高中生物3.2基因工程的基本操作程序知识梳理新人教版选择性必修3

3.2基因工程的基本操作程序一、目的基因的筛选与获得（一）目的基因的筛选与获得1.目的基因概念在基因工程的设计和操作中，用于__________变更受体细胞性状__________或__________获得预期表达产物________等的基因就是目的基因（依据不同的须要，目的基因是不同的，主要是指__________编码蛋白质的基因___________）。2.筛选目的基因的方法（1）从相关的__________已知结构__________和__________功能清楚__________的基因中进行筛选。（2）获得方法①__________人工合成__________②__________基因文库中获得目的基因__________③__________利用PCR获得和扩增__________3.利用PCR获得和扩增目的基因（1）PCR的概念：PCR是__________聚合酶链式反应__________的缩写，是一项依据______DNA半保留复制______的原理，在______体外______供应参加DNA复制的__________各种组分__________与______反应条件______，对___________目的基因的核苷酸序列______进行__________大量复制__________的技术。①全称：__________聚合酶链式反应___________②原理：___________DNA半保留复制___________③操作环境：__________体外（PCR扩增仪/PCR仪）___________④目的：__________对目的基因的核苷酸序列进行大量复制___________⑤优点：___________可以在短时间内大量扩增目的基因___________（2）DNA体内复制的条件参加的组分在DNA复制中的作用DNA母链供应DNA复制的_____模板_____4种脱氧核苷酸合成DNA子链的_____原料_____解旋酶打开DNA双链DNA聚合酶催化合成DNA_____子链_____引物使DNA聚合酶能够从_____引物的3’_____端起先连接脱氧核苷酸注：引物是一小段能与______DNA母链__________的一段碱基序列__________互补配对_的______短单链核酸__________。（3）DNA体外复制（PCR）的条件参加的组分在DNA复制中的作用DNA母链供应DNA复制的_____模板_____4种脱氧核苷酸合成DNA子链的_____原料_____引物使DNA聚合酶能够从_____引物的3’_____端起先连接脱氧核苷酸90℃以上高温打开DNA双链（变性温度）耐高温的_____DNA聚合酶_____催化合成DNA子链缓冲液（含_____Mg2+_____）激活真核细胞和细菌的_____DNA聚合酶_____其他不同的温度_____变性、复性和延长_____须要不同温度注：复制的原料实为_____dNTP_____（dATP、dTTP、dCTP、dGTP），同时水解产生能量为合成DNA子链供应能量，因此体系中不须要添加_____ATP_____。（4）过程目的基因DNA__________受热变性__________后______解为单链______，______引物_____与单链相应______互补序列______结合；然后以__________单链DNA__________为模板在______DNA聚合酶______作用下进行___延长____，即将4种______脱氧核苷酸______加到__________引物的3’__________，如此__________重复循环多次__________，每次循环一般可以分为_变性、复性和延长_三步。注：__变性___温度上升到90℃左右，双链DNA解聚为单链复性温度下降到55℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合___延长__温度上升到72℃左右，Taq酶从引物起始合成互补链，可使新链由_____5′端向3′_____端延长拓展：DNA复制的相关计算1.子代DNA分子总数：_____2n_____个；2.第n代产生的DNA数：______2n-1______个；3.子代DNA脱氧核苷酸链总数=______2n+1_____条4.第n代产生的DNA链数：______2n______条①n代后，DNA分子有______2n______个②n代后，DNA链有______2n+1______条③第__________代出现完整的目的基因④n代后，含引物的DNA分子有______2n__________个⑤n代后，共消耗______2n+1-2______个引物⑥第n代复制，消耗了______2n______个引物⑦n代后，完整的目的基因有______2n-2n______个4.获得目的基因的其他方法（1）构建基因文库来获得目的基因：将含有某种生物不同基因的很多_____DNA_____片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。①_____基因组文库_____：包含一种生物全部的基因。②_____部分基因文库_____：只包含一种生物一部分基因，如cDNA文库。（2）利用化学方法人工合成：用DNA合成仪，要获得的基因比较小，核苷酸序列又已知，不须要模板。（二）基因表达载体的构建（核心）1.基因表达载体的组成基因表达载体必需包括______目的基因______、______标记基因_____、_____启动子__、______终止子______等（若须要能完成自主复制，还应有______复制原点______）。（1）启动子①本质：一段有特别序列结构的_DNA_片段。②位置：位于基因的_上游_，紧挨__________转录的起始位点__________。③功能：__________RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA___________。④特别类型：_诱导型启动子___________。⑤诱导型启动子的特点：__________当诱导物存在时，可以激活或抑制目的基因的表达__________。（2）终止子①本质：一段有特别序列结构的_DNA__________片段。②位置：位于基因的_下游_。③功能：__________使转录在所须要的地方停下来__________。注：启动子、终止子、起始密码子、终止密码子对比比较项目启动子终止子起始密码子终止密码子本质DNA片段DNA片段mRNA上____三个相邻的碱基_____mRNA上三个相邻的碱基位置目的基因上游目的基因__下游___mRNA首端mRNA尾端功能RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA使转录在所须要的地方停下来翻译的起始信号（编码氨基酸）翻译的结束信号（不编码氨基酸）（3）标记基因①作用：______便于重组DNA分子的筛选______②常见类型：抗生素抗性基因、荧光蛋白基因等（4）基因表达载体的构建过程：一般用同一种限制酶分别切割载体和含有目的基因的DNA片段，再用DNA连接酶将两者连接。（三）将目的基因导入受体细胞1.将目的基因导入植物细胞—花粉管通道法（1）操作方式①用_______微量注射器________将______________含目的基因的DNA溶液_________干脆注入__子房____中。②在_____植物受粉后_____的确定时间内，_____剪去柱头_____，将____DNA溶液____滴加在_____花粉管通道__________上，使目的基因借助_____花柱切面______进入___胚囊___。（2）受体细胞：_____受精卵__________。2.将目的基因导入植物细胞—农杆菌转化法（1）转化：__________目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程_________________________________。注：此处“转化”与肺炎链球菌转化试验中的“转化”含义相同，实质都是基因重组。（2）农杆菌特点：①能在自然条件下侵染__________双子叶植物_____和_____裸子植物__________，而对大多数__________单子叶植物_____没有侵染实力。②农杆菌细胞内含有__________Ti质粒_____，当它侵染植物细胞后，能将_____Ti质粒_____上的_____T-DNA_____（________可转移的DNA____）____转移_____到被侵染的细胞，并且将其__________整合到该细胞的染色体DNA上__________。（3）农杆菌转化法的过程：将目的基因插入_________Ti质粒的T-DNA__________中，通过农杆菌的_转化_____作用，就可以使目的基因____进入植物细胞_____，并___________整合到受体细胞的染色体DNA上__________，使目的基因能够_____维持稳定和表达__________。3.将目的基因导入动物细胞—显微注射法（1）受体细胞：______受精卵______注：受精卵简洁表现出全能性。4.将目的基因导入微生物细胞—Ca2+处理法（1）受体细胞：常用________原核生物____作为受体细胞，其中以______大肠杆菌______最广泛（2）原核生物的优点：_______________繁殖快、单细胞、遗传物质相对较少、易于培育____________________（3）Ca2+处理法（_____感受态细胞法_____）的一般过程：——Ca——Ca2+的作用：增加细胞壁的通透性Ca2+处理大肠杆菌——这种细胞称为感受态细胞——这种细胞称为感受态细胞使细胞处于一种能吸取四周环境中DNA分子的生理状态将重组的基因表达载体导入其中——将重组的基因表达载体导入其中——一般利用温度变更导入总结：目的基因导入受体细胞的方法受体细胞类型方法说明特点植物细胞农杆菌转化法将目的基因插入农杆菌Ti质粒的T­DNA上→转入农杆菌→用农杆菌侵染植物细胞→将目的基因整合到植物细胞染色体的DNA上→目的基因表达经济、有效，适用于双子叶植物和裸子植物，尤其适用于双子叶植物花粉管通道法在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头→滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞→目的基因表达简便、经济，我国科学家独创的一种方法动物细胞显微注射技术将含有目的基因的表达载体提纯→取卵（受精卵）→显微注射→注射了目的基因的受精卵，经胚胎早期培育后，移植到雌性动物的输卵管或子宫内→获得具有新性状的动物将目的基因导入动物细胞最为有效的方法微生物细胞Ca2＋处理法（感受态细胞法）用Ca2＋处理微生物细胞→感受态细胞→将基因表达载体与感受态细胞混合→在确定温度下促进感受态细胞吸取DNA分子简便、经济、有效（四）目的基因的检测与鉴定检测目的检测方法推断标准目的基因是否插入转基因生物的DNA_____DNA分子杂交_____技术是否出现杂交带目的基因是否转录出了_____mRNA_____分子杂交技术是否出现_____杂交带_____目的基因是否翻译出蛋白质_____抗原—抗体杂交_____技术是否出现杂交带个体水平的检测如抗虫、抗病的接种试验是否表现出相应的特性1.DNA分子杂交法（DNA探针法）DNA分子杂交的基础：具有互补碱基序列的DNA分子，可以通过碱基对之间形成氢键等，形成稳定的双链区。在进行DNA分子杂交前，先要将两种生物的DNA分子从细胞中提取出来，再通过加热或提高pH的方法，将双链DNA分子解旋成为单链，这个过程称为变性。然后，将两种生物的DNA单链放在一起杂交，其中一种生物的DNA单链用同位素进行标记。假如两种生物DNA分子之间存在互补的部分，就能形成双链区。由于同位素被检出的灵敏度高，即使两种生物DNA分子之间形成百万分之一的双链区，也能够被检出。2.分子杂交分子杂交其基本原理是待测单链核酸与已知序列的单链核酸（做探针）间通过碱基配对形成可检出的双螺旋片段。这种技术可在DNA与DNA，RNA与RNA，或DNA与RNA之间进行，形成DNA-DNA，RNA-RNA或RNA-DNA等不同类型的杂交分子。3.抗原-抗体杂交Western杂交，即蛋白质分子（抗原—抗体）之间的杂交。与SouthernBlot或NorthernBlot杂交方法类似，WesternBlot法接受的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）分别的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分别的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素