《人全血糖化血红蛋白检测-基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法-标准编制说明》

一、工作简况

1、背景

糖化血红蛋白是2型糖尿病诊断以及病情监测的关键指标。因型糖尿病患者

众多，因此其检验量巨大。目前，该检测方法主要以高效液相色谱法等方法为主，

相关核心技术来源于国外，并且效率低、成本高、抗干扰能力差。本标准特选择

检测效率高、成本低、抗干扰能力强的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术

进行糖化血红蛋白的检测，该技术适用于检测通量高、成本控制要求严格的检验

环境，并且该方法抗干扰能力强，尤其适用于我国复杂的血红蛋白变异环境，属

于我国自主创新技术，有极大的推广意义。

《人全血糖化血红蛋白检测—基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法》系融

智生物科技（青岛）有限公司等企业在所研制生产的“新一代宽谱定量飞行时间

质谱平台QuanTOF”的基础上，开发的具有自主知识产权和核心技术的糖化血

红蛋白质谱定量检测方法。2021年1月，融智生物科技（青岛）有限公司等单

位起草完成了《人全血糖化血红蛋白检测—基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱

法》企业标准（企业标准号QB-IntelliBio-012-2021），并于2021年2月1日开始

实施。上述标准制订参与企业并进一步推广该方法为团体标准等工作。2022年，

相关文件提交中国分析测试协会及中关村材料试验技术联盟申报团体标准。

2、起草单位、起草人（按拼音排序）

A、起草单位：

北京大学深圳医院、北京融智优谱生物科技有限公司、广东默迪优谱生物科

技有限公司、杭州意诚默迪生物科技有限公司、南方医科大学珠江医院、融智生

物科技（青岛）有限公司、上海伍丰科学仪器有限公司、首都医科大学附属北京

朝阳医院、烟台大学生命科学院、中国科学院生物物理研究所；

B、主要起草人：

纪玲、李晨、李岩、李运涛、马昱、宋合兴、孙德慧、孙朋卫、王绪敏、王

玉玺、温斌斌、吴轶、谢雯春、徐安平、张瑞、周宏伟、周晓光

二、标准编制原则和确定标准的依据

本标准编制过程中参考或引用了以下相关标准：

GB/T191包装储运图示标志

GB4793.1测量、控制和实验室用电气设备的安全要求第1部分：通用要

求

GB4793.6-2008测量、控制和实验室用电气设备的安全要求第6部分:实验

室用材料加热设备的特殊要求

GB4793.9测量、控制和实验室用电气设备的安全要求第9部分：实验室

用分析和其他目的自动和半自动设备的特殊要求

GB7247.1激光产品的安全第1部分：设备分类、要求

GB/T14710医用电气环境要求及试验方法

GB/T18268.1测量、控制和实验室用的电设备电磁兼容性要求第1部分：

通用要求

GB/T18268.26测量、控制和实验室用的电设备电磁兼容性要求第26部

分：特殊要求体外诊断(IVD)医疗设备

YY0648测量、控制和实验室用电气设备的安全要求第2-101部分：体外

诊断（IVD）医用设备专用要求

GB/T21415—2008体外诊断医疗器械生物样品中量的测量校准品和控制

物质赋值的计量学溯源性

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB/T38576-2020人类血液样本采集与处理

JJF1528-2015飞行时间质谱仪校准规范

WS/T461-2015中华人民共和国卫生行业标准《糖化血红蛋白检测》

当前国内外共有数十家基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪研发、生产和

相关技术开发企业，但不同企业提供的质谱仪性能存在差异，尤其是对蛋白大分

子的灵敏度、质量分辨能力和线性范围，以及定量重现性能力不均，这些性能将

极大地影响到基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱对糖化血红蛋白检测的能力，

因此，本标准规范了基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪的相关基础性能要求

以及检测方法学流程等，并参考和引用了国家标准、行业标准中对糖化血红蛋白

检测仪、糖化血红蛋白检测方法的相关规范。

三、标准制定的主要内容

1、范围的确定

拟制定的标准适用于人全血中糖化血红蛋白的相对含量测定。

2、人全血糖化血红蛋白含量测定方法及指标的确定

目前常用的人全血糖化血红蛋白相对含量测定方法包括高效液相色谱法、电

泳法以及免疫测定法等，其中IFCC（国际临床化学和实验室医学联盟）以液相

色谱-串联质谱法作为参考方法。

目前已使用的各种方法中，较适宜临床使用的主要是高效液相色谱法等，但

人类血红蛋白情况复杂，尤其是我国跨越纬度较高，不同纬度人群血红蛋白的差

异明显，尤其是我国南方地区。这些差异造成现有方法存在较大测试干扰，因而

对进一步的确诊、精准治疗都有影响。

拟起草的标准采用了MALDI-TOFMS（基质辅助激光解吸电离飞行时间质

谱法），并分析了常见干扰情况，对现有方法在抗干扰以及精准医疗等方面进行

了延伸。

3、正确度、精密度测试

拟起草的标准在测试正确度、精密度等方面引用了WS/T461-2015《糖化血

红蛋白检测》的相关要求。

3.1精密度验证

2个浓度水平质控物分别每天重复测定3次，共5天，统计均值、标准差和

变异系数（CV）。按照CLSIEP15-A评价方案，室内变异系数（CV)小于3%，

以小于2%为宜。

注：（1）目前许多测定方法的室内CV小于2%。

（2）只有控制室内CV小于2%，才能实现室间CV小于3.5%。

（3）HbA1C测定质量目标：小于0.5%HbA1C。

3.2正确度

至少两个水平标准物质，每个水平标准物质3个平行样本，每个样本重复测

定6次。与可接受参考值的差值在±0.5%HbA1c范围内，以控制±0.3%HbA1c

范围内为宜。正确度验证方法，包括但不限于以下方式：

-参加室间质量评价（能力验证）计划；

-采用恰当的有证标准物质；

-与运行经过认证分析系统的有资质实验室的测定结果进行比对。

3.3线性

在检测区间范围内，检测结果的相关系数r应不小于0.990。

本标准所载的方法经融智生物科技（青岛）有限公司以及烟台大学生命科学

院、中国农业大学信息获取重点实验室、安徽皖测食品检测公司、上海市食品研

究所、北京大学深圳医院等实验室进行高、中、低值的三个样本平行比对实验，

测试结果满足WS/T461-2015对准确度以及相对偏差等的要求。结果见下表：

糖化值测试值

实验室样本偏差（%）

（%）（%）

A14.84.80

烟台大学

A210.4110.450.3842459

生命科学院

A316.0916.06-0.186451

中国农业A14.84.79-0.208333

大学信息获取A210.4110.420.0960615

重点实验室A316.0916.04-0.310752

A14.84.810.2083333

安徽皖测

A210.4110.470.5763689

食品检测公司

A316.0916.10.0621504

A14.84.79-0.208333

上海市食

A210.4110.39-0.192123

品研究所

A316.0916.05-0.248602

A14.84.912.2916667

北京大学

A210.419.94-4.51489

深圳医院

A316.0915.48-3.791175

4、抗干扰和异常样本测试情况

抗干扰能力及糖化血红蛋白变体情况评估

表1.QuanTOF用于糖化血红蛋白定量分析抗干扰评估

InterferencesBias,%Bias,mmol/mol

Bilirubin(≤304.0μ

≤0.1≤1

mol/L)

Triglycerides(≤22.8

≤0.1≤1

mmol/L)

cHb(≤8.7%)≤0.2≤2

LabileA1c(≤12.2%)≤0.2≤2

HbF(≤8.0%)≤0.2≤2

HbF(>8.0%)>0.2>2

HbJ-Bangkok-0.24

HbCoushatta-0.21

HbG-Taipei≤0.1

HbQ-Thailand-0.27

HbG-Honolulu≤0.2

HbAS:qualityseparationSglobinchainseparatedfromotherfractions

TruenessHbA1c(n=2)0.5,0.45,4

HbAC:quality

CglobinchaincoeluteswithHbA

separation

TruenessHbA1c(n=3)≤0.2≤2

HbAD:quality

DglobinchaincoeluteswithHbA

separation

TruenessHbA1c(n=5)≤0.2≤2

HbAE:quality

EglobinchaincoeluteswithHbA

separation

TruenessHbA1c(n=10)≤0.2≤2

A.1不稳定糖化血红蛋白

测定3例样本的红细胞的糖化血红蛋白值，包括正常水平(4.8%；29

mmol/mol)，中等水平(6.6%；49mmol/mol)，和高等水平(10.0%；86mmol/mol)。

将这三个样本与葡萄糖溶液在37℃下孵育1.5小时，每30分钟测一次糖化血红

蛋白HbA1c和不稳定的HbA1c。不稳定的HbA1c用VariantIIAnalyzer定量分析，

计算不稳定HbA1c浓度的偏差。结果表明，MALDI-TOF质荷比在15000~16000

范围内没有检测到被修饰的血红蛋白。质谱定量值与基准HbA1c值相比，即使

不稳定HbA1c比例高达12.2%，不同持续时间葡萄糖处理样本的HbA1c水平偏

差均在0.2%（3mmol/mol）以内（见表1）。

A.2氨甲酰血红蛋白（cHb）

氨甲酰血红蛋白对于HbA1c的干扰是通过上述4.5.1中三个样本进行评估的。

红细胞与氰酸钾（1mmol/mol），37℃下孵育3小时。HbA1c和cHb每小时测一

次。cHb由VariantIIAnalyzer定量分析，将含有不同cHb浓度的样本的HbA1c

值与基线HbA1c进行比较。经氰酸钾处理后，在质谱图中，即使氨甲酰血红蛋

白高达8.7%，也未对结果产生有统计学意义的影响（见表1）。

A.3胆红素和甘油三酯

用糖化血红蛋白为正常浓度（5.6%，38mmol/mol）和高浓度（8.7%，72

mmol/mol）的两个样本来评估甘油三酯和胆红素的影响。两个样本的红细胞与

不同浓度的甘油三酯和胆红素血浆混合，使甘油三酯和胆红素的终浓度分别为

22.8mmol/L和304.0μmol/L。胆红素和甘油三酯浓度分别达到304.0mol/L和22.8

mmol/L时，未对结果产生有统计学意义的影响（见表1）。

A.4影响β珠蛋白含量计算的特殊变体干扰

除了基于常规β链糖基化对HbA1c进行定量分析外，实验数据还表明，使

用α链糖基化计算的HbA1c值与Ultra2结果之间具有良好的一致性，因此支持使

用α链糖基化来评估HbA1c的水平。最重要的发现是，通过使用α链糖基化可以

完全克服由于β链变体的存在而对HbA1c的测量造成的干扰。类似地，通过使用

β链糖基化可以消除由α链糖基化产生的临床上显著的干扰。显而易见的原因是由

于两者之间存在足够的质量差异，变体β链无法同时影响α链及其糖基化形式，反

之亦然。

当检测样本存在影响β珠蛋白含量计算的特殊变体干扰时，可通过公式（3）

进行。以HBF为例，HbF对于HbA1c定量的干扰评估是通过脐带血与三个样本

进行混合，这三个样本HbA1c的浓度分别为正常水平（5.6%，38mmol/mol），

中等水平（6.7%，50mmol/mol），高水平（9.2%，77mmol/mol）。通过Capillarys3

TERA的测定HbF水平为0.8%~14.2%。HbF存在时，质谱图中出现γ-珠蛋白链

（m/z=15,997.4）峰（见图2）。HbF在低于8.0%时不会显著影响糖化血红蛋白

定量结果。当HbF含量大于约8.0%时，HbA1c值的偏差超过0.2%（2mmol/mol）。

此外，随着HbF百分比的增加，偏差也随之增加（见表1）。此时，糖化比率计

算方式可更换为以下公式：

血红蛋白糖化率计算公式：

……（3）

�𝐺�−α𝐻

�式�中�1：�%=�α×�𝐺�−α𝐻+�α𝐻+�α

A——斜率

B——常数

SGαlc-αHb——糖化α-Hb的峰面积

SααHb——非糖化α-Hb的峰面积

表2.QuanTOF定量分析血红蛋白变体

Population

VariantMassDetectable

Hbvariantfrequency

chaindifference/DabyQuanTOF

inChina

HbHamiltonβchain14Yes0.015%

HbNewYorkβchain30Yes0.143%

HbJ-Bangkokβchain58Yes0.020%

HbSanDiegoβchain32Yes0.005%

HBBc.41C>Tβchain28Yes0.005%

HbBinyangαchain16Yes0.005%

HbPhnomPenhαchain113Yes0.025%

HbQ-Thailandαchain22Yes0.035%

HbG-Coushattaβchain-58Yes0.010%

HbAmsterdamαchain-18Yes0.0049%

HbHekinanαchain-14Yes0.119%

HbRushβchain-1No0.005%

A.5其他常见血红蛋白变体

很多血红蛋白变体并未影响本方法的测试结果。通过样品分析研究了血红蛋

白变异的干扰，这些样本包括HbAS（n=2）,HbAD（n=5）,HbAC（n=3），和

HbAE（n=10）。所有杂合血红蛋白变异均通过Sanger测序确认。用QuanTOF和

硼酸盐亲和高效液相色谱法（Ultra2,TrinityBiotech）测定其变异。用这两种方法

进行比较是因为硼酸盐亲和作用的结果被认为不受血红蛋白变异的影响。随后用

QuanTOF测得的HbA1c值和与Ultra2