2024年高中生物新教材同步选择性必修第三册 第3章 第1节 重组DNA技术的基本工具含答案

2024年高中生物新教材同步选择性必修第三册第3章第1节重组DNA技术的基本工具第1节重组DNA技术的基本工具[学习目标]阐明重组DNA技术所需的三种基本工具及其作用。一、基因工程的概念和工具酶1．基因工程：指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。2．基因工程的工具酶(1)限制性内切核酸酶(限制酶)——“分子手术刀”来源主要来自原核生物种类数千种作用识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开结果产生黏性末端或平末端(2)DNA连接酶——“分子缝合针”①作用：将两个DNA片段连接起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。②种类种类来源特点E.coliDNA连接酶大肠杆菌只能将具有互补黏性末端的DNA片段连接起来，不能连接具有平末端的DNA片段T4DNA连接酶T4噬菌体既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端，又可以“缝合”双链DNA片段的平末端，但连接平末端的效率相对较低判断正误(1)基因工程可以实现遗传物质在不同物种间的转移，人们可以定向选育新品种()(2)限制性内切核酸酶均能特异性地识别6个核苷酸序列()(3)DNA连接酶能将两碱基通过氢键连接起来()(4)限制酶和解旋酶的作用部位相同()答案(1)√(2)×(3)×(4)×解析(2)大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。(3)DNA连接酶能将两个DNA片段连接起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。(4)限制酶和解旋酶的作用部位不同，限制酶作用于磷酸二酯键，解旋酶作用于氢键。任务一：基因工程的理论基础1．基因工程操作导致的基因重组与有性生殖中的基因重组的主要区别是什么？提示有性生殖中的基因重组是随机的，并且只能在同一物种间进行重组；基因工程可以实现遗传物质在不同物种间进行重组，并且方向性强，可以定向地改变生物的性状。2．为什么不同生物的DNA分子能拼接起来？提示(1)DNA的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸。(2)双链DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构。3．为什么一种生物的基因可以在另一种生物细胞内表达？提示(1)基因是控制生物性状的独立遗传单位。(2)遗传信息的传递都遵循中心法则。(3)生物界共用一套遗传密码。任务二：限制性内切核酸酶(限制酶)1．请结合限制酶的作用特点，回答以下问题：(1)限制酶能切开RNA分子的磷酸二酯键吗？提示不能。(2)请结合图示，推断限制酶切割一次可断开几个磷酸二酯键？产生多少游离的磷酸基团？产生几个黏性末端？消耗几分子水？提示断开2个磷酸二酯键；产生2个游离的磷酸基团；产生2个黏性末端；消耗2分子水。2．推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么？提示限制酶是原核生物的一种防御工具，用来切割侵入细胞的外源DNA，以保证自身安全。3．为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子？提示含某种限制酶的细菌的DNA分子不具备这种限制酶的识别序列，或者甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。4．有2个不同来源的DNA片段A和B，A片段用限制酶SpeⅠ进行切割，B片段分别用限制酶HindⅢ、XbaⅠ、EcoRⅤ和XhoⅠ进行切割。各限制酶的识别序列和切割位点如图。(1)请写出限制酶SpeⅠ、HindⅢ、XbaⅠ和XhoⅠ切割形成的黏性末端。提示SpeⅠ：HindⅢ：XbaⅠ：XhoⅠ：(2)提示同种限制酶产生的黏性末端相同；不同的限制酶切割可能会形成相同的黏性末端。(3)哪种限制酶切割B片段产生的DNA片段能与限制酶SpeⅠ切割A片段产生的DNA片段相提示限制酶XbaⅠ；因为XbaⅠ与SpeⅠ切割产生了相同的黏性末端。不能再被所用的限制酶识别；因为所用的两种限制酶均不能识别该重组DNA分子的新连接处的脱氧核苷酸序列。与DNA相关的几种酶的比较项目DNA连接酶限制酶DNA聚合酶解旋酶作用部位磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键氢键作用对象DNA片段DNA单个的脱氧核苷酸DNA作用结果将两个DNA片段连接成完整的DNA分子切割DNA分子将单个的脱氧核苷酸连接到DNA单链末端将双链DNA分子局部解旋为单链拓展延伸1．回文序列限制酶特异性识别和切割的部位具有回文序列，即在切割部位，一条链正向读的碱基顺序，与另一条链反向读的顺序完全一致。例如：EcoRⅠ限制酶识别的DNA序列为eq\o(=,\s\up7(GAATTC),\s\do5(CTTAAG))，为回文序列。2．同尾酶识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶被称为同尾酶。同尾酶构建载体时，切割位点的选择范围扩大。例如，我们选择了用某种限制酶切割载体，如果目的基因的核苷酸序列中恰好有该限制酶的识别序列，那么用该限制酶切割含有目的基因的DNA片段时，目的基因就很可能被切断；这时可以考虑用合适的同尾酶(目的基因的核苷酸序列中不能有它的识别序列)来获取目的基因。1．以下是几种不同限制酶切割DNA分子后形成的部分片段。下列叙述正确的是()A．以上DNA片段是由4种限制酶切割后产生的B．②片段是在识别序列为eq\a\vs4\al\co1(GAATT,CTTAA)的限制酶作用下形成的C．①和④两个片段在DNA聚合酶的作用下可形成重组DNA分子D．限制酶和DNA连接酶作用的部位都是磷酸二酯键答案D解析图中①④是同一种限制酶切割形成的，因此以上DNA片段是由3种限制酶切割后产生的，A错误；②片段是在识别序列为的限制酶作用下形成的，B错误；①④连接形成重组DNA分子需要的是DNA连接酶，C错误。2．DNA连接酶是基因工程的必需工具。下列有关DNA连接酶的叙述，错误的是()A．DNA连接酶可以将任意的两个DNA片段连接成一个重组DNA分子B．DNA连接酶发挥作用时不需要识别特定的脱氧核苷酸序列C．DNA连接酶可以催化两个脱氧核苷酸之间磷酸二酯键的形成D．有些DNA连接酶既能连接黏性末端，又能连接平末端答案A解析DNA连接酶可以连接平末端或互补配对的黏性末端，而非任意的两个DNA片段，A错误。二、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”1．种类：质粒、噬菌体、动植物病毒等。2．常用载体——质粒(1)本质：质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。(2)质粒作为载体所具备的条件及原因条件原因稳定存在并能自我复制或整合到受体DNA上能使目的基因稳定存在且数量可扩增有一个至多个限制酶切割位点可携带多个或多种外源基因具有特殊的标记基因便于重组DNA分子的筛选无毒害作用(3)作用①作为运输工具，将外源基因导入细胞。②质粒携带外源DNA片段在细胞内大量复制或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。判断正误(1)作为载体的质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因()(2)质粒是环状双链DNA分子，是基因工程常用的载体()(3)载体(如质粒)和细胞膜中的载体蛋白的成分相同()(4)DNA重组技术所需要的工具酶有限制酶、DNA连接酶和载体()答案(1)×(2)√(3)×(4)×解析(1)作为载体的质粒通常采用抗生素抗性基因作为筛选标记基因。(3)载体(如质粒)的成分是DNA，细胞膜中的载体的成分是蛋白质。(4)DNA重组技术所需要的工具酶有限制酶、DNA连接酶，载体不属于工具酶。任务三：载体需具备的条件和载体的选择1．载体要与外源DNA片段连接，需要具备什么条件？提示具有一个或多个限制酶切割位点，供外源DNA片段插入其中。2．要使携带的外源DNA片段在受体细胞中稳定存在，载体需要具备什么条件？提示能在受体细胞中自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制，这样它携带的外源DNA片段才能在受体细胞中复制，不至于丢失。3．我们用肉眼看不到载体是否进入受体细胞，为了便于筛选重组DNA分子，载体需要具备什么条件？提示具有标记基因，便于重组DNA分子的筛选。4．根据标记基因的作用，有同学认为在含有某种抗生素的培养基中筛选存活的受体细胞不一定是导入目的基因的受体细胞，这种说法是否合理？并说明理由。提示合理；因为仅导入载体的和导入目的基因的受体细胞均能在该培养基中存活。5．若用家蚕作为某基因表达载体的受体细胞，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用噬菌体作为载体，其原因是什么？提示噬菌体的宿主细胞是细菌，而不是家蚕。标记基因的筛选原理载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上，能够生存的是被导入了载体的受体细胞。如图所示：3．(2023·贵州安顺高二联考)质粒是基因工程中最常用的目的基因运载工具。下列有关叙述正确的是()A．质粒是只存在于细菌细胞质中能自我复制的小型环状双链DNA分子B．在所有的质粒上总能找到一个或多个限制酶切割位点C．携带目的基因的重组质粒只有整合到受体细胞的染色体DNA上才会随后者的复制而复制D．质粒上的抗性基因常作为标记基因供重组DNA的筛选答案D解析质粒不只分布于原核生物中，在真核生物如酵母菌细胞内也有分布，A错误；并不是所有的质粒上都能找到限制酶的切割位点而成为适合运载目的基因的工具，B错误；重组质粒进入受体细胞后，可以在细胞内自我复制，或整合到受体染色体DNA上后复制，C错误。4.某细菌质粒上有标记基因如图所示，通过标记基因可以推知外源基因(目的基因)是否转入成功。外源基因插入的位置不同，细菌在培养基上的生长情况也不同，如图所示是外源基因插入位置(插入点有a、b、c)示意图。请根据表中提供的细菌生长情况，推测①②③三种重组后细菌的外源基因插入点，正确的一组是()插入点细菌在含四环素的培养基上的生长状况①能生长能生长②能生长不能生长③不能生长能生长A.①是c；②是b；③是aB．①是a和b；②是a；③是bC．①是a和b；②是b；③是aD．①是c；②是a；③是b答案A题组一基因工程的概念和工具酶1．玉米的PEPC酶固定CO2的能力较水稻的强60倍。我国科学家正致力于将玉米的PEPC基因导入水稻中，以提高水稻产量。下列有关该应用技术的叙述，不正确的是()A．该技术是在DNA水平上进行设计和施工的B．该技术的操作环境是生物体内C．该技术的原理是基因重组D．该技术的优点是定向产生人类需要的生物类型答案B解析由题意可知，该技术为基因工程，是在生物体外进行的操作。2．科学家把兔子血红蛋白基因导入大肠杆菌细胞中，在大肠杆菌细胞中合成了兔子的血红蛋白。下列关于这一先进技术的理论依据，不正确的是()A．所有生物共用一套遗传密码B．基因能控制蛋白质的合成C．兔子血红蛋白基因与大肠杆菌的DNA都是由四种脱氧核苷酸构成，都遵循相同的碱基互补配对原则D．兔子与大肠杆菌有共同的原始祖先答案D解析题干表述的是目的基因导入受体细胞并得以表达的过程，目的基因在不同生物细胞中能够表达出相同的蛋白质，说明控制其合成的mRNA上的密码子是共用的，相同的密码子决定相同的氨基酸，A正确；基因通过转录获得mRNA，进而控制蛋白质的合成，B正确；基因通常是有遗传效应的DNA片段，只要是双链DNA都遵循碱基互补配对原则，其组成原料都是四种脱氧核苷酸，C正确；生物之间是否有共同的原始祖先与转基因技术之间没有必然关系，D错误。3．据图所示，有关工具酶功能的叙述不正确的是()A．限制性内切核酸酶可以切断a处B．DNA聚合酶可以连接a处C．解旋酶可以使b处解开D．DNA连接酶可以连接c处答案D解析限制酶可以切断脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键，即a处，A正确；DNA聚合酶可以连接脱氧核苷酸形成磷酸二酯键，即a处，B正确；解旋酶可以使氢键断裂，即b处，C正确；DNA连接酶可以连接DNA片段形成磷酸二酯键，即a处，D错误。4．限制酶和DNA连接酶是基因工程的工具酶，下列有关说法正确的是()A．DNA连接酶能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段上形成磷酸二酯键B．限制酶只能切割双链DNA片段，不能切割烟草花叶病毒的核酸C．E.coliDNA连接酶既能连接黏性末端，也能连接平末端D．限制酶主要从原核生物中分离纯化而来，所以也能剪切自身的DNA答案B解析DNA连接酶连接的是两个DNA片段，A错误；限制酶只能切割DNA分子，烟草花叶病毒的核酸是RNA，不能切割，B正确；E.coliDNA连接酶只能连接黏性末端，不能连接平末端，C错误；限制酶主要从原核生物中分离纯化而来，但是不会剪切自身的DNA，D错误。5．限制酶是一种核酸切割酶，可辨识并切割DNA分子上特定的脱氧核苷酸序列。如图所示为四种限制酶BamHⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ以及BglⅡ的识别序列，箭头表示每一种限制酶的特定切割位点，切割出来的DNA片段末端可以互补黏合的是(限制酶)，其正确的末端互补序列应该为()A．BamHⅠ和EcoRⅠ；末端互补序列为AATT—B．BamHⅠ和HindⅢ；末端互补序列为GATC—C．EcoRⅠ和HindⅢ；末端互补序列为AATT—D．BamHⅠ和BglⅡ；末端互补序列为GATC—答案D6．(2023·江苏南京高二期中)下列关于如图所示黏性末端的说法，错误的是()A．DNA连接酶能催化磷酸基团和脱氧核糖之间形成化学键B．甲、乙黏性末端是由不同的限制酶切割而成的C．切割甲的限制酶也能识别由甲、乙片段形成的重组DNA分子D．甲、乙黏性末端可形成重组DNA分子答案C解析切割甲的限制酶的识别序列是－GAATTC－，切割乙的限制酶的识别序列是－CAATTG－，所以甲、乙黏性末端是由不同的限制酶切割而成的，B正确；甲、乙片段形成的重组DNA分子的序列是－CAATTC－，而切割甲的限制酶的识别序列是－GAATTC－，所以该限制酶不能识别由甲、乙片段形成的重组DNA分子，C错误。题组二“分子运输车”——载体7．质粒是基因工程中常用的载体。下列有关质粒的说法，正确的是()A．质粒上的基因表达不遵循中心法则，所以可用作外源DNA分子的载体B．具有某些标记基因，以便为目的基因的表达提供条件C．质粒上的抗生素合成基因可作为标记基因D．作为外源DNA分子的载体，质粒需具有限制酶能够切割的位点答案D解析质粒上的基因表达遵循中心法则，A错误；标记基因是用于重组质粒的筛选和鉴定，与目的基因的表达无关，B错误；质粒上的抗生素抗性基因可作为标记基因，用于重组质粒的筛选和鉴定，C错误。8．(2023·河北秦皇岛高二期末)下列有关基因工程中载体的说法，正确的是()A．基因工程中使用的载体只有质粒B．质粒是细胞质中能够自我复制的环状DNA分子C．噬菌体可以作为动物基因工程的载体D．天然质粒均可以直接作为载体将目的基因送入受体细胞答案B解析基因工程中常用的载体是质粒，此外还有噬菌体、动植物病毒等，A错误；噬菌体是专门寄生在细菌体内的病毒，不可以作为动物基因工程的载体，C错误；天然质粒往往不能直接作为载体，要根据不同的目的和需求进行人工改造，D错误。9．如表列举了几种限制酶的识别序列及其切割位点(箭头表示相关酶的切割位点)。如图是酶切后产生的几种末端。下列有关说法正确的是()A．BamHⅠ切割的是氢键，AluⅠ切割的是磷酸二酯键B．C．DNA连接酶能连接②⑤，不能连接②④D．E.coliDNA连接酶和T4DNA连接酶都能连接①③，且连接效率低答案B解析BamHⅠ与AluⅠ切割的均是磷酸二酯键，A错误；BamHⅠ切割，Sau3AⅠ切割，故二者切割后产生的黏性末端是相同的，因此二者切割后产生的黏性末端能够相连，连接后能被Sau3AⅠ切割，B正确；②⑤的黏性末端相同，②④的黏性末端也相同，因此DNA连接酶能连接②⑤，也能连接②④，C错误；E.coliDNA连接酶是从大肠杆菌中获得的DNA连接酶，只能连接黏性末端，T4DNA连接酶既可以连接黏性末端也可以连接平末端，而图中①③属于平末端，只能用T4DNA连接酶连接，D错误。10．某线性DNA分子含有5000个碱基对(bp)，先用限制酶a切割，再把得到的产物用限制酶b切割，得到的DNA片段大小如表。限制酶a和b的识别序列和切割位点如图所示。下列有关叙述不正确的是()a酶切割产物(bp)b酶再次切割产物(bp)2100；1400；1000；5001900；200；800；600；1000；500A.a酶与b酶切断的化学键相同B．a酶与b酶切出的黏性末端能相互连接C．a酶与b酶切割该DNA分子位点分别有3个和5个D．限制酶将一个DNA分子片段切成两个片段需消耗两个水分子答案C解析限制酶作用的化学键都是磷酸二酯键，A正确；由图可以看出a酶和b酶切割后产生的黏性末端相同，它们之间能相互连接，B正确；由表格中可以看出，a酶可以把原有DNA切成4段，说明该DNA分子上有3个切口，即a酶的切割位点有3个；b酶把大小是2100bp的DNA切成大小分别为1900bp和200bp两个片段，再把大小是1400bp的DNA切成大小分别为800bp和600bp两个片段，说明b酶在该DNA分子上有2个切口，即b酶的切割位点有2个，C错误。11．下列有关限制性内切核酸酶的叙述，正确的是()A．用限制酶酶切获得一个外源基因时得到两个切口，有2个磷酸二酯键被断开B．限制酶识别序列越短，则该序列在DNA中出现的概率就越大C．—CATG↓—和—G↓GATCC—序列被限制酶切出的黏性末端可用DNA连接酶连接D．只有用相同的限制酶处理含目的基因的片段和质粒，才能形成重组质粒答案B解析用限制酶酶切获得一个外源基因时，得到两个切口，有4个磷酸二酯键被断开，A错误；—CATG↓—和—G↓GATCC—序列被限制酶切出的黏性末端不同，分别为—CATG和—CTAG，因此不能用DNA连接酶连接，C错误；用不同的限制酶处理含目的基因的DNA片段和质粒，若产生的黏性末端相同，则也能形成重组质粒，D错误。12．(2023·福建泉州高二期末)如表为常用的限制性内切核酸酶(限制酶)及其识别序列和切割位点，由此推断以下说法，正确的是()限制酶名称识别序列和切割位点限制酶名称识别序列和切割位点BamHⅠKpnⅠEcoRⅠSau3AⅠHindⅡSmaⅠ注：Y＝C或T，R＝A或G。A．限制酶SmaⅠ切割后形成的末端可用E.coliDNA连接酶连接B．Sau3AⅠ限制酶的切割位点在识别序列的外部C．BamHⅠ和Sau3AⅠ两种限制酶切割后形成不同的黏性末端D．一种限制酶一定只能识别一种核苷酸序列答案B解析限制酶SmaⅠ的切割位点在中轴线上，切割后形成平末端，E.coliDNA连接酶只能连接黏性末端，A错误；一种限制酶只能识别特定的脱氧核苷酸序列，并在特定位点切割DNA分子，并非只能识别一种核苷酸序列，如表格中限制酶HindⅡ识别的核苷酸序列不止一种，D错误。13．根据基因工程的有关知识，回答下列问题：(1)限制酶切割DNA分子后产生的DNA片段，其末端类型通常有和。(2)质粒载体用限制酶X(识别的序列由6个核苷酸组成)切割后产生的片段如下：eq\b\lc\\rc\(\a\vs4\al\co1(AATTC……G,G……CTTAA))该酶识别的序列为，切割的部位是。(3)为使切割后的载体与目的基因相连，含有目的基因的DNA除可用限制酶X切割外，还可用限制酶Y切割，两种酶共同的特点是。(4)按其来源不同，基因工程中所使用的DNA连接酶有两类，即DNA连接酶和DNA连接酶，其中后者只能连接一种末端。(5)基因工程中除质粒外，和也可作为载体。答案(1)黏性末端平末端(2)eq\b\lc\\rc\(\a\vs4\al\co1(—GAATTC—,—CTTAAG—))G和A之间的磷酸二酯键(3)两种限制酶切割后形成的黏性末端相同(4)T4E.coli(5)噬菌体动植物病毒解析(2)将图中片段两端的黏性末端对接后可以看出限制酶X识别的序列为6个核苷酸组成的—GAATTC—，互补链是—CTTAAG—，切割的位点为G和A之间的磷酸二酯键。(3)质粒载体可以用限制酶X切割，也可以用另一种限制酶Y切割，说明限制酶Y与限制酶X切割产生的黏性末端相同。(4)基因工程使用的DNA连接酶，按来源可分为E.coliDNA连接酶和T4DNA连接酶，其中只能连接黏性末端的是E.coliDNA连接酶。14．(2021·全国乙，38节选)用DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中要使用多种工具酶，其中4种限制性内切核酸酶的切割位点如图所示。回答下列问题：(1)常用的DNA连接酶有E.coliDNA连接酶和T4DNA连接酶，题图中酶切割后的DNA片段可以用E.coliDNA连接酶连接，题图中切割后的DNA片段可以用T4DNA连接酶连接。(2)DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是。(3)DNA重组技术中所用的质粒载体具有一些特征，如质粒DNA分子上有复制原点，可以保证质粒在受体细胞中；质粒DNA分子上有，便于外源DNA的插入；质粒DNA分子上有标记基因(如某种抗生素抗性基因)，利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞，方法是。答案(1)EcoRⅠ、PstⅠEcoRⅠ、PstⅠ、SmaⅠ和EcoRⅤ(2)磷酸二酯键(3)自我复制一至多个限制酶的切割位点用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞解析(1)限制酶EcoRⅠ和PstⅠ切割形成的是黏性末端，限制酶SmaⅠ和EcoRⅤ切割形成的是平末端，E.coliDNA连接酶来源于大肠杆菌，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来，而T4DNA连接酶来源于T4噬菌体，可用于连接黏性末端和平末端，但连接效率较低。因此图中EcoRⅠ和PstⅠ切割后的DNA片段(黏性末端)可以用E.coliDNA连接酶连接，除了这两种限制酶切割的DNA片段，限制酶SmaⅠ和EcoRⅤ切割后的DNA片段(平末端)也可以用T4DNA连接酶连接。(2)DNA连接酶将两个DNA片段连接形成磷酸二酯键。(3)质粒是小型环状的DNA分子，常作为基因表达的载体，首先质粒上含有复制原点，能保证质粒在受体细胞中自我复制。质粒DNA分子上有一个至多个限制酶的切割位点，便于目的基因的插入。质粒上的标记基因是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，具体做法是用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞。第2节基因工程的基本操作程序第1课时目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建[学习目标]1.简述PCR的原理、条件及过程。2.简述基因表达载体的组成及构建过程。一、目的基因的筛选与获取1．培育转基因抗虫棉的四个步骤(1)目的基因的筛选与获取。(2)基因表达载体的构建。(3)将目的基因导入受体细胞。(4)目的基因的检测与鉴定。2．目的基因(1)概念：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因就是目的基因。(2)作用：根据不同的需要，目的基因是不同的，它主要是指编码蛋白质的基因。(3)类型：与生物抗逆性、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因，如培育转基因抗虫棉用到的Bt抗虫蛋白基因，即Bt基因。3．筛选合适的目的基因：从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。4．获取目的基因的方法(1)人工合成目的基因。(2)常用PCR特异性地快速扩增目的基因。(3)通过构建基因文库来获取目的基因。5．利用PCR获取和扩增目的基因(1)含义：PCR是聚合酶链式反应的缩写。它是一项在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。(2)原理：DNA半保留复制。(3)基本条件①场所：在一定的缓冲液中进行，其中一般要添加Mg2＋。②模板：DNA母链。③原料：4种脱氧核苷酸。④酶：耐高温的DNA聚合酶。⑤引物：使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。(4)过程①变性：当温度超过90℃时，双链DNA解聚为单链。②复性：当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。③延伸：当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。(5)上一轮循环的产物可以作为下一个循环的模板，因而每一次循环后目的基因的量可以增加一倍，即成指数形式扩增(约为2n，其中n为扩增循环的次数)。(6)鉴定：常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物。判断正误(1)PCR反应中温度的周期性改变是为了DNA聚合酶催化不同的反应()(2)PCR扩增技术中，需用解旋酶使双链DNA解聚()(3)PCR过程使用的DNA聚合酶的特点是耐高温()(4)PCR技术中，DNA模板链上碱基G和C的比例越高，DNA变性解链的温度就越高()答案(1)×(2)×(3)√(4)√解析(1)PCR反应中温度的周期性改变是为了变性、复性、延伸，DNA聚合酶催化子链的延伸。(2)PCR扩增技术中，高温使双链DNA解聚。任务一：PCR扩增技术图1、图2分别是PCR扩增技术相关过程，请思考回答下列问题：1．PCR扩增的是完整的模板DNA分子吗？并说明理由。提示不是；PCR扩增的仅仅是两种引物之间所对应的特定DNA片段。2．图1所示利用PCR技术扩增目的基因，在第几轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段？比例是多少？提示第3轮；1/4。3．如果已知某目的基因的序列和结构，利用PCR筛选和扩增出该目的基因的关键是什么？提示根据目的基因两端的核苷酸序列设计引物。4．图2是某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理，请分别说明理由。提示第1组：引物Ⅰ和引物Ⅱ会因局部发生碱基互补配对而失效。第2组：引物Ⅰ′自身折叠后会因出现局部碱基互补配对而失效。5．要保证目的基因能与载体相连接，还要对引物进行什么操作？提示要在两种引物的5′端分别添加上限制酶的识别序列。6．如果循环n次，则共需消耗多少对引物？提示共需消耗2n－1对引物。PCR中的数量关系复制次数123nDNA分子数2482n含引物的DNA分子数2482n含其中一种引物的DNA分子数1＝21－13＝22－17＝23－12n－1同时含两种引物的DNA分子数0＝21－22＝22－26＝23－22n－2共消耗引物的对数1＝21－13＝22－17＝23－12n－1含脱氧核苷酸链等长的DNA分子数0＝21－20＝22－42＝23－62n－2n1．(2023·山西太原高二诊断)下列有关获取目的基因的叙述，错误的是()A．目的基因就是编码蛋白质的基因B．获取目的基因是基因工程的第一步C．来自苏云金杆菌的Bt抗虫蛋白基因可作为转基因抗虫棉的目的基因D．序列比对工具的应用为科学家找到合适的目的基因提供了更多的机会答案A解析目的基因主要是指编码蛋白质的基因，也可以是一些具有调控作用的因子，A错误。2．如图表示利用PCR技术扩增目的基因的部分过程，其原理与细胞内DNA复制类似。下列有关叙述错误的是()A．耐高温的DNA聚合酶总将游离的脱氧核苷酸连接到3′端B．在第三轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段C．引物之间或引物自身发生碱基互补配对，则不能有效扩增目的基因D．从理论上推测，第三轮循环产物中含有引物A的DNA片段占3/4答案D解析由题图可知，以原来的每条母链为模板经第一轮合成的两个DNA分子中，只含有引物A或引物B，而以新合成的子链为模板合成新DNA分子时，两种引物都含有，故第三轮循环共产生8个DNA分子，其中含有引物A的分子是7个，即占7/8，D错误。二、基因表达载体的构建1．基因表达载体构建的目的让目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。2．基因表达载体的组成3．基因表达载体的构建过程(1)首先用一定的限制酶切割载体。(2)然后用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。(3)再利用DNA连接酶将含目的基因的DNA片段拼接到载体的切口处(如图所示)。判断正误(1)基因工程操作程序的核心步骤是目的基因的获取()(2)基因表达载体中有的含有启动子和终止密码子()(3)标记基因不一定是抗生素抗性基因()答案(1)×(2)×(3)√解析(1)基因工程操作程序的核心步骤是基因表达载体的构建。(2)基因表达载体中有的含有启动子和终止子，终止密码子位于mRNA上。任务二：分析基因表达载体构建的目的和方法1．获取Bt基因后不能直接将它导入受体细胞，是因为游离的DNA进入受体细胞，一般会直接被分解，即使可以转录翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着细胞分裂而进行复制，导致子代细胞中不再含有目的基因。因此，获取Bt基因后，还需要借助载体将其导入棉花细胞，才能使棉花植株获得抗虫特性。2．构建基因表达载体时目的基因插入的位置应该在哪里？为什么？提示启动子下游和终止子上游；因为只有插入在启动子和终止子之间，目的基因才可以正常表达。3．请结合图示，回答下列问题：(1)构建基因表达载体时，能否用SmaⅠ酶切割质粒？为什么？提示不能；因为SmaⅠ会破坏质粒的抗生素抗性基因。该基因是标记基因，便于重组DNA分子的筛选，若被破坏，无法进一步筛选。(2)与只使用EcoRⅠ相比较，使用BamHⅠ和HindⅢ两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点是什么？提示可以防止质粒和目的基因的自身环化以及目的基因与载体的反向连接。1．区分启动子和终止子与起始密码子和终止密码子启动子和终止子位于DNA上，是基因表达载体必需的部分，而起始密码子和终止密码子位于mRNA上，决定翻译的开始和结束。2．图解限制酶的选择原则(1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。(2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。(3)确保出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶切割质粒，如图中PstⅠ；为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图也可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶。拓展延伸真、原核细胞基因的结构和表达(1)基因的结构(2)基因表达遗传信息①原核生物基因②真核生物基因3．下列关于基因表达载体构建的叙述，错误的是()A．启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，组成它的基本单位是脱氧核苷酸B．基因表达载体的组成包括目的基因、启动子、终止密码子、标记基因等组件C．人工构建的诱导型启动子，当诱导物存在时，可激活或抑制目的基因的表达D．由于受体细胞不同，基因表达载体的构建也有所差别答案B解析启动子在基因的上游，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，组成它的基本单位是脱氧核苷酸，A正确；基因表达载体的组成包括目的基因、启动子、终止子、标记基因等，B错误；由于受体细胞有植物、动物以及微生物之分，以及目的基因导入受体细胞的方法不同，因此基因表达载体的构建是不完全相同的，D正确。4．(2023·江苏苏州高二期末)某科研小组利用质粒(图甲)和目的基因(图乙)构建重组DNA。下列分析不正确的是()A．用限制酶HindⅢ和PstⅠ切割质粒，可得到2条DNA片段B．不能用AluⅠ酶切割质粒和外源DNA的原因是AluⅠ酶会破坏目的基因C．构建重组DNA时，需选择SmaⅠ酶和PstⅠ酶同时切割质粒和外源DNAD．导入了重组DNA的细菌能在含四环素的培养基上生长而不能在含氯霉素的培养基上生长答案C解析限制酶HindⅢ和PstⅠ在质粒上各有一个识别切割位点，用HindⅢ和PstⅠ切割质粒，可得到2条DNA片段，A正确；AluⅠ的切割位点位于目的基因中，用AluⅠ酶切割外源DNA会破坏目的基因，B正确；不宜选择SmaⅠ酶和PstⅠ酶同时切割质粒和外源DNA，因为质粒中的两个标记基因均会被破坏，且DNA会反向连接至载体上，C错误；构建重组DNA时，选择限制酶HindⅢ和PstⅠ同时切割质粒和外源DNA，会破坏质粒中的氯霉素抗性基因，保留四环素抗性基因，所以导入了重组DNA的细菌能在含四环素的培养基上生长而不能在含氯霉素的培养基上生长，D正确。题组一目的基因的筛选与获取1．(2023·陕西西安高二调研)基因工程操作“四步曲”的正确顺序是()①目的基因的筛选与获取②将目的基因导入受体细胞③基因表达载体的构建④目的基因的检测与鉴定A．①②③④ B．④①③②C．①③②④ D．③①②④答案C2．下列关于PCR技术的叙述，正确的是()A．PCR技术建立在对扩增的目的基因序列完全已知的基础上B．该技术需要解旋酶和耐高温的DNA聚合酶C．该技术需要一对特异性的引物，要求一对引物的序列是互补的D．该技术应用DNA半保留复制原理，也需要模板、原料、能量、酶等条件答案D解析PCR技术扩增的目的基因序列不一定完全是已知的，A错误；该技术是通过高温来使DNA解旋的，不需要解旋酶，B错误；该技术需要的一对引物，分别能与模板DNA的两条链进行碱基互补配对，其序列不是互补的，C错误。3．用PCR扩增下面的DNA片段：5′GACCTGTGGAAGC……CATACGGGATTG3′3′CTGGACACCTTCG……GTATGCCCTAAC5′供选择的引物有：①5′GACCTGTGGAAGC3′②5′CATACGGGATTG3′③5′GTATGCCCTAAC3′④5′CAATCCCGTATG3′共四种，应选择()A．①②B．②③C．③④D．①④答案D解析用PCR扩增DNA片段的过程中，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3′端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5′端至3′端延伸的，故引物的碱基序列应与每条模板链5′端的一段核苷酸链的碱基序列相同，即应以模板链5′端的一段脱氧核苷酸单链片段作为引物；由题干信息分析可知，5′端的碱基序列是5′GACCTGTGGAAGC和5′CAATCCCGTATG，故对应的引物为①④，D正确。4．(2023·河北邢台高二月考)用PCR技术特异性地拷贝“X基因”，经四轮循环后产物中有五种不同的DNA分子。下列有关叙述错误的是()A．第一轮循环得到2个DNA分子，即①②各一个B．第二轮循环得到4个DNA分子，即①②③④各一个C．第三轮循环得到8个DNA分子，其中有2个是等长的，也就是有2个⑤D．第四轮循环得到16个DNA分子，其中有4个⑤答案D解析第四轮循环得到的16个DNA分子中，两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段有24－2×4＝8(个)，即有8个⑤，D错误。题组二基因表达载体的构建5．基因工程的核心是构建基因表达载体，下列不属于载体作用的是()A．载体能防止目的基因被受体细胞限制酶“切割”B．载体能协助目的基因在受体细胞中复制C．载体含有启动子和终止子协助目的基因表达D．载体具有标记基因，便于筛选含目的基因的受体细胞答案A解析载体不能防止目的基因被受体细胞限制酶“切割”，A错误；载体在受体细胞中能够稳定存在，并且自我复制，使目的基因数量扩大，B正确；启动子是RNA聚合酶的识别和结合的位点，能启动转录过程；终止子控制着转录的结束，所以载体含有的启动子和终止子可协助目的基因的表达，C正确；载体具有标记基因，标记基因便于筛选含有目的基因的受体细胞，D正确。6．下列关于基因表达载体的说法，不正确的是()A．基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤B．基因表达载体包含启动子、目的基因、终止子、标记基因等C．终止子位于目的基因的下游，能够终止翻译过程D．不同的目的基因所需的启动子不一定相同答案C解析基因表达载体包括启动子、终止子、目的基因、标记基因等，其中启动子位于目的基因的上游，是启动转录的一段DNA片段，终止子位于目的基因的下游，能够终止转录过程，B正确，C错误；不同的目的基因具有不同的核苷酸序列，其启动子也不尽相同，D正确。7．(2023·银川高二阶段考)科学家利用质粒(如图)成功构建了蛛丝蛋白基因的重组质粒，并在家蚕丝腺细胞中获得大量蛛丝蛋白。下列有关说法错误的是()A．为防止目的基因自身环化，可以用限制酶XbaⅠ和SacⅠ来切割目的基因B．构建基因表达载体时选用蚕丝蛋白基因的启动子利于基因在家蚕丝腺细胞中表达C．启动子是DNA聚合酶的识别和结合部位，可以驱动遗传信息的转录D．基因表达载体中的标记基因可以用来鉴别与选择含有蛛丝蛋白基因的受体细胞答案C解析启动子是RNA聚合酶的识别和结合部位，C错误。8．(2023·江苏南通高二期中)如图表示pBR322质粒和人生长激素基因所在片段的结构信息，将二者构建的重组质粒导入受体菌并进行筛选。下列有关叙述正确的是()注：AmpR为氨苄青霉素抗性基因，TetR为四环素抗性基因。A．可选择的限制酶组合是酶E和酶GB．所选用的受体菌不能含有AmpR和TetR基因C．用含氨苄青霉素的培养基就能筛选出含重组质粒的受体菌D．同时用三种限制酶处理图中质粒，电泳后可得到3个条带答案B解析酶E会破坏两种标记基因，为避免切割后DNA片段的自身环化，又保留质粒上的标记基因，切割时应选择的限制酶组合是酶F和酶G，A错误；重组质粒上的四环素抗性基因被破坏，而重组质粒上的氨苄青霉素抗性基因能表达，用含氨苄青霉素的培养基筛选出的有导入重组质粒的受体菌和导入普通质粒的受体菌，C错误；据图可知，因酶E有两个作用位点，同时用三种限制酶处理图中质粒，能将质粒切割成4个DNA片段，电泳后可得到4个条带，D错误。9．RT－PCR是以提取的RNA为模板，经逆转录获得与之互补的DNA(cDNA)序列，再以cDNA序列为模板进行目的片段的扩增，具体过程如图所示。下列有关RT－PCR的叙述，正确的是()A．过程1需要使用耐高温的DNA聚合酶B．过程2中的引物B可与mRNA互补配对C．游离的脱氧核苷酸只能加到引物的5′端D．RT－PCR可用于对RNA病毒的检测与鉴定答案D解析过程1是由mRNA形成单链DNA的过程，为逆转录，该过程需要逆转录酶，A错误；过程2中的引物B可与cDNA互补配对，而mRNA与cDNA碱基互补配对，则引物B和mRNA除碱基T和U的区别外，其余序列相同，不能互补配对，B错误；游离的脱氧核苷酸只能加到引物的3′端，C错误；利用RT－PCR技术对某些微量RNA病毒进行检测，并可提高检测的灵敏度(因为增加了待测RNA逆转录产生的DNA的数量，因此便于检测)，D正确。10．研究人员用如图1中质粒和图2中含目的基因的片段构建重组质粒(图中标注了相A．构建重组质粒的过程应选用BclⅠ和HindⅢ两种限制酶B．使用DNA连接酶将酶切后的质粒和目的基因片段进行重组C．能在添加四环素的培养基上生存的一定是含有重组质粒的大肠杆菌D．利用PCR鉴定含目的基因的大肠杆菌时应选用引物甲和引物丙答案C解析选择的限制酶应在目的基因两端存在识别位点，但BamHⅠ可能使质粒中的两种标记基因都被破坏，因此只能选BclⅠ和HindⅢ两种限制酶切割，A正确；酶切后的质粒和目的基因片段要用DNA连接酶连接，构建重组载体，B正确；能在添加四环素的培养基上生存的也可能是只含有质粒的大肠杆菌，C错误；PCR技术要求两种引物分别和目的基因的11．(2023·哈尔滨高二期末)下列有关PCR的叙述，错误的是()A．PCR的原理是DNA半保留复制，解旋和复制不是同时进行的B．PCR的过程主要包括变性→延伸→复性，温度逐渐降低C．PCR技术扩增时，一个DNA分子经过n轮复制共需引物2n－1对D．常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物答案B解析PCR的原理是DNA半保留复制，PCR技术是在较高温度条件下打开双链后进行扩增的，是先解旋