选1知识点总结

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2013选修1《生物技术实践》一轮复习知识梳理

专题1传统发酵技术的应用

课题1果酒和果醋和制作

【补充知识】发薛

1、概念：利用微生物或其他生物的细胞在有氧或无氧条件下繁殖或积累其代谢产物的过程。

2.传统发酵技术（都是采用自然发酵的工艺），如：传统的前萄酒酿造，就是葡萄破碎入罐以后,

不人为地添加任何菌种，靠葡荀本身携带的自然界的酵母菌，在葡萄浆或分离后的葡萄汁里自发

地繁殖，最终发酵成葡萄酒。

3、类型：

⑴根据是否需要氧气分为：需氧发酵和厌氧发酵,

⑵根据产生的产物可分为：酒精发酵、丸酸发薛、醋酸发酵等。

一、基础知识

（~）果酒制作的原理

⑴果酒发酵的菌种：酵母菌,属于真核生物

⑵酵母菌的代谢类型是：异界兼性厌氧型

有氧时，进行有氧呼吸,反应式为：CqHi2O9+6H2O+6O2T6co?+12点）+能量:大量繁殖，

无氧时，能进行酒精发酵,反应式为：C6Hl2。6符》2c2H5OH+2CS+能量。

⑶酵母菌的生殖方式：出芽生殖（主要）分裂生殖抱子生殖.

⑷酵母菌繁殖的最适温度幺fC左右，酒精发酵一般控制在18〜25C。

⑸传统发酵技术所使用的酵母菌的来源：主要是附着于葡萄皮上的野生型酵母菌。

也可以在果汁中加入人工培养的酵母菌°

注意：

①在发酵过程中,随着酒精浓度的提高,红葡萄皮的色素也进入发酵液，使葡萄酒呈现深红色.

②酒精发酵过程中，要保持缺氧、酸性环境。在缺氧呈酸性的发酵液中，酵母菌可以生长繁殖，

而绝大多数其他微生物都因无法适应这一环境而受到制约。

③.酒精发酵过程中，要“先通气后密封”？“通气”的目的是使酵母菌进行有氧呼吸大量繁殖，“密封”

的目的是使酵母菌进行无氧呼吸产生酒精，

（二）果醋制作的原理

⑴菌种是醋酸菌,属于原核生物

⑵醋酸菌的代谢类型为异养需氧型。

有两条途径生成醋酸：直接氧化和以酒精为底物的氧化。

当氧气、糖源都充足时，醋酸菌将葡萄汁中的糖分解成醋酸,当缺少糖源时，醋酸菌将乙醇变为乙醛,

再将乙醛变为醋酸,反应简式为C2H5OH+O2TCH赞OOH+HzO。

⑶醋酸菌的生殖方式：生殖方式为二分裂.

⑷醋酸菌最适生长温度为30〜35℃0

⑸菌种来源：到生产食醋的工厂或菌种保藏中心购买,或从盒盘中分离醋酸菌。

注意：

①醋酸菌对氧气的含量特别敏感，当进行深层发酵时，即使只是短时间中断通入氧气，也会引起醋酸菌死

亡。只有在氧气充足时，才能进行旺盛的生命活动。变酸的酒表面观察到的菌膜就是蝇菌在液面大量繁

殖形成的。

②醋酸菌最适生长温度为30〜35C。,控制好发酵温度，使发酵时间缩短，又减少杂菌污染的机会。

二、实验设计

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1、流程图

捷选葡萄f之选f蚯一遒慧发酵一醋酸发酵

果酒果醋

充气口是在醋酸发酵时连接充气泵进行无工用的；使用该装置制酒时，应该关闭充

气口；制醋时，应将充气口连接气泵，输入氧气。

排气口是在酒精发酵时用来排出c5的；排气口要通过一个长而弯曲的胶管与瓶

身连接，其目的是防止空气中微生物的污染,其作用类似巴斯德的鹅颈瓶。

出料口是用来取样的。

黑酒和央福的笈林装置

2、制作实例

实验材料

葡萄、榨汁机、纱布、醋酸菌（或醋曲）、发酵瓶（如右图）、气泵、体积分数为70%的酒精等。

实验步骤

1.对发酵瓶、纱布、榨汁机等实验用具进行清洗并消毒。榨汁机要清洗干净,并晾干。发酵瓶

要清洗干净,用体积分数为*的酒精消毒，晾干待用。

2.取葡萄500虱新鲜的葡萄）。

3.用清水冲洗葡萄1—2遍除去污物。（注意不用反复多次冲洗。）

（榨汁前应该先冲洗,然后再除去枝梗,以避免除去枝梗时引起葡萄破损，增加被杂菌污

染的机会。）

4.用榨汁机榨取葡萄汁后，将其装入发酵瓶中。（如果没有合适的发酵装荒，可用500mL的

塑料瓶替代。但注入的果汁量不要超过塑料瓶总体积的2Z3o要留出大约此的空间。）装入

葡萄汁后，封闭充气口。

5.将发酵瓶置于适宜的温度（18—25℃）下发酵。

6.由于发酵旺盛期CCh的产量非常多，因此需要及时排气,以防止发酵瓶爆裂。（如果是简易发酵装置，

每天拧松瓶盖2〜4次。进行排气。）

7.而天后（此:!却左右），取样检验。例如，可以检验酒味、酒精的含量、进行酵母菌的镜检等工作。

果汁发酵后是否有酒精产生，可以用重格酸钾来检验。在酸性条件下,重铭酸钾与酒精反应呈现灰绿色。

检测时，先在试管中加入发酵液2mL,再滴入物质的量的浓度为3moi/L的H2s（）0滴,振荡混匀，最

后滴加常温下饱和的重格酸纾溶液3滴。振荡试管，观察颜色.

8.当果酒制成以后，可在发酵液中加入醋酸菌（或醋曲），然后移至前一35e条件下发酵,时间控制

在7〜8d左右,适时用气泵向发酵液中充气。（如果没有充气装置，可以将瓶盖打开，在瓶口上盖上纱布。

以减少空气中尘土等的污染。）

注意：

⑴应该从发酵制作的过程进行全曲的考虑防止发酵液被污染？如，榨汁机、发酵装置要造选干净；每次

排气时只需拧松瓶盖、不要完全揭开瓶盖等。

⑵制葡萄酒时，温度控制在18〜25°C发。温度是酵母菌生长和发酵的重要条件。20c左右最适合酵母菌

繁殖。因此需要将温度控制在其最适温度范围内。制葡萄醋时，要将温度控制在30〜35醋酸菌是

嗜温菌，最适生长温度为30〜度C,因此要将温度控制在30〜359。

⑶制葡萄醋时，醋酸菌是好氧菌,在将酒精变为醋酸时需要皂的参与，因此要适时向发酵液中充气。

（二）练习

2.提示：大规模生产时需要进行更为全面周详的考虑，如原料的来源与选择、菌种的培育与选择、发酵的

设备、发酵条件的自动化控制，以及如何严格控制杂菌污染；等等。此外，无论是葡萄酒或葡萄醋，实验

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时所检测的发酵液，并非商品意义上的产品。在实际生产中还需沉淀过滤、灭菌装瓶等获得成品酒或醋。

葡萄酒还需在一定设施和条件下（如橡木桶和地窖）进行后续发酵，以获得特定的风味和色泽。

3.提示：需考虑厂房、设备投资、原材料采购、工人人数及工资、产品种类、生产周期、销售渠道、利润

等问题。

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课题2腐乳的制作

一、基础知识

腐乳制作的原理

⑴腐乳的发酵有多种微生物（如青霉、酵母、曲霉、毛霉等）的协同作用,其中起主要作用的是毛霎，它是

一种真核生物

⑵新陈代谢类型是异养需氧型。营腐生生活。

毛霉等微生物产生的蛋白酷可以将豆腐中的蛋白质分解成小分子的肽和氨基酸;脂肪酶可以将脂肪水解

成甘油和脂肪酸。与醇类作用生成酯，形成细腻、鲜香等豆腐乳特色。

⑶生殖方式是池子生殖。

⑷发酵的温度为15-18℃

⑸菌种来源：传统腐乳的生产中，豆腐块上生长的毛霉来自空气中的毛客抱子。现代的腐乳生产是在严格

的无菌条件下,将优良斑菌种直接接种在豆腐上，这样可以避免其他菌种的污染,保证产品的质量。

注意：优良菌种的选择：不产生毒素；生长繁殖快，且抗杂菌力强；生长的温度范围大，不受季节的限

制；有蛋白酶、脂肪酶、肽酶等酶系；使产品气味正常良好。

二、实验设计

1、实验流程

让豆腐长出毛霉一加起腌制一加乳汤装瓶一密封腌制。

2、制作实例

实验材料：含水量70%的豆腐，粽叶，盘子，盐，黄酒，米酒，糖，香辛料等，广口玻璃瓶，高压锅等。

实验步骤

1.将豆腐切成3cmX3cmXlcm若干块。所用豆腐的含水量为70%左右。

用含水量过高的豆腐制腐乳，不易成形，且影响毛霉有氧呼吸。

用含水量过少不利于毛霉生长，毛霉生长离不开水。

样品水分含量（％）计算公式如下：

（烘干前容器和样品质量•烘干后容器和样品质量）/烘干前样品质量

2.将豆.腐块平放在铺有干粽叶的盘内（粽叶可以提供菌种，并能起到保温的作用），每块豆腐等距离

排放，周围留一定的室屋。豆腐上面再铺上干净的粽叶。气候干燥时，将平盘用保鲜膜包裹，但不要封严，

以免湿度太高，不利于毛霉的生长。

3.将平盘放在温度为15〜18℃的地方,毛霉逐渐生长，大约5d后，豆腐上生长的白毛是毛霉的亘

色菌丝。严格地说是直立菌丝，在豆腐中还有匍匐菌丝。

4.当毛霉生长旺盛，并呈淡黄色时,去除保鲜膜及铺在上面的粽叶，使豆腐块的热量和水分能够迅

速散失，同时散去霉味，这一过程一般持续36h以上。

5.豆腐潦透后，将豆腐间的连在一起的菌丝拉断，并整齐排在容器内，准备腌制。

6.长满毛霉的豆腐块（以下称毛坯）分层摆放，分层加盐，并随层高而增加盐量,在接近瓶口表面

盐要铺厚一些，以防止杂菌污染，约腌制8d。（豆腐与盐质量分数比为5：1）

盐的作用

⑴抑制微生物的生长，避免腐败变质

⑵析出水分，是豆腐变硬，在后期制作过程中不易酥烂

（3）.调味作用，给腐乳以必要的咸味

（4）.浸提毛酣菌丝上的蛋白酶。

盐的浓度过低，不足以抑制微生物的生长,可能导致豆腐腐败；盐的浓度过高，会影响腐乳的口味。

注意：先发酵后加盐

7.将黄酒、米酒和糖、香辛料等混合制成卤汤。卤汤酒精含量控制在公%左右为宜。（卤汤直接关系

到腐乳的色、香、味。）

乳汤中酒的含量应控制在12%左右。酒精含量过低，蛋白酶的活性高，加快蛋白质的水解，而且丕

足以抑制微生物生长,豆腐易腐败，难以成块。酒精含量过高，对蛋白酶的抑制作用也越大，腐乳成熟的

时间将会延长。

酒的作用：

⑴防止杂菌污染以防腐

（2）与有机酸结合形成酯，赋予腐乳风味

（3）.酒精含量的高低与腐乳后期发酵时间的长短有很大关系。

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香辛料的作用：

⑴调味作用，不能增加营养。

⑵杀菌防腐作用

⑶参与并促进发酵过程

8.将广口玻璃瓶刷洗干净，用高压锅在1000c蒸汽灭菌30min,将腐乳成坯摆入瓶中，装瓶时要迅速小心;

加入卤汤和辅料后，要用胶条将瓶口蜜封；封瓶时，最好将瓶口通过酒精灯的火焰，防止瓶口被污染。。

在常温下，一般六个月即可以成熟。

注意、酿造腐乳的主要生产工序是将豆腐进行前期发酵和后期发酵。

前期发酵的主要作用：1.创造条件让毛霉生长。2.使毛酶形成菌膜包住豆腐使腐乳成型。

后期发酵主要是前与微生物协同参与生化反应的过程，通过各种辅料与能的缓解作用，生成腐乳的香气。

注意：

①用来腌制腐乳的玻璃瓶，刷干净后要用流水消毒。

②吃腐乳时，你会发现腐乳外部有一层致密的“皮这层“皮''是前期发酵时在豆腐表面上生长的苴丝（匍

匐菌丝），它能形成腐乳的“体”，使腐乳成形。“皮”对人体无害。

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课题3制作泡菜并检测亚硝酸盐含量

一、泡菜制作原理

L菌种

⑴乳酸菌常见种类：乳酸链球菌和乳酸杆菌。

⑵代谢类型:异养厌氧型，在无氧条件情况下,将葡萄糖分解成乳酸。

前

反应式为：C6H1206―；一2c3H603+能量

⑶生殖方式分裂方式:二分裂

⑷培养温度：常温

⑸分布：分布广泛，空名、土壤、植物体表、人或动物的肠道

⑹应用：常用于生产

注意：含抗生素牛奶不能生产酸奶的原因是抗生素能杀死乳酸菌。

2.腌制条件

时间

温度

食盐的用量水和盐为4：1

温度过直、食盐用量不足以名，腌制时间过短，容易造成细菌大量繁殖，亚硝酸盐含量增加。

3.亚硝酸盐

⑴物理性质：白色粉末、易溶于虫。

⑵应用：在食品生产中常用作食品添加剂O

⑶分布：自然界中分布广泛。据统计，亚硝酸盐在蔬菜中的平均含量约为4mg/kg,咸菜中平均含量在7mg/k

以上，而豆粉中的平均含量可达10mg/kg。

⑷对人体的影响：膳食中的亚硝酸盐一般不危害人体健康，当人体摄入总量达0.3~0.5g时,会引起中毒；

当摄入总量达组时，会引起死亡。

⑸我国卫生标准:国家规定肉制品中不超过亚m3酱腌菜中不超过20mg/kg,婴儿奶粉中不超过2mg/kge

⑹绝大多数亚硝酸盐随尿液排出，但在特定条件下，即适宜的pH、温度和一定的微生物作用，会

转变成致癌物质亚硝胺。

4.测定亚硝酸盐含量的原理

(1)在盐酸酸化条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸发生重氮化反应后，与N-1一蔡基乙二胺盐酸盐结合

形成玫瑰红色染料。

(2)将显色反应后的样品与已知浓度的标准显色液耳测进行比较,可以大致鱼篁出泡菜中亚硝酸盐的含

量。

二、实验设计

修整、洗涤、晾晒、切分成条状或片

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三、泡菜腌制过程

1.泡菜坛的选择

（1）应选用火候好、无裂纹、无砂眼、坛沿深、盖子吻合好的泡菜坛。

（2）检查时可将坛口包上压入水中，看坛内有无蜀J现象。

2.腌制

（1）过程：

①将新鲜蔬菜预先处理成条状或片状。

②泡菜盐水按清水和盐为ILL质量比配制煮沸冷却备用。

③预处理的新鲜蔬菜装至坐坛时放入蒜瓣、生姜、香辛料等佐料,

（如果希望发酵快些，可将蔬菜在开水中浸1分钟后入坛，再加上一些白酒。）并继续装至八成满。

④倒入配制好的盐水，使盐水没过全部菜料。

⑤盖上泡菜坛盖子，并用水密封发酵。以保证坛内为无氧环境。

发酵时间受到温度影响。

注意：

①水封闭坛口起着使坛内与坛外空气隔绝的作用，空气中21%是氧气，这是最简易的造成无氧环境的方

法。这样，坛内可利用蔬菜中天然存在的乳酸菌进行乳酸发酵。如不封闭，则会有许多需氧菌生长，

蔬菜会腐烂。

②泡菜发酵分为：

发酵前期：蔬菜刚入坛时，表面带入的微生物，主要是以不抗酸的大肠杆菌和酵母菌等较为活跃，它们进

行异型乳酸发酵和微弱的酒精发酵产生较多的乳酸、酒精、醋酸和二氧化碳等，二氧化碳以气泡从水槽内

放出，逐渐使坛内形成嫌气状态。发酵产物中除乳酸外，还有其他，如乙醇、C02等称异型乳酸发酵。

•泡菜坛内有时会长一层白膜，形成白膜是由于产膜酵母的繁殖。

•酵母菌是兼性厌氧微生物，泡菜发酵液营养丰富，其表面氧气含量也很丰富，适合酵母菌的繁殖。

发酵中期：由于前期乳酸的积累，pH下降，嫌气状态的形成，乳酸杆菌活跃进行活跃的同型乳酸发酵，

乳酸积累pH达3.5~3.8.大肠杆菌、酵母菌、霉菌等的活动受到抑制。这一期为完全成熟阶段。发酵产

物中只有乳酸，称为同型乳酸发酵。

发酵后期：继续进行乳酸发酵，乳酸积累达1.2%以上时，乳酸杆菌的活性受到抑制，发酵速度逐渐变缓

甚至停止。

腌制1周左右即可开坛食用。也可随时加入新鲜蔬菜，不断取用。如果加入一些已经腌制过的泡菜汁更好，

这相当于接种己经扩增的发酵菌，可减少腌制时间。•般在腌制10天后亚硝酸盐含量开始降低，故在

10天之后食用最好。

四、亚硝酸盐的测定

测定步骤

配制溶液一制备标准显色液一制备样品处理液一比色。

1.配制溶液：对氨基苯磺酸溶液N-1一蔡基乙二胺盐酸盐溶液亚硝酸钠溶液

提取剂（氯化镉、氯化领）：作用：增大亚硝酸钠的溶解度

氢氧化铝乳液（作用：作吸附剂，充分使滤液脱色）

2.5mol/l的氢氧化钠溶液（中和过多盐酸，营造碱性环境）

2.制备标准显色液

用移液管吸取0.20ml、0.40ml、0.60ml>0.80ml、1.00ml、1.50ml亚硝酸钠溶液，分别置于50ml比

色管中，再取1支比色管作为空白对照。并分别加入2.0ml对氨基苯磺酸溶液，混匀，静置3〜5分钟后，

再分别加入1.0mlN-1一蔡基乙二胺盐酸盐溶液，加蒸馈水至50ml,混匀，观察亚硝酸钠溶液颜色的梯度

变化。静置N・L蔡基乙二胺盐酸盐

亚硝酸钠溶液-----►对氨基苯磺酸溶液

3〜5分钟

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3.制备样品处理液的步骤是

①称取0.4kg泡菜，粉碎榨汁，过滤得约200mL汁液。

②取100mL汁液倒入500mL容量瓶，添加200mL蒸山水和100mL提取剂,摇床振荡lh,再加40mL氢

氧化钠溶液，最后用蒸储水定容到500mL并立刻过港获得漉液。

③将滤液60mL移入100mL容量瓶，用氢氧化铝乳液（吸附脱色）定容后过滤，获得无色透明的滤液。

的市bf地计一►y台______＞汁液.MzK_加氢氧化钠定卷

取泡菜榨汁过滤+

4.比色：生氧化铝乳液定容

①将40mL滤液移入50mL比色管中，并编号。

②分别依次加入2.0mL的对氨基苯磺酸溶液和1.0mL的NT-蔡基乙二胺盐酸溶液，并定容到50mL,混

匀静置15mino

③观察颜色变化，并与标准显色液比较,记录亚硝酸盐含量。

亚（1）亚硝酸盐含量在第旦天达到最高峰。

硝

（2）亚硝酸盐含量升高的原因是由于泡菜在开始腌制时，坛内环境有利于某些

酸

细菌的繁殖（包括一些硝酸盐还原菌），这些细菌可以促进硝酸盐还原为亚硝

盐

酸盐。

含

（3）亚硝酸盐含量降低的原因：随着腌制时间的延长，乳酸细菌也大量

量

繁殖，对硝酸盐还原菌产生一定的抑制作用，使其生长繁殖受到

一影响，同时形成的亚硝酸盐又被分解，造成泡菜中亚硝酸

发酵时间（d）盐的含量又有所下降。

④计算样品滤液（40mL）中亚硝酸盐含量。

计算公式是:样品中亚硝酸盐含量（mg）

取样量（40mL滤液的质量，Kg）

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专题2微生物的培养与应用

课题1微生物的实验室培养

一、基础知识

1.培养基

培养基：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质，是进行微生物培养的

物质基础。

（1）培养基分类

①按照物理性质可分为

液体培养基:应用于工业或生活生产

半固体培养基:主要用于鉴定微生物运动力

固体培养基:应用于微生物的分离、计数和鉴定

注意：在液体培养基中加入凝固剂琼脂（是从红藻中提取的一种多糖，在配制培养基中用作凝固剂）后，

制成琼脂固体培养基。微生物在固体培养基表面生长，可.以形成肉眼可见的菌落。根据菌落的特征可以判

断是哪一种菌。

②按照成分培养基可分为

人工合成培养基:用成分已知的化学物质配制而成，其中成分的种类比例明确，常用于微生物的

分离鉴定

天然培养基:是用化学成分不明的天然物质配制而成，常用于实际工业生产。

③按照培养基的用途，可将培养基分为

选择培养基:是指在培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物生长，促进所需要的微

生物的生长。（如：加入青霉素分离得到酵母菌和霉菌）

■加入高浓度食盐的培养基--------------分离金黄色葡萄球菌

•不加氮源的无氮培养基-----------------分离固氮菌

•不加含碳有机物的无碳培养基----------分离自养型微生物

•加入青霉素等抗生素的培养基-----------分离导入了目的基因的受体细胞

鉴定培养基:是根据微生物的特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品配制而成的，用以鉴

别不同类别的微生物.（伊红和美蓝培养基可鉴别大肠杆菌）

（2）培养基的化学成分一般都含有水、无机盐、碳源、氮源、四类营养成分。

•碳源：能为微生物的代谢提供碳元素的物质。如C（h、NallC03等无机碳源：糖类（最常用的碳源，尤其

是葡萄糖）、石油、花生粉饼等有机碳源。异养微生物只能利用有机碳源。单质碳不能作为碳源。

•氮源：能为微生物的代谢提供氮元素的物质。如林NibsNO3、NH；（无机氮源）蛋白质、氨基酸、尿

素、牛肉膏、蛋白腺（有机氮源）等。只有固氮微生物才能利用N2c氮源主要用于合成蛋白质、核酸以及

有的碳源只能是碳源;如C02有的碳源可同时是氮源。如NH,HCCh有的碳源可同时是能源，如葡萄糖

有的碳源同时是氮源，也是能源，如蛋白陈

含氮的代谢产物.

•在提供上述几种主要营养物质的基础上，培养基还需要满足微生物生长对PH、特殊营养物质（生长因子）

以及氧气等的要求。例如：培养乳酸杆菌时需要在培养基中添加维生素；培养霉菌时需要将培养基的PH

调至酸性：培养细菌时需要将培养基的PH调至中性或微碱性:培养氏氧微生物时需要提供无氧的条件。

2.无菌技术

（1）获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵。避免杂菌污染的方法主要包括以下四个内容：

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①对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒。

②将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌。

③为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行。

④实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。

无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？

答：无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。

消毒是指使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部•部分对人体为害的微牛.物（不包括芽

抱和抱子）“

灭菌是指使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽抱和抱了。

•消毒和灭菌的比较

比较项理化因素的作用强度消灭微生物的数量芽泡和抱子能否被消灭

消毒较为温和部分生活状态的微生物不能

灭菌强烈全部微生物能

（2）实验室常用的消毒方法是煮沸消毒法，巴氏消毒法（对于一些不耐高温的液体）,此外，人们也常

使用化学药剂进行消毒，如用酒精、氯气、等。常用的灭菌方法有灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭

菌.

,此外，实验室里还用紫外线或化学药物（石碳酸或煤酚七）进行消毒。

灭菌方法：

①接种环、接种针、试管口等使用灼烧灭菌法；

②玻璃器皿、金属用具等使用干热灭菌法，所用器械是干热灭菌箱：

③培养基、无菌水等使用高压蒸汽灭菌法，所用器械是高压蒸汽灭菌锅O

④表面灭菌和空气灭菌等使用紫外线灭菌法，所用器械是紫外灯。

注意：无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还能有效避免操作者自身被微

生物感染。

二、实验操作

1.制备牛肉膏蛋白陈固体培养基

（1）制备牛肉膏蛋白陈固体培养基的方法步骤：

计算一称量f溶化f灭菌f倒平板

注意：培养基灭菌后，需要冷却到50C左右时，才能用来倒平板。可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，

感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。

（2）倒平板的过程

①将灭过菌的培养皿放在火焰旁的桌面上，右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拔出棉塞。

②右手拿锥形瓶，将瓶口迅速通过火焰。（通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。）

③用左手的拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，右手将锥形瓶中的培养基（约10〜20mL）

倒入培养皿，左手立即盖上培养皿的皿盖。

④等待平板冷却凝固，大约需5〜lOmin。然后，将平板倒过来放置，使培养皿盖在下、皿底在上。

（平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培

养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。）

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注意：①在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板就不能用来培

养微生物了。国为空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养

微生物。

②如果未接种的培养基在恒温箱中保温1~2天后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则

需要重新制备。

2.纯化大肠杆菌

（1）微生物接种的方法中最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法，

平板划线法是指通过接种环在琼脂固体培养基表而连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基

的表面。在数次划线后培养，可以分离到由…个细胞繁殖而来的肉眼可见的了细胞群体，这就是菌落C

稀释涂布平板法是指将菌液进行,系列的梯度稀释，然*将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基

的表面，进行培养。分为系列稀释操作和涂布平板操作两步。

注意—用平板划线法和稀释涂布平板法接种的目的是：使聚集在一起的微生物分散成单个细胞，从而能在

培养基表面形成单个的菌落，以便于纯化菌种。

（2）平板划线的操作步骤如下：

①将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环烧红。②在火焰旁冷却接种环，并打开棉塞.，

③将试管口通过火焰。④将已冷却的接种环伸入菌液中蘸取一环菌液。

⑤将试管通过火焰，并塞上棉塞，⑥左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平

板内，划三至五条平行线，盖上皿盖。注意不要划破培养皿。⑦灼烧接种环，待其冷却后（以免接种环温

度太高，杀死菌种。）,从第一区域划线的末端开始往第•.区域内划线。再复以上操作，在二四、五

区域内划线.注意不要将最后一区的划线与第一区相连。⑧将平板倒置放入培养箱中培养。

注意：操作的第一步灼烧接种环是为r避免接种环上可能存在的微生物污染培养物：每次划线前灼烧接种

环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次

划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后

灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。

（2）系列稀释操作步骤：

至薛锋探作

I.将分别潞仃

9mL水的6支状管灭

苗.并按W~1①的

顺J评

2.用移液管吸

511mUft也幽掰版.

让入第一支试注中“

用手指钻匕核滋行上.的枕皮炙.吹吸•:次.蚀曲液与水充分混匀.

3.从I。倍林样的试管中吸取ImL恬样液.注入1CF侪称祁的试管中.近狂举2小的操作.侬

次类推.仃列完成段后支试骨的耨科.

注京，核浓TV；方要经过火陆.探作M.试忤口用邛析仪恰应作离火烬1~2cm处.

©

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涂布平板操作步骤:

①将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。②取少量菌液，滴加到培养基我面。

③将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃尽后，冷却8〜10s。

④用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。

注意：涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。如第2步进行无菌操作。应从操作的各个细节保证“无

菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围；

等等。

3.菌种的保存

（1）对于频繁使用的菌种，可以采用临时保藏的方法。

①临时保藏方法

将菌种接种到试管的固体斜面培养基上，在合适的温度下培养。当菌落长成后，将试管放入4'C的冰

箱中保藏.以后每3〜6个月，都要重新将菌种从旧的培养基上转移到新鲜的培养基上。

②缺点：这种方法保存的时间不长，菌种容易被污染或产生变异。

（2）对于需要长期保存的菌种，可以采用甘油管藏的方法。

在3mL的甘油瓶中，装入1mL甘油后灭菌。将1mL培养的菌液转移到甘油瓶中，与甘油充分混匀后，

放在一20c的冷冻箱中保存。

附：生物的营养

营养物质是指维持机体生命活动，保证发育、生殖所需的外源物质。

在人及动物，营养物质包括水、无机盐、糖类、脂质、蛋白质、维生素六类；在植物，营养物质包括

矿质元素、水、二氧化碳等三类：在微生物，则有水、无机盐、碳源、氮源及特殊营养物质五类。

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课题2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

一、实验原理

1.尿素是由碳、氮、氧和氢组成的有机化合物。外观是白色晶体或粉末。一种重要的农业氮肥，尿素并

不能直接被农作物吸收。只有被土壤中的细菌将尿素分解成第之后,才能被植物吸收利用。土壤中的细菌

之所以能分解尿素，是因为他们能合成腺酶.尿素最初是从人的尿液中发现的.

2.实验室中微生物的筛选应用的原理是：

人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括常养、温度、川等），同时抑制或阻止其他微生物生长。

3.选择培养基是指在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长

的培养族。目的是从众多微生物中分离所需要的微生物。

■配制选择培养基的依据

根据选择培养的菌种的生理代谢特点加入某种物质以达到选择的目的。

例如，

培养基中不加入有机物可以选择培养自养微生物；

培养基中不加入氮元素，可以选择培养能固氮的微生物，因为非固氮微生物不能在此培养基上生存。

石油是唯一碳源时，可以抑制不能利用石油的微生物的生长，使能够利用石油的微生物生存，达到分离能

消除石油污染的微生物的目的。

加入高浓度的食盐可选择培养金黄色葡萄球菌等。

加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌。

加入高浓度的食盐可得到金黄色葡萄球菌。这里的加入是在培养的培养成分的基础上加入的。

将培养基放在高温环境中培养只能得到耐高温的微生物。

4对分离的菌种作进一步的鉴定

①原理：细菌分解尿素时产生氨，氨使培养基的碱性增强。因此，可通过检测培养基PH变化来鉴定该种

细菌能否分解尿素

②方法：在选择培养基中加酚红指示剂，培养细菌，观察指示剂是否变红。菌落周围出现红色圆环

5.统计菌落数目

常用来统计样品中活菌数目的方法是稀释涂布平板法。

另外，显微镜直接计数也是测定微生物数量的常用方法

二实验设计

三.实验的具体操作流程

（1）土壤取样：同其他生物环境相比，土壤中的微生物，数量最大，种类最多。在富含有机质的土壤表

层，有更多的微生物生长。从富含有机物、潮湿、pHk7的土壤中取样。铲去表层土，在距地表约3〜8cm

的土壤层取样。取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。应在火焰旁称取土壤，在火焰附

近将称好的土样倒入锥形瓶中，塞好棉塞。

（2）样品的稀释：样品的稀释程度将直接影响平板上生长的菌落数目。在实际操作中，通常选用一定稀

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释范围的样品液进行培养，以保证获得菌落数在30~300之间、适于计数的平板。

测定土壤中细菌的数量，一般选用104105I06

测定放线菌的数量，一般选用1031Q4105

测定真菌的数量，一般选用102103104

（3）微生物的培养与观察

不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。细菌30~37℃1~2天

放线菌25~28℃5~7天霉菌25~28℃3~4天

每隔24小时统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，这样可以防止因培养时间不足而

导致遗漏菌落的数目,一般来说,在一定的培养条件下（相同的培养基、唯独及培养时间），同种微生物

表现出稳定的菌落特征。形状、大小、隆起程度、颜色

・设置对照

设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。对照实验是

指除了被测试的条件以外，其他条件都相同的实验，其作用是比照试验组，排除任何其他可能原因的干扰，

证明确实是所测试的条件引起相应的结果。

（4）统计菌落数目

①常用来统计样品中活菌数目的方法是稀释涂布平板法。

②理论依据：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。

通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。为了保证结果准确，一般选择菌落数在

3〜5的平板进行计数

一般来说，选择菌落数在30〜300的平板进行计数，并取平均值。统计的菌落数往往比活菌的实际数目低。

这是因为两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此，统计结果一般用菌落数而不

是活菌数来表示。计算出平板菌落数平均值，然后按公式进行计算。

每克样品中的菌落数=（C/V）*M其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板

时所用的稀释液的体积（ml）,M代表稀释倍数

采用此方法的注意事项：1.为了防止菌落蔓延，影响计数，可在培养基中加入TTC

2.本法仅限于形成菌落的微生物。

另外，显微镜直接计数也是测定微生物数量的常用方法（不能区分死菌与活菌不适于对运动细菌的计数

需要相对高的细菌浓度个体小的细菌在显微镜下难以观察）

计算公式

每亳升原液所含细菌数=每小格平均细菌数X400X10000X稀释倍数

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课题3分解纤维素的微生物的分离

基础知识：

（一）纤维素和纤维素酶

1、纤维素

纤维素是一种由姬健首尾相连而成的高分子化合物。植物每年产生的纤维素能被土壤中的某些微生

物分解利用，是因为它们能产生红维素也。对这些微生物的研究与利用，使人们能够利用秸秆等废弃物生

产酒精,用纤维素酶处理服装面料等。

①作用：纤维素在造纸业中大量使用，是重要的造纸原料。

纤维素可以制成甲基纤维素、乙基纤维素、较甲基纤维素、微晶纤维素等衍生物。

食物中的纤维素（即膳食纤维）对人体的健康也有着重要的作用。

②分布：纤维素是自然界中分布最广、含量最多的一类多糖,植物的根、茎、叶等器官都含有大量的纤

维素。其中棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物。木材、作物秸秆等也富含纤维素。

注意：

纤维素与淀粉都是由葡萄糖组成的，但组成两者的葡萄糖的连接方式不同，因而使两者的形态完全不同。

2、纤维素酶的组成及作用

纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即口肝、Cx酶和葡萄糖合院,前两种酶使纤

维素分解成纤维二糖,第三种酶将红维三超分解成葡萄糖。纤维素最终被水解成葡萄糖，为微生物的生长

提供营养。

（-）纤维素分解菌的筛选

1、纤维素分解菌的筛选方法：刚果红染色'法,这种方法能够通过颜色反应直接对微生物进行筛选。

2、纤维素分解菌的筛选方法的原理

刚果红是一种染料，它可以与纤维素形成红色复合物,但并不和水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种

反应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复合物。当

纤维素被纤维素酶分解后刚果红一纤维素的复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的

透明圈。这样我们可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。

三、实验操作

分离分解纤维素的微生物实验流程：

土壤取样一选择培养（此步是否需要，应根据样品中H的菌株数量的多少来确定）-梯度稀释将样品涂

布到鉴别纤维素分解菌的培养基上一挑选产生透明圈的菌落。

（-）土壤取样

采集土样时，由于生物与环境的相互依存关系，在富含纤维素的环境中，纤维素分解菌的含量相

对提高，因此从这种上样中获得目的微生物的几率要高于普通环境。如树林中多年落叶形成的腐殖上，多

年积累的枯枝败叶等等。若找不到合适环境，可将滤纸埋在土壤中一个月左右（滤纸埋在土壤中能使纤维

素分解菌相对聚集，实际上是人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境。一般应将纸埋于深约10cm左右腐

殖土壤中。），也会有能分解纤维素的微生物生长。

（二）选择培养

1.选择培养的目的：增加纤维素分解菌的浓度,以确保能够从样品中分离到所需要的微生物。

2.制备选择培养基：

①旁栏中的配方是液体培养基还是固体培养基？为什么？

是液体培养基，原因是配方中无凝固剂。

②这个培养基对微生物是否具有选择作用？如果具有，是如何进行选择的？

有选择作用，本配方中的碳源是纤维素，所以能分解纤维素的微生物可以大量繁殖。

③你能否设计一个对照实验，说明选择培养基的作用

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用牛肉膏蛋白陈培养基与之对照。

3、选择培养

将土样加入装有30ml选择培养基的锥形瓶中，将锥形瓶固定在摇床上，在一定温度下震荡培养1〜2

天，直至培养液变浑浊。也可重复选择培养

注意：为什么选择培养能够“浓缩”所需的微生物？

在选择培养的条件下，可以使那些能够适应这种营养条件的微生物得到迅速繁殖，而那些不适应这种营养

条件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到“浓缩”的作用。

（三）梯度稀释

将选择培养后的培养基进行等比稀释IO,〜10“倍。将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上。

（四）将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上

1.制备培养基:参照课本旁栏中的比例配制。

2.倒平板操作。

3.涂布平板：将稀释度为IO,〜KT的菌悬液各取o.iml涂布到平板培养基上，30c倒置培养，菌落周围会

出现明显的透明圈。

4.挑选产生透明圈的菌落（参照课本刚果红染色法，挑选产生透明圈的菌落，一般即为分解纤维素的菌落。）

（五）刚果红染色法

方法一：先培养微生物,再加入刚果红进行颜色反应。

优点：这样显示出的颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用。

缺点：操作繁琐，加入刚果红溶液时会使菌落之间发生混杂。

方法二：在倒平•板时就加入刚果红。

优点：操作简便，不存在菌落混杂问题。

缺点1：由于在纤维素粉和琼脂、土豆汁中都含有淀粉类物质，可以使能够产生淀粉酶的微生物出

现假阳性反应。但这种只产生淀粉酶的微生物产生的透明圈较为模糊，因为培养基中纤维

素占主要地位，因此可以与纤维素酶产生的透明圈相区分

缺点2：有些微生物具有降解色素的能力，他们在长时间培养过程中会降解刚果红而形成明显的透

明圈，与纤维素分解菌不易区分。

对分解纤维素的微生物进行了初步的筛选后，只是分离纯化的第一步，为确定得到的是纤维素分解菌，

还需要进行发酵产纤维素酶的实验，纤维素酶的发酵方法有液体发酵和固体发酵两种。纤维素酶的测定方

法，一般是对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的葡萄糖进行定量的测定。

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专题3植物的组织培养技术

课题1菊花的组织培养

一、基础知识

1.细胞分化

概念：植物的个体发育过程中，细胞在形态、结构和牛.理功能上都会出现稳定性的差异,形成这些差

异的过程就叫做细胞分化。细胞分化是基因选择性表达的结果。

•细胞分化是一种持久性的变化，它有什么生理意义？

使多细胞生物体中细胞结构和功能趋向专门化，有利于提高各种生理功能的效率。

2.细胞全能性

已经分化的细胞。所具有发育成完整个体的潜能,即每个生物细胞都具有全能性,因为含有全套遗

传信息.（细胞全能性是组织培养的基本原理）。但在生物体的生长发育过程中并不表现出来，这是因为在

特定的时间和空间条件下,通过基因的选揖蛭达，构成不同组织和器官。

3、植物组织培养

离体的植物组织或细胞（又叫外植体）,在培养了一段时间以后，会通过细胞分裂，形成愈伤组织，

愈伤组织的细胞排列疏松而无规则，是一种高度液泡化的呈无定形状态的薄壁细胞。由高度分化的植物组

织或细胞产生遂伤组织的过程,称为植物细胞的脱分化，或者叫做去分化。脱分化产生的愈伤组织继续进

行培养，又可以重新分化成根或芽等器官,这个过程叫做再分化。再分化形成的试管苗，移栽到地里，可

以发育成完整的植物体。

植物组织培养的基本过程

人为使用植物激素控制

注意：①脱分化：指已经分化的植物器官、组织或细胞,当受到创伤或进行离体（也受到创伤）培养时，

已停止分裂的细胞,又重新恢复分裂,细胞改变原有的分化状态,失去原有结构和功能,成为具有未分化特

性的细胞。

②植物组织培养必要条件：细胞离体;一定的营养物质、激素和其他外界条件。

•影响植物组织培养的因素

1.内部因素：植物材料的选择直接关系到试验的成败。

植物的种类、材料的年龄和保存时间的长短等都会影响实验结果。

不同的植物组织，培养的难易程度差别很大。

烟草和胡萝卜的组织培养较为容易。枸杞愈伤组织的芽诱导比较难C

同种植物材料，年龄、保存时间的长短等也会影响实验结果。

菊花的组织培养，一般选择砧花擅物的茎上部新萌生的侧枝。

一般来说，容易进行无性繁殖的植物容易进行组织培养。

选取生长旺盛嫩枝进行组培的是嫩枝生理状态好，容易诱导脱分化和再分化。

2.外部因素：

（1）营养条件：离体的植物组织和细胞，对营养、环境等条件的要求相对特殊，需要配制适宜的培养基。

常用的是还培养基，其主要成分包括：大量元素,如N、P、S、K、Ca、Mg；微量元素,如Fe、Mn、

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B、Zn、Cu、Mo、I、C。：有机物有甘氨酸、烟酸、肌聘、维生素、蔗糖等。

(2)植物激素：植物激素中生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键性因素。在生

长素存在的情况下，细胞分裂素的作用呈现加强趋势。在培养基中需要添加生长素和细胞分裂素等植物激

素，其浓度、使用的先后顺序、用量的比例等都影响结果。

生长素/细胞分裂素比值与结果

使用顺序实验结果

比值高时促根分化，抑芽形成

先生长素，

有利于分裂但不分化比值低时促芽分化，抑根形成

后细胞分裂素

比值适中促进愈伤组织生长

先细胞分裂素，

细胞既分裂也分化

后生长素

同时使用分化频率提高

(3)环境因素：PII、温度、光等条件也能影响植物组织培养。不同的植物对各种条件的要求往往不同。

菊花组织培养，一般PH控制在鸥左右j温度控制在坨丝2；每天用日光灯照射12小时。

三、实验操作过程

1.制备MS固体培养基

实验室一般使用4c保存的配制好的培养基母液来制备

(1)配制各种母液。

配制母液时，大量元素浓缩10倍,微量元素浓缩100倍