AbMole揭示调节 ASK1 抑制性磷酸化新机制

AbMole|揭示调节ASK1抑制性磷酸化新机制一．研究方法在本研究中，采用化学生物学方法研究内质网应激诱导的细胞死亡机制。使用基于细胞的高通量筛选(HTS)试验来鉴定从毒胡萝卜素诱导的细胞死亡中拯救神经元细胞系的化合物，研究中鉴定了苯二氮卓酮，可选择性抑制由内质网应激诱导剂（毒胡萝卜素和衣霉素）引起的细胞死亡，但不抑制外源性诱导剂引起的细胞死亡。这些苯二氮卓类化合物抑制与Ire1α通路相关的生化事件，包括调节凋亡信号激酶1(ASK1)的磷酸化和抑制JNK和p38MAPK的下游激活。研究中，选了平均浓度为15µg/ml(~20–50µM)的50,000种小分子化合物的ChembridgeDIVERset化学库，使用HTS分析从中鉴定了198种主要苗头化合物。其中，93种化合物在重新测试时得到确认。其中，活性化合物CID-2879344和CID-2891837均来自于ChembridgeDIVERset化学库。结构式分别如下图所示：Fig1.A.CID-2879344结构式（#5976228）B.CID-2891837结构式（#6239507）二．研究结果化学信息学数据分析显示，26个确认的活性化合物中的11个构成了一系列11个结构相关的苯二氮卓酮（EC50值范围从10到25µM），化合物CID-2891837是11种苯二氮卓酮中最有效的(EC507.1µM)，如图2所示。Fig2.IdentificationofcytoprotectivebenzodiazepinonebyHTS.研究中检测了化合物对TG处理的原代小鼠皮层神经元的活性。暴露于5µMTG18小时后，原代皮质神经元细胞显示回缩的神经突和浓缩的细胞核，这是典型的细胞凋亡。用TG和DMSO（对照）处理的原代神经元中有一半以上在18小时内发生凋亡，而在用TG和化合物CID-2891837处理的培养物中，神经元凋亡并未显著高于未处理的细胞（图3D）。因此，可以得出结论，活性苯二氮卓类药物如CID-2891837具有神经保护活性。Fig3.BenzodiazepinonesselectivelyprotectagainstcelldeathinducedbyERstress.通过磷酸化特异性抗体免疫印迹，被观察用活性苯二氮卓酮衍生物（CID-2891837、CID-2891533、CID-2891714、CID-2882794和CID-2879344）培养的细胞增加了丝氨酸967磷酸化，而845和丝氨酸83未调制，如图4A、B所示。当细胞与无活性的苯二氮卓酮CID-2882293一起培养时，获得了类似的结果。相比之下，当细胞与活性苯二氮卓酮CID-2891837一起培养时，丝氨酸967磷酸化在添加TG之前升高并保持升高。因此，活性苯二氮卓类药物会破坏ASK1丝氨酸967磷酸化的正常模式。制备裂解物并进行GSTpulldown以回收GST-14-3-3蛋白，并用抗HA抗体对蛋白质复合物进行免疫印迹以检测相关的HA-ASK1蛋白。在DMSO处理的对照细胞中，TG最初在0.5小时诱导增加，然后在1小时时减少HA-ASK1与GST-14-3-3的结合，这与丝氨酸967磷酸化的变化相关（图4D）。使用无活性的苯二氮卓酮CID-2882293处理的细胞进行了类似的观察。相比之下，当细胞用活性苯二氮卓酮CID-2891837培养时，HA-ASK1与GST-14-3-3的结合增加，而与毒胡萝卜素处理无关（图4D）。为了将这些研究扩展到内源性ASK1和14-3-3蛋白，研究中使用肿瘤细胞系OVCAR5和SNB19进行了实验，与293T细胞相比，它们含有更高水平的这些蛋白质。内源性ASK1被免疫沉淀，并通过免疫印迹检测结合14-3-3。在这些细胞中，TG对ASK1与14-3-3的相互作用几乎没有影响，但活性苯二氮卓酮CID-2891837产生一致的结果，导致内源性ASK1与14-3-3的关联增加（图4E）。Fig4.BenzodiazepinonecompoundsincreaseSer-967phosphorylationofASK1andassociationwith14-3-3.三．延展思考尽管本研究展示了化合物作用机制的物理证据，但研究中描述的细胞保护性苯二氮卓化合物调节ASK1磷酸化和活性的详细机制仍有待阐明（图5）。另外，关于磷酸酶，已报道钙调神经磷酸酶（PPase3，以前称为PPase2B）使ASK1的丝氨酸967去磷酸化。然而，本研究中没有使用体外ASK1去磷酸化试验观察到化合物CID-2891837对钙调神经磷酸酶的抑制作用，这意味着钙调神经磷酸酶不是细胞保护性苯二氮卓类化合物的直接靶标。Fig5.Illustrationshowingsit