【人参抗氧化活性的探究11000字（论文）】

VI页共22页1引言1.1研究背景人参是五加科的一种多年生草本，主要在中国，俄罗斯，朝鲜等地区。人参是一种补气的药物，主要有补气固元、补脾益肺、益气生津、安神益智等作用，主要是针对气血亏虚、脾虚乏力、心神不安、久病体虚气脱等症状。人参叶多为长柄掌形复叶，其轮生叶的数量因其生长年份而异，最多可达六个。人参叶中的多糖、皂苷、黄酮等多种成分。[1-3]人参叶是一种常用的中药材，主要有补气益肺、祛暑生津的作用，而且容易获得，价格便宜，口感好，是轻工业的重要原料。例如，药膏、烟、酒等含有人参叶的产品，在餐饮业中也广泛应用。因此，人参叶在我国有着巨大的发展潜力，若加以利用，不但可以为本地农业提供巨大的发展机会，更可为我国的经济增加一笔可观的收入。1.2研究意义随着生活节奏的加快，生活质量的不断提高，人们对健康的要求也越来越高，保健品的市场也在不断地扩张。由于人参的应用范围日益扩大，其使用量也在逐年增长，因此，对人参的需求量也在不断增长。而且，人参的药效太强，不能作为一种保健品。所以，开发人参叶只非常重要的。人参叶不仅有人参的功效，而且药性柔和，是一种很好的保健食品。人参叶含有丰富的氨基酸、黄酮等多种有益于人体健康的物质，黄酮是一种常见的植物次生代谢物。在养殖中，黄酮是一种比较常用的药物，可以促进动物的繁殖，同时也可以起到抗氧化、延缓衰老的作用。另外，还能改善心脑血管疾病，高血压，脑溢血。本文采用微波、超声、热回流三种常用方法对人参叶进行了初步对比，并建立了响应面模型，探讨了人参叶总黄酮的提取工艺，并进行了相应的抗氧化试验。1.3相关概念阐述1.3.1皂苷类成分目前，已从人参皂苷中分离、鉴定出了40多个皂苷单体。尽管这种皂苷在自然界中的含量很低，但是它具有大量的、复杂的结构，使它的结构更加丰富。此外，该物质具有多种有效的生物活性，可为新药的研发提供丰富的前驱物，具有较好的应用前景。1.3.2黄酮类成分人参黄酮能显著提高心脏冠状动脉血流，并能增强其生理活性，但目前从人参中提取的黄酮成分很少，多数为黄酮醇。1.3.3人参皂苷Rg1人参、三七和西洋参富含人参皂苷Rg1，其分子结构如图1-1所示。近年来，Rg1具有很强的降血糖和抗氧化活性。人参皂甙Rg1对糖尿病大鼠心肌细胞有明显的抑制作用。图1-1人参皂苷Rg1分子结构Fig.1-1ThemolecularstructureofGRg1人参皂甙Rg1已被广泛应用于多种疾病的防治。四君子茶由人参、白术、茯苓、甘草等组成，是一种滋补中药，是一种优良的中药制剂。另外，它还具有保护神经退化的作用，提高学习和记忆的能力。抗心肌缺血和减少心肌细胞增生。此外，此外，人参皂甙Rg1还具有一定的抗肿瘤作用，其作用机制包括调控免疫系统、抑制肿瘤细胞的增殖、诱导其凋亡。1.3.4人参皂苷RH2、RG3人参皂苷是人参当中主要的抗肿瘤成分，人参皂甙RH2、人参皂甙RG3是具有抗癌作用的主要组分。有关研究发现，人参皂苷RH2、Rg3具有诱导细胞分化、延缓细胞周期、抑制肿瘤细胞的转移、诱导细胞凋亡、调控免疫等作用。二醇皂甙Rg3是一种罕见的人参皂甙，具有抗炎、抗肿瘤、增强免疫、抑制血管新生等功效。与人参皂甙RH2结合，可促进血液的吸收，提高其功效[5]。目前，已有文献报道，人参皂甙RH2和Rg3在肿瘤的发生过程中具有重要的作用，RH2和Rg3对胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭有一定的抑制作用，但PDL1的加入使其对肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭有一定的影响，说明RH2和Rg3在胃癌中的抑癌作用，PDL1是肿瘤的启动因子。通过对人参皂甙RH2、Rg3、PDL1的相互作用研究，可以为进一步认识人参皂甙RH2、Rg3、PDL1的作用机理提供新的思路。1.3.5人参皂苷G-Rg3人参皂苷G-Rg3是被认为是人参最重要的活性成分之一，具有嗜中性粒细胞浸润的抑制作用，改善免疫功能和增强抗病能力，抗肿瘤作用，抑制NLRP3炎性小体激活等。Yang[6]等发现人参皂苷Rg3抗炎机制新位点，人参皂甙Rg3通过PI3K/AKT/mTOR通路介导脂多糖致急性肺损害的保护效应。Tang[7]等人的研究表明，Rg3可以作为一种新的治疗结直肠癌的方法，Rg3不但可以抑制CRC细胞的增殖，还可以抑制肿瘤的新生血管形成。Wang[8]等人探讨Rg3对鼻咽癌（NPC）细胞的转移、浸润作用及作用机理。Rg3能调控MMP-2和MMP-9在MMP-2和MMP-9中的表达，从而抑制EMT与EMT有关的转录因子的表达。1.4研究综述1.4.1抗肿瘤人参皂甙具有抑制肿瘤细胞增殖、调控信号通路和调控机体免疫功能的作用。人参皂甙Rg3具有抑制乳腺癌增生、抑制甲状腺癌转移、逆转A549/DDP的多药耐药性、提高结直肠癌对放射治疗的敏感性、抑制胰腺肿瘤的增殖。它具有多种机制，具有较强的抗癌活性。相对于人参皂甙Rg3，人参皂甙Rh2具有更大的抗肿瘤活性。它能降低microRNA-31的增殖和迁移，逆转人结直肠癌的耐药性，抑制Bcl-2细胞和子宫肌瘤细胞的生长，抑制NSCLC的迁移和侵袭，抑制人A172细胞增殖，诱导细胞周期阻滞，诱导细胞凋亡，抑制Bcl-2在白血病细胞中的作用。另外，达玛烷类皂甙的很多成份都具有很好的抗癌作用。人参皂甙Rb1,Rb2,Rc,Rd,F2,Rh1,Rh4，三七皂苷R1，原人参三醇，CK和gypenosideLXXV等皂甙类物质，对卵巢癌、乳腺癌、胃癌、肝癌、结直肠癌等多种肿瘤有明显的疗效。周成等人发现，人参皂甙Rg3能抑制人腔鳞癌细胞的增殖及上皮间充质转化，其作用机制是调控miR-221[11]。郭奕维等人发现，人参皂苷Rg3与PD-1抑制剂结合后，能抑制T细胞的增殖，促进细胞的分化，从而具有抑制DLBCL细胞的作用。王学谦发现，人参皂苷Rh2能调控细胞凋亡，从而调控细胞凋亡。何运元等发现，人参皂苷Rg3能通过调控Wnt/b-Catenin信号途径，从而对大肠癌细胞的增殖起到一定的抑制作用。武文华相信，人参皂甙Rg1可以促进免疫和IL-2的产生，而Inf-IL-12p40则可以提高人体对肿瘤的免疫应答，并在裸鼠卵巢癌中起到了一定的免疫调控作用[15]。肿瘤的形成与肿瘤细胞数量增加密切相关。一些天然药物可以通过调控细胞增殖和细胞周期蛋白的表达来抑制肿瘤细胞的增殖，从而实现抗癌。1.4.2神经保护人参皂甙Rg1是一种具有重要作用的神经保护药物，它被用于治疗抑郁症，缺血性中风，阿尔茨海默综合症，帕金森病等。抗氧化及神经抑制细胞凋亡的研究，抑制谷氨酸的炎症毒性，防止钙离子过量流入神经元，维持细胞ATP水平和保护神经元结构的完整性。周婷婷等[16]通过了关于连环蛋白保护机制的Wnt/b-研究。通过连接蛋白的信号途径可以保护帕金森病的神经，为帕金森病的治疗开辟了新途径。海马内侧前额叶皮质和大脑皮层中约50%的锥体细胞具有神经元活性减少神经损伤。人参皂甙Rg1还可以防止慢性应激大鼠前额叶皮质中受损的神经营养因子蛋白水平下降，并改善抑郁行为。人参皂甙Rg1是人参中一种主要的有效成份，它能有效地调节人体的核酸合成，并能有效地保护人体的神经。为证实人参皂甙Rg1能有效地保护BBB，减少TBI的损害，已有学者从宏观角度进行了脑组织损害评分、脑组织含水率、脑组织伊文思蓝渗透试验，结果显示，脑组织含水量、伊文思蓝的渗透率都增加，Rg1对脑组织的影响程度、脑组织含水量、伊文思蓝的渗透率都明显降低；应用WesternBlot法从微观层面研究了人参皂甙Rg1对TBI后继发损害的影响。本研究显示，Rg1对BBB及TBI有较强的保护及治疗作用，且有一定的剂量依赖性，本试验以15mg/kgRg1为最佳。达玛烷型皂苷对于神经保护方面的功效首先集中于增强认知能力，如CK和原人参三醇可改善东莨菪碱引起的小鼠认知功能障，而人参皂苷Re可改善高脂饮食引起的认知功能障碍。通过调节单胺类和氨基酸能受体，人参皂苷Rb1发挥显著的抗抑郁功效。通过不同的抑郁模型评价，人参皂甙Rb3具有明显的抗抑郁作用。人参皂甙Rg3能减轻脂多糖引起的抑郁症，而人参皂甙Rg2对慢性应激抑郁症有显著作用。在当代的疾病模型中，导致神经损害的毒素种类繁多。结果表明：人参皂甙Rd能有效地防止三甲基锡的神经毒性，而人参皂甙Re可通过活化IL-6介导的PI3K/Akt信号通路来抑制三甲基锡的神经毒性，三七皂苷R1能通过提高Trx-1的Trx-1对PC12细胞的神经毒性作用，而人参二醇则能通过PI3K/Akt通路来抑制其毒性，而三七皂苷R2则能通过活化MER1/2-ERK1/2/2/2途径对SH-SY5Y细胞的毒性作用。另外，人参皂甙Rg1对神经有明显的保护作用。它能调节黑质α-突触核蛋白，缓解MPTP引起的帕金森病模型动物的运动障碍和神经炎，并能诱导TIPE-2基因在梗阻性黄疸模型中的表达[18]。人参皂苷对大鼠脑缺血-再灌注损伤的影响作用，从而保护神经元免受炎症反应、能量紊乱、细胞内钙稳态的影响，自由基产生和凋亡基因激活。杨俊华等发现，结果表明，Rg1对FZD1、PIWIL1、FoxM1等相关基因及蛋白的表达有一定的影响。Tiangyang等人发现，Rg1可以通过降低大脑皮层中促炎细胞因子、蛋白聚合体和蛋白酶体的表达，从而抑制NF-k核转位B和IkBPH的增殖，从而减轻脑缺血-再灌注的损害。徐慧等研究表明，人参皂苷Rb1能降低大鼠脑缺血再灌注后脑组织SOD活力，从而起到保护脑功能的作用。人参皂甙对中枢神经系统有一定的促进作用，能改善神经性痴呆和帕金森病等的临床表现。人参总皂苷Rg1,Rb1,re,Rg3，以及它们的代谢物，人参二醇[20(s)-原人参二醇]可以调节HPA轴功能，增加脑源性神经营养因子，调节细胞因子，调节细胞因子，使星状细胞数目增加，增加脑部单胺神经传递素的含量。这些功能可通过减少淀粉样肽的形成和沉淀、减少脑内老年斑和神经纤维池的形成、抑制微管相关蛋白的磷酸化、抗凋亡、改善神经可塑性、减少脑细胞对铁的吸收、抗氧化应激与促进神经干细胞增殖。1.4.3抗糖尿病在中国古代，人参就被用于治疗糖尿病，并且长期以来在预防和治疗慢性病方面取得了良好的效果。防止氧化应激和炎症反应。它有很好的降糖作用，对糖尿病有很好的抑制作用。它在血管生成、细胞凋亡、肝细胞保护等方面也有一定的作用。结论：人参皂苷Rg1能降低人体对葡萄糖的吸收，降低体内脂肪的生成，并能有效地抑制体内脂质的沉积。增强Akt与FoxO1的交互作用，阻断其转录调控，从而减少胰高血糖素的应答。结果表明：CK和人参Rb1可以通过AMPK通路减轻大鼠的糖耐量，并能明显降低大鼠的血糖水平[22]。人参皂甙Rb2能促进糖代谢，降低脂肪的积聚，并激活AMPK通路，起到抑制糖尿病的作用。同时，人参皂甙Rb3还能促进AMPK信号途径的活化，从而抑制肝糖的异生，提高其降糖效果。人参皂甙Re可以减轻高脂肪食物对C57BL/6大鼠的胰岛素抵抗，还可以通过活化PPAR-γ通路、抑制TNF-α的生成来减少胰岛素抵抗。高脂饮食中AMPK活化蛋白激酶能抑制HepG2细胞和高脂饮食，起到降低血糖、血脂的作用。三七皂苷R1通过调节miR-29a而降低TNF-α所致胰腺β细胞凋亡及功能紊乱。1.4.4心血管保护人参皂甙是一种具有抗心律失常作用的多离子通道阻断剂。缺血-再灌注损伤是指机体在遭受局部缺血和随后的再灌注时，会出现一系列的器官功能损害和微循环紊乱。心脏、脑、肾、小肠等组织器官都有可能出现这种情况，而心肌缺血-再灌注损伤是最为普遍的。当心脏受到缺血和再灌注的损害时，冠状动脉的供血不足，会导致心肌的损害、心电传导的异常，甚至是恶性的心律失常，甚至是心跳停止。由于缺血再灌注损伤，导致缺血再灌注损伤，导致心肌功能衰竭，导致心悸、胸痛。人参皂甙补益气血，滋养心肌，保持血管和心肌的正常功能，减少心脏的损害。1.4.5抗炎作用炎性反应与许多疾病有关，达玛烷类皂甙具有不同的抗炎活性。例如，CK能降低COX2的抗炎、人参皂甙Rb1对3T3-L1脂肪细胞有明显的抑制作用；人参皂甙F2可通过NF-κB通路抑制HEK-293细胞的凋亡，从而降低HEK-293的发生。人参皂苷Rb2和Rc都能提高GPR120的表达，提高其对LPS刺激RAW264.7巨噬细胞的抗炎效果。人参皂甙Rh2通过调控NF-κB在哮喘模型中活化，从而缓解了过敏性气道炎症，而人参皂甙Rh1、人参三醇对TNBS引起的大鼠结肠炎有明显的抑制作用。1.4.6肝肾保护人参皂苷Rg1也广泛用于肝脏疾病。肝脏在外源生物的代谢中起着重要作用。当肝脏受损时，会导致细胞肿胀、变性、坏死、肝纤维化和功能障碍。人参皂苷Rg1通过减少细胞凋亡和炎症反应，保护肝脏免受缺血再灌注损伤和2型糖尿病，以及保护四氯化碳引起的急性肝损伤。人参皂苷Rb3通过调节AMPK/mTOR介导的自噬和抑制细胞凋亡信号通路，对顺铂引起的肾脏损害有一定的保护作用。人参皂甙Re对LLC-PK1的肾脏有明显的毒性效应。三七皂苷R1对大鼠肾脏的损害有一定的抑制作用。同时，它还能通过调控Kltho/TGFβ1/Samd信号途径对D-半乳糖诱导的亚急性肾损害有一定的作用。CK、人参皂甙Rh1对无酒精性脂肪病有明显的改善作用。人参皂甙Rg1在抑制TLR4信号途径的作用下，能抑制LLR4信号途径引起的急性肝脏损害，并能通过抑制上皮-间充质转化和活性氧产生而减轻肝纤维化。1.4.7抗氧化从人参中提炼出的珍贵的皂甙和次生糖甙被注入了模仿太空压力的老鼠。这些珍稀的皂苷、次皂苷对模拟太空飞行应激大鼠SOD、过氧化氢酶活力、TAOC、MDA含量明显下降。结果表明，人参皂甙能显著降低丙二醛浓度，延缓氧化应激。此外，人参皂甙Rg1还能改善催化剂、超氧化物及GSHPX，并能显著降低Oka诱发的PC12神经元ROS的累积，从而保护神经元；人参皂甙Rg2能增加大鼠的SOD活力，并能显著降低大鼠的MDA含量，从而减轻大鼠的氧化损伤，并能明显地抑制其体内的XOD活力，从根本上抑制其过氧化自由基。2实验材料与仪器2.1试剂与材料材料：人参叶于2020年3月购于安徽菌启健康科技有限公司，原产地中国吉林。其他所用试剂如表1所示。表1主要试剂及厂家试剂厂家无水乙醇（分析纯）安徽安特食品股份有限公司亚硝酸钠（分析纯）国药集团化学试剂有限公司硝酸铝（分析纯）山东西亚化学工业有限公司氢氧化钠（分析纯）西陇科学股份有限公司芦丁北京索莱宝科技有限公司1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（dpph）上海麦克林生化科技有限公司2.2仪器与设备表2主要仪器及厂家仪器厂家多功能粉碎机永康市铂欧五金制品有限公司电子天平海特勒-托利多仪器上海有限公司液晶超声波清洗机昆山洁力美超声仪器有限公司SHZ-D(3)型循环水真空泵巩义市英峪高科仪器厂恒温水浴锅巩义市予华仪器有限责任公司可见光分光光度计上海元析仪器有限公司3实验方法3.1样品的制备将买来的人参叶的茎杆去掉，称取500克人参叶，将其粉碎，时间为10秒，然后用80目筛将得到的人参叶粉末过滤，密封保存。3.2人参叶总黄酮含量的测定3.2.1芦丁标准曲线的绘制参照田建华等人的方法[10]采用不同浓度的芦丁溶液，在510nm下进行吸光度的测量，以芦丁浓度为横坐标，以吸收为纵坐标，绘出芦丁标准曲线。3.2.2人参叶总黄酮提取得率的测定用紫外光分光光度计对黄酮的吸收进行了分析，并用芦丁标准曲线中的有关公式求出了总黄酮的含量，并按以下公式求出了总黄酮的浸出率：公式中Y表示人参叶总黄酮的提取速率（mg/g),C表示质量浓度（mg/ml),N表示稀释数，V表示萃取液的体积（ml),M表示人参叶片的粉末重量（g）。3.3人参叶总黄酮提取方式的筛选首先，在樊志强等人的基础上，对超声波、热回流、微波三种提取工艺进行了考察。3.3.1提取溶剂的筛选采用超声波辅助萃取，以不同的蒸馏水、40%乙醇浓度和70%乙醇浓度对总黄酮的提取效果进行了研究。按照樊志强（10）等人的实验方法，将参叶粉2.5克的粉状样品，在20℃下超声波萃取30分钟，然后在60℃下进行浓缩，定体积，冷冻保存。用总黄酮的方法对提取物的吸光率进行筛选。3.3.2超声辅助提取人参叶总黄酮将2.5g的人参叶干燥粉精确称取于圆锥形容器内，将干燥的人参叶片粉末溶于相应的溶剂中，密封10分钟，然后根据相应的温度进行超声波萃取，然后在60℃下进行萃取，在60℃下进行浸膏处理，然后密封保存。3.3.3微波法提取人参叶总黄酮将干燥的人参叶的粉末精确称取7g加入到烧杯中，然后将其加入相应的溶剂中，密封浸泡10分钟，然后将其放入三个烧瓶中，根据相应的要求进行微波萃取，然后在60℃下进行真空浓缩，将萃取液在60℃下进行浸渍，然后密封保存。3.3.4热回流法提取人参叶总黄酮将12.5克的人参叶干燥粉末精确称取于烧杯内，将其干燥后的参叶粉末溶解在相应的溶剂中，密封浸泡10分钟，然后将其放入圆形烧瓶中，根据相应的温度，在60℃下加热，在60℃下进行一定的回流，然后将萃取液放入60℃的锅中制成浸膏，最后密封保存。3.4超声提取人参叶总黄酮单因素试验本实验采用超声波提取率高的方法提取人参叶中的总黄酮，并对乙醇浓度、提取时间、提取温度等进行了单因素实验，并对其提取效果进行了分析对比。3.4.1乙醇浓度对总黄酮提取得率的影响首先参考田建华[10]提取超声总黄酮的方法，提取温度和时间保持一致，考察乙醇浓度为20%、40%、60%、80%时对人参叶总黄酮提取率的影响。3.4.2提取时间对总黄酮提取得率的影响提取时间为30、40、50分钟、60分钟、70分钟，提取时间在很大程度上对人参总黄酮的提取效果有影响。3.4.3提取温度对总黄酮提取得率的影响固定了15℃、30℃、45℃、60℃和75℃条件下提取人参总黄酮的最佳工艺条件。3.5超声提取人参叶总黄酮响应面试验参照2.2单因子分析结果，采用Designexpert8软件，以乙醇A浓度、B提取时间、C温度为反应因子，以人参叶中总黄酮提取率为反应因子，采用三因子三水平BOX-Beknke法测定[11]。测试因子的水平见表3。表3响应面因素水平表水平LevelA乙醇浓度Ethanolconcentration（%）B提取时间Extractiontime（min）C提取温度Extractiontemperature（℃）-1204030040504516060603.6提取液抗氧化活性试验3.6.1DPPH的配制将2毫克DPPH称入并溶于95%酒精中，将其定容到50毫升褐色容量瓶子中，待用。3.6.2测定人参提取液清除率按照反应面谈结果，提取了人参叶粉，用42号滤纸滤出人参叶粉，用旋转式蒸发器旋干燥，以25毫克/毫升的质量浓度30%乙醇进行复溶。对不同浓度的萃取溶液进行稀释，用酶标仪测定其对自由基的清除作用。用同样的方法将Vc溶液作为正比。对DPPH自由基进行了清除活性测试[12]。用100微升的DPPH与100微升的人参叶浸提液或Vc液进行比较，用无水乙醇作对照。将该混合物置于暗室内进行30分钟的反应，用517nm的酶标计测定吸收率。计算其对DPPH自由基的清除作用，其表达式如下：A0为空白对照的吸光度，A1为参叶浸膏的吸光度。4结果与分析4.1芦丁标准曲线通过对上述方法的分析，我们得到了芦丁的标准曲线，在该图中，该曲线的相关方程式是：Y=6.7098×-0.0002,R2=0.9971，因此，芦丁标准曲线具有较好的线性关系。图1芦丁标准曲线4.2人参叶总黄酮方法得率对比4.2.1提取溶剂预试验将三种不同的溶剂按相关的方法进行了初步的对比，得到了相应的结果。由该图可知，在乙醇浓度为40%的情况下，在蒸馏水和70%乙醇的浓度下，萃取的溶剂为40%。图2不同溶剂对人参总黄酮提取得率的影响4.2.2提取方法的筛选通过对超声、微波、回流三种工艺的对比，发现超声、微波、回流等工艺对黄酮的提取效果优于其它两种工艺，因此，采用超声波法进行后续的单因素实验。表4三种路线提取得率比较路线methods条件Conditions提取得率Totalflavonoidsextractionamount（mg/g）乙醇浓度Ethanolconcentration（%）提取温度Extractiontemperature（℃）提取时间Extractiontime（min）超声波提取Ultrasonic4030404.65热回流提取Hotreflux4030403.91微波提取Microwave4030403.46图3不同提取路线对人参总黄酮提取得率的影响4.3单因素试验在对不同的提取路线进行了初步的筛选后，选择了超声提取工艺，并用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠的方法，对不同的提取方法进行了比较：4.3.1乙醇浓度对人参叶总黄酮提取得率的影响通过对不同浓度的乙醇溶液进行分析，结合以前的萃取溶剂预试验，得到了黄酮的提取率。从图表中可以看出，随着酒精含量的增加，人参叶中总黄酮的提取率也随之增加，其中40%为最高，随后的实验中，随着酒精含量的增加，总黄酮的提取率显著下降，80%时含量最低。可能是酒精含量太高沉淀其它物质对总黄酮的产率有一定的影响[13]。综合考虑，选择20%,40%,60%三种酒精浓度，对后续响应面实验进行优化研究。图4不同乙醇浓度对人参叶总黄酮提取得率的影响4.3.2提取时间对人参叶总黄酮提取得率的影响对不同的超声提取时间进行了研究，得到了黄酮的提取速率。由图表可知，随着超声波作用时间的增加，总黄酮的提取率在50分钟内达到最高，而在随后的实验中，总黄酮的得率随时间的推移而下降，而在30分钟内，总黄酮的得率最低。可能是由于提取时间太长导致了总黄酮的分解[14]。综合选择40分钟、50分钟、60分钟三种不同的萃取时间进行响应面实验，以寻求最佳工艺条件。图5不同时间对人参叶总黄酮提取得率的影响4.3.3提取温度对人参叶总黄酮提取得率的影响对不同萃取温度进行了研究，得到了黄酮的提取率。结果表明，温度越高，总黄酮的提取率越高，在45℃下提取率越高，而在随后的实验中，总黄酮的提取率随温度的提高而下降，总的提取率在15℃时下降，这主要是由于温度升高引起的总黄酮分解[15]。从30℃、45℃和60℃三个不同的温度下进行响应面实验，探讨了最优反应条件。图6不同温度对人参叶总黄酮提取得率的影响4.4响应面优化试验结果及分析4.4.1响应面试验设计及结果采用Designexpert8软件设计了人参叶中的总黄酮，其响应面的结果如表5所示。表5响应面设计及结果实验组号乙醇浓度提取温度提取时间黄酮提取量NoEthanolconcentrationExtractiontemperatureExtractiontimeTotalflavonoidsextractionamount（%）（℃）（min）（mg/g）10-1-15.04210-15.9430007.6340007.475-10-14.62601-16.467-1014.7881014.4791104.84100-115.38110007.2912-1-104.3013-1104.54140115.26150007.60160007.36171-104.684.4.2响应面显著性通过Designexpert8软件对人参叶总黄酮对乙醇浓度（A）、提取时间(B)、提取温度(C)进行多元回归分析二次回归方程为：Y=7.47+0.21A+0.21B-0.27C-0.020AB-0.41AC-0.39BC-1.73A²-1.15B²-0.79C²R²=0.9912表6响应面方差分析表方差来源平方和自由度均方F值P值显著性SourceSumofSquaresdfMeansquareFvaluePvalueSignificance模型Model25.4792.8387.2<0.0001***A0.3610.36110.0128*B0.3610.3611.130.0125*C0.5910.5918.140.0038**AB1.60E-0311.60E-030.0490.8306AC0.6610.6620.470.0027**BC0.5910.5918.270.0037**A²12.62112.62388.86<0.0001***B²5.5615.56171.21<0.0001***C²2.612.680.2<0.0001***残差Residual0.2370.032失拟LackofFit0.1430.0472.150.2369Notsignificant纯误差PureError0.08740.022总误差CorTotal25.716R²0.9912R2ADJ0.9798注：***表示P<0.001，差异极显著；**表示P<0.01，差异较显著；*表示P<0.05，差异显著。方差分析见表6，由表可知此模型的F值为87.20，P值＜0.0001说明回归模型为极显著水平；失拟项P=0.2369＞0.05为不显著水平，说明模型的试验误差小，模型总体可靠；R²=0.9912，R2ADJ=0.9798即表示该模型的拟合程度较好，能较好的预测各因素和人参叶总黄酮提取得率之间的关系，从而确定人参叶总黄酮最佳提取工艺条件。一次项中提取温度较显著，提取时间和乙醇浓度均为显著水平，二次项均为较显著水平，交互项可看出温度与乙醇浓度以及时间对提取得率的影响较显著[16]。同时一次项可得出对人参叶总黄酮提取得率影响大小依次是温度＞时间＞乙醇浓度。4.4.3响应面因素交互分析乙醇浓度与提取温度、乙醇浓度与提取时间以及提取温度和提取时间的两因素交互的响应面图如图7所示。图7因素间的交互作用对人参叶总黄酮提取得率的等高线和响应面图从表面上可以看到各因子间的相互关系和显著性，其中，斜坡能反映反应面各因子对参叶总黄酮提取速率的影响，而等高线则的相关形态则表明各因子间的交互作用是否明显，椭圆的差异较大，而圆的差异不明显。从不同的角度，可以得出不同浓度、不同萃取温度对不同萃取条件下的人参叶总黄酮的提取速率有明显的影响[17]。4.4.4人参叶最佳提取工艺结果通过反应面的实验，得出了以41.73%的乙醇、46.95℃、47.74分钟为最佳提取工艺条件，该工艺条件下，人参叶中总黄酮的提取率为7.52mg/g。4.4.4人参叶最佳提取工艺验证试验从反应面的最佳萃取效果和实际情况，将萃取条件设定为42%的酒精浓度，47℃的温度，48分钟的时间，经三个平行的实验，得出了人参叶中的总黄酮含量7.61mg/g和理论7.52mg/g的差异，表明该模型的总体数据是可信的。4.5人参叶提取液抗氧化性试验结果图8人参叶提取液对DPPH自由基的清除能力图8显示了人参叶清除DPPH的能力。结果表明，不同浓度的参叶对DPPH的清除作用和DPPH的去除作用存在一定的相关性。结果表明：人参叶浸膏对DPPH自由基的清除作用与其浓度有显著的相关性。从0.2毫克/毫升到0.6毫克/毫升的浸出量，在很大程度上由30%上升到61%，整体呈快速上升的态势。Vc组的清除率总体上比较平稳，从0.2mg/mL到0.6mg/ml，从76%上升到83%。结果表明：人参叶的抗氧化性与浓度呈显著的正相关，且呈显著的线性关系。5结论结果表明，不同乙醇浓度、温度、时间条件下，提取叶中总黄酮的提取率也不同，采用反应面试方法，建立了乙醇浓度、温度和时间的三因子三水平模型，并将各因素的相互作用和对提取总黄酮的提取效果进行了分析，得到了最佳提取条件：乙醇浓度42%，温度47℃，48min,48min，提取率最高。另外，对人参叶浸提液进行了抗氧化实验，结果表明：人参叶浸提液的抗氧化能力随浓度的增加而增加，从0.0mg/ml-0.6mg/ml的清除率由30%上升到61%，总体上呈快速上升的趋势，呈正线性关系，表明人参叶浸膏具有显著的抗氧化性。参考文献[1]陈英杰,崔承彬.人参叶中微量新皂甙—La的分离与鉴定[J].药学学报,1990,25(5):379-381.[2]张绍林,陈英杰.人参叶中的微量新皂甙[J].药学学报,1989,024(011):877-879.[3]吴锦忠,易骏.人参属四种植物中氨基酸和无机元素的比较研究[J].贵阳医学院学报,1992,017(003):230-232.[4]辜旭辉,于文涛,栾春海,等.人参,西洋参种质资源的生态环境和分布[J].人参研究,2006,18(002):000004-7.[5]金鑫.山中珍品话人参[J].生态文化,2003,000(001):35-38.[6]李清民,王晓中,周洪玉,等.HPLC法测定人参叶中人参黄酮苷的质量分数[J].吉林大学学报(理学版),2010,48(05):865-867.[7]赵雨晴,王宝庆,徐汉,等.醉鱼草总黄酮的提取及抗氧化活性研究[J/OL].化学试剂:1-13[2021-05-17].[8]赵一晖,张培军,战英,等.紫外分光光度法测定人参叶茶中人参总皂苷的方法学研究[J].中国卫生工程学,2012,11(01):63-64.[9]樊志强.银杏叶中总黄酮的提取工艺研究进展[J].当代农机,2020(10):78-80.[10]田建华,张春媛,魏璐.沙棘果渣总黄酮提取工艺优化及抗氧化活性研究[J].天然产物研究与开发,2021,33(01):6