3.2.1基因工程的基本操作程序（PCR过程）高二下学期生物人教版选择性必修3

第三章基因工程基因工程的基本操作程序（PCR过程）1.DNA粗提取的原理？①DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精。②DNA在不同NaCl溶液中的溶解度不同，在2mol/LNaCl溶液中溶解度最大。2.DNA鉴定的原理？在沸水浴条件下，DNA与二苯胺试剂反应呈现蓝色。3.实验中向研磨液中加入95%的冷酒精析出DNA，依据的原理是DNA不溶于酒精，而蛋白质等其他物质溶于酒精。4.2mol/LNaCl的目的是溶解DNA5.获取目的基因和切割载体时，通常使用同一种限制酶，目的产生相同的末端，便于连接。6.和只用一种酶切割目的基因的两端及质粒相比，选用两种酶的好处是避免目的基因、质粒自身环化

；避免目的基因与质粒反向连接7.Kanr、Tcr分别为卡那霉素抗性基因、四环素抗性基因。用BamHI、XhoI切割载体，结合图中的重组质粒，从对抗生素的敏感性角度分析，应选择对四环素和卡那霉素都敏感的细胞作为受体细胞，才有利于后续的筛选。8下图和表格：若用Sau3AI切图1质粒，最多可能获得7种大小不同的DNA片段。完全酶切后可以得到含3条带的凝胶电泳图谱第一步：目的基因的筛选与获取

方法之一：PCR扩增。1.PCR（体外）与体内DNA复制：均需DNA聚合酶。DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从引物3’端开始连接脱氧核苷酸。→体内、体外都需要引物。2.若目的基因序列已知则引物序列通常为一对2种。需要一对引物的原因：DNA复制时延伸方向是子链的5’→3’,需一对引物才能将两条母链同时复制。导77页76页导学77页78页78页79页导学思1.目的基因就是编码蛋白质的基因。2.体内DNA复制不需要引物，PCR反应需要引物。3.用PCR扩增DNA时可能存在碱基A与U的配对现象。4.检测艾滋病病毒核酸时可对其直接进行PCR扩增后用于检测。5.目的基因的核苷酸序列都是已知的且目的基因都有自我复制能力。6.在基因工程中，PCR技术可用于任何基因的获取，且能迅速获得大量目的基因。7．作为引物的脱氧核苷酸序列必须不断的加进每一次的扩增当中。8.右图：①耐高温的DNA聚合酶是在B过程发挥作用的。②B过程需要一对互补的引物。9.图1：PCR中加入dNTP后，不再单独添加ATP等能源物质，据图:推测原因

。10.【判断】体内DNA复制需要能量，PCR反应也需要能量11.【判断】PCR延伸中需要DNA聚合酶、ATP和4种核糖核苷酸。（课本P83）12.【图2】若在PCR反应缓冲溶液中加入4种dNTP（N可表示A、G、C、T）时，误加入了单一种类的ddNTP，则子链会停止延伸，原因是3号碳上不是，不能与的磷酸形成磷酸二酯键。图1图2议自由展5’端5’端1.目的基因就是编码蛋白质的基因。

错

P76主要2.体内DNA复制不需要引物，PCR反应需要引物。错

两者均需要3.用PCR扩增DNA时可能存在碱基A与U的配对现象。√T6（3）引物的化学本质是一段（DNA或RNA）序列

4.检测艾滋病病毒核酸时可对其直接进行PCR扩增后用于检测。×

艾滋病病毒是RNA病毒→逆转录成DNA后PCR5.目的基因的核苷酸序列都是已知的且目的基因都有自我复制能力。错

不一定已知

不能自我复制6.在基因工程中，PCR技术可用于任何基因的获取，且能迅速获得大量目的基因。

错

PCR的前提条件是：已知一段目的基因的核苷酸序列7．作为引物的脱氧核苷酸序列必须不断的加进每一次的扩增当中。对8.右图：①耐高温的DNA聚合酶是在B过程发挥作用的。错B指复性；C指延伸，需要耐高温的DNA聚合酶参与。②B过程需要一对互补的引物。错，因为不能互补。展19.图1：PCR中加入dNTP后，不再单独添加ATP等能源物质，据图推测原因:

dNTP转变为脱氧核苷酸过程中,脱去磷酸基团，释放特殊化学键中的能量。10.【判断】体内DNA复制需要能量，PCR反应也需要能量。对11.【判断】PCR延伸中需要DNA聚合酶、ATP和4种核糖核苷酸。（课本P83）

错

不需要ATP提供能量，4种脱氧核苷酸12.【图2】若在PCR反应缓冲溶液中加入4种dNTP时，误加入了单一种类的ddNTP，则子链会停止延伸，原因是3号碳上不是羟基，不能与下一个脱氧核苷酸的磷酸形成磷酸二酯键。图1图213.（1）PCR中子链延伸方向:5’→3’;（2)单体连接在引物的

3’端。(3)为便于运载体和目的基因连接，在引物

5’端添加特定的限制酶切割位点。(4)PCR需要引物的原因是①DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从引物3’端开始连接脱氧核苷酸.需要一对引物的原因是②DNA复制时子链延伸方向是5’→3’，需一对引物才能将两条母链同时复制.5’端5’端展21.原理：DNA半保留复制。用PCR不能直接扩增mRNA，需要将它逆转录成cDNA再进行扩增（即RT-PCR

).②该技术涉及的酶：逆转录酶、耐高温的DNA聚合酶。③RT-PCR技术对某些微量RNA病毒的检测，可提高检测的灵敏度，原因是：增加了待测RNA逆转录产生的DNA的数量，便于检测。评1一、PCR【拓】1.PCR前提条件：已知目的基因一段特有核苷酸序列（≠全部序列）目的合成引物。2.PCR能成功的关键在于复性温度的设定。复性温度与引物的长短、碱基组成有关。①引物中CG含量越高，复性温度越高。②复性温度过低，会造成引物与模板结合位点增多，非特异性产物增多③复性温度过高，会破坏引物与模板链的碱基配对，DNA扩增效率下降。④如果PCR反应得不到任何扩增产物（即引物不能与模板链结合），则原因是：①退火温度高

②引物设计不合理。HOW改进？3.a.变性温度b.退火温度c.延伸温度

d.变性时间e.退火时间f.延伸时间。上述选项中_________的设定与引物有关，_________的设定与扩增片段的长度有关。bf相同点先解旋后复制边解旋边复制二、体内DNA复制与PCR比较PCR过程中无冈崎片段形成的原因是：PCR是先解旋后复制。评21.PCR的全称是多聚酶链式反应，原理是DNA半保留复制_。是否可以扩增mRNA?否

原因：

PCR扩增必须以DNA为模板。PCR通过控制温度使DNA在体外反复进行。2.PCR的条件？模板DNA、dNTP、耐高温的DNA聚合酶、引物3.dNTP的作用？提供合成DNA的原料；提供能量。Mg2+作用:激活DNA聚合酶的活性4.PCR过程:变性、复性、延伸.8.变性温度:90℃以上;目的:使目的基因的双链解聚成单链.复性的温度：50℃左右；目的使两种引物与两条单链DNA结合。延伸的温度：72℃左右；目的：dNTP在耐高温的DNA聚合酶的作用下根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。5.引物的化学本质是一段单链DNA或RNA序列，作用是：使DNA聚合酶从引物（3'）端连接单个脱氧核糖核苷酸。引物长度是？20-30个核苷酸6.PCR中子链延伸方向:5’→3’；单体连接在引物的

3’