围常有深色小斑点，无黑色小颗粒(分生孢子器)。黑星型症状参见图A.1。A.4.1.4毒斑型生长末期果实被严重侵染时，多个病斑联合形成凹陷不规则的红褐色至黑色大病斑。在高湿条件下会产生大量黑色小颗粒(分生孢子器),且病斑发展很快，可深入果皮内，很快蔓延至整个果实，引起全果腐烂。毒斑型症状参见图A.1。A.4.2叶片及枝条症状叶片症状与果实上硬斑型病斑类似，常发生在老叶上，通常圆形、直径可达3mm,病斑中央稍凹陷，灰白或浅褐色，常有黑色小颗粒(分生孢子器),边缘深褐色至黑色，有黄色晕圈。枝条上的病斑症状与叶片上类似。叶片症状参见图A.2。a)硬斑型症状b)黑星型症状注：a)引自Wangetal.(2012);b)～d)引自/aphis/ourfocus/planthealth/plant-pest-and-disease-programs/pests-and-diseases/citrus/citrus-black-spot/citrus-black-spot。图A.1为害果实症状GB/T40453—2021注：引自/aphis/ourfocus/planthealth/plant-pest-and-disease-programs/pests-and-图A.2为害叶片症状图A.3病菌形态学特征78GB/T40453—2021图A.3(续)图A.4MEA上P.citriarpa和P.paracitricarpa菌落特征9GB/T40453—2021(资料性)培养基B.1马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)200g马铃薯去皮切成小块后加水煮沸30min,双层纱布过滤后加入20g葡萄糖、18g琼脂，继续煮至琼脂完全溶化后加蒸馏水补足1000mL,121℃下灭菌15min。也可采用商品化PDA培养基按使用说明进行配制。B.2燕麦琼脂培养基(OA)称取30g燕麦片放入纱布中，加水慢煮2h,用纱布挤压过滤，加入20g琼脂，继续煮至琼脂完全溶化后加蒸馏水补足1000mL,在121℃下灭菌15min。也可采用商品化OA培养基按使用说明进行B.3麦芽提取物琼脂培养基(MEA)称取麦芽膏或麦芽汁粉30g,琼脂15g,加蒸馏水加热溶解，完全溶化后加蒸馏水补足1000mL,在121℃下灭菌15min。也可采用商品化MEA培养基按使用说明进行配制。GB/T40453—2021(规范性)实时荧光PCR检测方法500μLCTAB缓冲液和0.1g蛋白酶K,混匀，65℃水浴1h,13000g离心5min～10min,保留上清放置1h,或-20℃过夜；13000g离心10min,可见DNA沉淀；加1mL70%乙醇清洗DNA沉淀2保存于-20℃下备用。也可选用商用植物组织DNA提取试剂盒。PCR级DNA溶液的OD₂5o/OD₂so比值应为1.7～1.9。C.2实时荧光PCRC.2.1引物及探针引物为Gc-F2(5'-aggtgatggaagggaggcctt-3')/Gc-R2(5'-caggcgtcctggcctagag-3′),探针为Gc-P(5'-FAM-aaaaagccgcccgacctaccttca-TAMRA-3′)。C.2.2反应体系和程序柑橘黑斑病菌DNA作阳性对照、不含柑橘黑斑病菌DC.2.3结果判定疑似分离物：出现典型扩增曲线判定为阳性；无典型扩增曲线判定为阴性。样品检测：出现典型扩增曲线，且Ct值≤35,判定为阳性；35≤Ct值≤40,增加DNA用量2～10倍病菌分离。病菌与近似种的区别见表D.1。学名P.citricarpaP.capitalensisP.citriasianaP.citrimaxima分布非洲、亚洲、澳大利亚，以及北美和南美部分地区世界广泛分布中国、泰国、越南巴西中国泰国意大利、西班牙希腊寄主柑橘属植物(柚、波斯青柠除外)及其杂交种柑橘属植物和其它非柑橘属植物蜜柚和沙田柚柠檬蜜桔、柚、甜橙和柠檬柚柑橘属植物柠檬、甜橙致病性具致病性内生菌，无致病性或弱致病性具致病性内生菌无致病性无致病性或弱致病性具致病性无致病性或弱致病性具致病性症状硬斑型、黑星型、型病斑无症状或产生小病斑与P.citricarpa症状相似，果皮病斑上可产生分生孢子器无症状症状轻微，为害叶片和果实，病斑上子器柚果皮上产生棕色病斑无症状从落叶中分离，接种到甜橙果实carpa相似分生孢子平均大小/μm(11～13)×(7~胶质鞘厚度/μm11附属丝长度/μm4～104～10未知小型分生孢子大小/μm未知未知未知未知表D.1(续)学名P.citricarpaP.citriasianaP.citrichinaensisP.citrimarima假囊壳仅在落叶产生，新鲜叶片、果实及培养基上不会产生在培养基上产生未知未知在培养基上产生未知在培养基上产生未知小/μm未知未知未知未知色素产生(OA)产生黄色素不产生黄色素不产生黄色素不产生黄色素不产生黄色素不产生黄色素不产生黄色素产生黄色素菌落特征(MEA)菌落中央黑橄榄色，边缘灰白色、菌落表面黑褐色，边缘羽状菌落暗褐色，边缘棕褐色未知菌落橄榄绿色，表面有多个环形隆起，边缘有裂刻黑色绿色菌落中央由黄色逐渐变成浅橄榄不规则裂瓣状Wikeeetal.(2013);P.paracaitalensis和P.paracitricarpa相关信息引自Guarnacciaetal.(2017)。GB/T40453—2021[1]AaHAvander.StudiesinPhyllostictaI.StudiesinMycology,1973,5:1-110.[2]BaayenRP,BonantsPJM,VerkleyG,etal.Nonpathogenicisolatesofthecitrusblackspotfungus,Guignardiacitricarpa,identifiedasacosmopolitanendophyteofwoodyplants,G.mangif-erae(Phyllostictacapitalensis).Phytopathology,2002,92:464-477.[3]EPPO.PM7/17(2):Guignardiacitricarpa.EPPOBulletin,2009,39(3):318-327.[4]EPPO.PM7/17.Diagnosticprotocolsforregulatedpests:Phyllostictacitricarpa[underrevision].2020./standards/PM7/17[5]FAO(2016)ISPM27.DiagnosticprotocolsforregulatedpestsDP5:PhyllostictaCitri-carpa(McAlpine)Aaonfruit.InternationalPlantProtectionConvention(IPPC),FAO,Rome.[6]GlienkeC,PereiraOL,StringariD,etal.EndophyticandpathogenicPhyllostictaspecies,withreferencetothoseassociatedwithCitrusBlackSpot.Persoonia,2011,26:47-56.[7]GuarnacciaV,GroenewaldJZ,LiH,etal.FirstreportofPhyllostictacitricarpaandde-scriptionoftwonewspecies,P.paracapitalensisandP.paracitricarpa,fromcitrusinEurope.StudiesinMycology,2017,87:161-185.[8]NAPPO.PhytosanitaryAlertSystem:Confirmationofcitrusblackspot(Guignardiacitricarpa)inFlorida-UnitedStates.NAPPO,2010./oprDetail.cfm?oprID=421.[9]SchirmacherAM,TomlinsonJA,BarnesAV,etal.Species-specificreal-timePCRfordi-agnosisofPhyllostictacitricarpaonCitrusspecies.EPPOBulletin,2019,49:306-313.[10]SuttonBC&.WaterstonJM.Guignardiacitricarpa.CMIdescriptionsofpathogenicfungiandbacteri