分子生物学技术应用-DNA测序技术

二代测序技术二代测序技术——发展历程第二代测序使用最为广泛。以Roche公司的454技术，Illumina公司的Solexa，HiSeq技术为代表二代测序技术01基本介绍02二代测序技术的方法03二代测序技术的应用基本介绍01——捕捉新合成的末端标记来确定DNA序列第二代测序技术边合成边测序或变链接边测序。核心思想高通量、自动化。特点第二代测序技术（大规模平行测序）一代与二代测序技术的区别对模板体外克隆→单独反应模板DNA打断成小片段→文库扩增→测序。第一代测序技术第二代测序仪技术的优点优点01保证高准确性02降低测序成本03提高测序速度二代测序技术的方法02焦磷酸测序：是一种由DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶催化的新型酶级联化学发光测序技术，通过对DNA合成反应中释放的生物光信号完成实时监测，开创边合成边测序先河。焦磷酸测序原理每轮测序反应体系——一种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)配对测序引物的3′末端焦磷酸(PPi)释放ATP5'-磷酰硫酸（APS）ppi形成荧光素氧化荧光素DNA聚合酶掺入的dNTP＝释放的Ppi

ATP硫酸化酶催化荧光素酶催化可见光CCD感应器——光信号→检测峰每个峰的高度（光信号）与掺入的核苷酸数目呈正比Apyrase反应体系光信号核苷酸ATP原理淬灭降解再生454/Roche测序系统原理基于焦磷酸测序法，依靠生物发光对DNA序列进行检测。正确荧光标记的引物、核酸探针、电泳错误快速、准确、高灵敏度、高自动化不匹配IonTorrent/LifeTechnologies测序系统DNA分子DNA分子核苷酸DNA分子PH值变化→结合→释放HH→PH值改变→数字信号＝两个相同的碱基芯片记录两个相同的碱基检测双倍电压检测不到电压不会记录碱基4.Solexa/Illumina测序系统测序系统同时完成传统基因组学研究和功能基因组学研究。测序仪一次读取1,000个左右碱基，DNA样品制备和分析时间长。测序系统高准确性、高通量、高灵敏度和低运行成本。二代测序技术的应用03应用应用第二代测序技术的核心思想是什么？思考题三代测序技术目录01基本介绍02三代测序技术的方法03应用发展历程第二代测序使用最为广泛。以Roche公司的454技术，Illumina公司的Solexa，HiSeq技术为代表基本介绍01三代测序技术重组DNA分子以不经扩增的单分子测序和长读长为标志的测序技术称为第三代测序，这些技术一次可读取长达数万碱基的片段，大大降低了拼接难度，更重要的是大大减少了过去无法定位的漏洞。三代测序技术优势①第三代基因测序读长较长，可以减少拼接成本，节省内存和计算时间；②作用原理上避免了PCR扩增引入错误；③拓展应用：RNA的序列，甲基化的DNA序列等；缺陷①单读长的错误率偏高，需重复测序以纠错（增加测序成本）；②依赖DNA聚合酶的活性；③成本较高（二代Illumina的测序成本是每100万个碱基0.05-0.15美元，三代测序成本是每100万个碱基0.33-1.00美元）。④生信分析软件不够丰富、数据积累少。三代测序技术的方法

021.PacificBiosciencesSMRT测序技术发展历程SMRT测序技术由Webb和Craighead提出，Korlach、Turner、PacificBiosciences（PacBio）将其进一步发展，并于2009年作为PacBio测序平台推出。1.PacificBiosciencesSMRT测序技术原理

PacBioSMRT技术其实是应用了边合成边测序的思想（使用4色荧光标记4种碱基），其超长读长的关键在于使用了活性持久且高保真的DNA聚合酶，并以SMRT芯片为测序载体（ZMW原理）。1.PacificBiosciencesSMRT测序技术优势及劣势①SMRT技术的测序速度很快，每秒约10个dNTP；②错误率较高，达到15%，出错随机，可通过多次测序来进行有效的纠错（如使用Sparc对30X的数据进行分析，错误率可达到0.5%）；③原始DNA不被破坏；④读长可达10kbp。2.OxfordNanoporeTechnologiesNanopore测序技术发展历程Bayley于2005年成立OxfordNanoporeTechnologies（ONT）公司，2014年第一个消费级别的纳米孔测序仪的原型机——MinION在ONT诞生。原理该技术设计了一种特殊的纳米孔，孔内共价结合有分子接头，最终得到电信号而不是光信号或pH信号的测序技术。当DNA碱基通过纳米孔时，电荷将发生变化，因而短暂地影响流过纳米孔的电流强度（每种碱基所影响的电流变化幅度是不同的），灵敏的电子设备检测到这些变化从而鉴定所通过的碱基。2.OxfordNanoporeTechnologiesNanopore测序技术优势及劣势①读长很长，大约在几十kb，甚至100kb；②错误率目前相比较高，且是随机错误，而不是聚集在读取的两端；③数据可实时读取；④通量很高(30x人类基因组有望在一天内完成)；⑤起始DNA在测序过程中不被破坏；⑥样品制备简单又便宜；⑦可直接测序RNA。2.OxfordNanoporeTechnologiesNanopore测序技术三代测序技术的应用03相关应用单分子测序的分辨率具有优势，使其在特定序列的SNP检测，稀有突变及其频率测定中大显身手。耐药任与FLT3基因下游出现的稀有新突变有关，重新证明了FLT3基因是这种最常见白血病——急性髓细胞白血病（AML)的有效治疗靶标。PacBio平均3000bp的读长，获得了更多基因下游的宝贵信息，而基于单核酸分子的测序能够检测到低频率（低至1%）罕见突变。请思考第三代测序技术的优点都有什么？思考题一代测序技术发展历程第二代测序使用最为广泛。以Roche公司的454技术，Illumina公司的Solexa，HiSeq技术为代表一代测序技术01基本介绍02一代测序技术的方法基本介绍01基本介绍——第一代测序的发明人在1997年发明了利用DNA聚合酶和双脱氧链终止测定DNA核苷酸序列的方法。FredSanger及其同事基本介绍——第一代测序的发明人第一代测序技术概念：传统的链终止法，化学降解法，以及在它们的基础上的各种DNA测序技术。一代测序技术的方法02一代测序技术的方法０１对DNA片段5’或3’末端进行放射性标记。０２采用特异性化学试剂修饰和裂解特定的碱基位点。Maxam-Gilbert

化学降解测序法实验步骤将标记完的样品，分成四份取待测DNA片段２．G+A反应"甲酸"１．G反应，"硫酸二甲酯"４．C反应在NaCl存在时，只有C与肼反应，得到一系列C末端的片段３．T+C反应"肼"一代测序技术的方法形成大小不一的DNA链电泳分离DNA链根据同位素标记自显影后读出序列Maxam-Gilbert化学降解测序法的弊端化学降解测序法自建立以来没有很大的改进，目前仅在分析DNA和蛋白质相互作用中的DNA一级结构时等中才使用。受制于当时聚丙烯酰胺凝胶电泳的分辨能力dNTP和ddNTP分子结构式Sanger双脱氧链终止法利用DNA聚合酶特性，使ddNTP参入到寡核苷酸链的3’末端。基本原理：双脱氧链终止法主要用于DNA基因分析一代测序技术的方法Sanger双脱氧链终止测序法原理原理：是以待测单链DNA为模板，以dNTP为底物，在寡核苷酸引物的引导下依据碱基互补配对原则。在此对引物进行了事先标记，可以实现4个测序反应在同一反应管中进行。可以利用自显影技术。测序程序2.在4只试管中加入适当的引物、模板、4种dNTP。分别加入一种一定浓度的ddNTP。3.与单链模板结合的引物