3.2.2将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定课件高二下学期生物人教版选择性必修3

第2节

基因工程的基本操作程序第2课时将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定第3章

基因工程第三步、将目的基因导入受体细胞基因表达载体受体细胞导入动物植物微生物将目的基因导入不同受体细胞的方法有何不同？目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。实质是基因重组。1.转化（1）花粉管通道法（我国科学家独创）②在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。①用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中目的基因适用生物：开花植物1.目的基因导入植物细胞含目的基因的DNA溶液花粉落到柱头上刺激花粉管萌发并生长至子房滴管蘸取外源DNA溶液涂抹雌蕊柱头外源DNA沿花粉管通道进入胚囊外源DNA进入受精卵DNA随机整合利用植物授粉后形成的天然花粉管通道，将外源基因携带进入胚囊，此时的受精卵未形成细胞壁，且正在进行活跃的DNA复制，容易将外源DNA片段整合到受体基因组中。操作简单、技术成本低，免去了组织培养以及诱导再生植株的全套人工培养过程。原理：优点：冠瘿瘤农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物和裸子植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤等。（2）农杆菌转化法特点Ti质粒上的T-DNA可以转移到被侵染的受体细胞，并将其整合到该细胞染色体的DNA上。随着转化方法的突破，农杆菌侵染水稻、玉米等多种单子叶植物也取得了成功。怎样利用农杆菌进行转化呢？构建表达载体导入植物细胞目的基因插入植物细胞染色体DNA上表达新性状转入农杆菌3.过程：Ti质粒目的基因①两次拼接第一次拼接：目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上；第二次拼接(非人工操作)：被插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上。②两次导入第一次导入：将含目的基因的重组Ti质粒导入农杆菌；第二次导入(非人工操作)：含目的基因的T-DNA导入受体细胞。

导入的植物的受体细胞可以是什么细胞呢？a.可以将从新鲜的叶片上取下的圆形小片与农杆菌共培养，然后筛选转化细胞，并再生成植株。b.可以将花序直接浸没在含有农杆菌的溶液中一段时间，然后培养植株并获得种子，再进行筛选、鉴定等。(5)具体转化方法：受精卵或体细胞(4)受体细胞：2.目的基因导入动物细胞（1）常用方法：（2）受体细胞:显微注射法受精卵①体积大，易操作。②易表现出全能性。（3)过程：构建基因表达载体并提纯利用显微注射将基因表达载体注入动物的受精卵中早期胚胎培养胚胎移植获得具有新性状的动物方法2：病毒介导法:(二)将目的基因导入动物细胞科学家用病毒DNA与目的基因一起构建的载体，去感染受体动物细胞，也能使目的基因导入动物细胞内。如用腺病毒载体，搭载新冠病毒S基因，进入人体内，使人体产生对S蛋白的免疫记忆。（1）常用方法：Ca2+处理原核细胞（常选择大肠杆菌）（2）受体细胞：优点：繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少，易于培养。3.目的基因导入微生物细胞Ca2+感受态细胞吸收Ca2+的作用：增加细胞壁的通透性，可使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态（感受态细胞）。实例：利用转基因大肠杆菌生产药物Ca2+处理细胞感受态细胞表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA分子(4)过程：为何导入的不是胰岛素基因而是cDNA?大肠杆菌生产出的胰岛素具有生物活性？原因：①原核生物细胞里没有相应的酶来去除内含子；②原核生物没有真核的蛋白质加工系统（如内质网、高尔基体等）【小结】目的基因导入受体细胞方法比较种类项目植物细胞动物细胞微生物细胞常用方法

受体细胞

转化过程花粉管通道法农杆菌转化法显微注射法Ca2＋处理法体细胞或受精卵受精卵原核细胞目的基因插入Ti质粒的T­DNA上→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA中→表达目的基因表达载体提纯→取卵（受精卵）→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物Ca2＋处理细胞→能吸收周围环境中DNA分子的生理状态细胞→重组的基因表达载体导入细胞中按前面三个步骤进行了操作，是否可以确定目的基因进入了受体细胞并能维持稳定？是否可以确定目的基因一定能够进行表达？是否可以确定得到了新的性状？不一定！如何判断？三、目的基因的检测与鉴定类型检测内容方法分子水平的检测个体生物学水平的鉴定受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因目的基因是否转录出了mRNAPCR等技术；目的基因是否翻译成蛋白质抗原-抗体杂交技术个体是否具有相应性状抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等（二）目的：（一）检测内容及方法：

检测目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性①检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因（一）分子水平检测

PCR等技术方法1：PCR扩增转基因生物提取DNA根据目的基因的序列设计PCR引物PCR操作是否扩增出目的基因电泳DNA测序技术M：marker；1-阳性质粒；2：原始品系；3-9转Bt品系；转Bt基因品系PCR琼脂糖凝胶电泳检测结果稳定遗传的关键PCR技术（2）检测目的基因是否转录转基因生物PCR操作是否扩增出目的基因逆转录cDNA提取RNAmRNA作为模板提取培育出的转基因植株细胞中的RNA，依据目的基因两端的特异性序列设计两种引物，对转基因植物细胞中的DNA进行RT-PCR扩增。对扩增产物进行电泳鉴定。③检测目的基因是否翻译出相应蛋白质（一）分子水平检测方法：

抗原—抗体杂交过程：提取转基因植物的蛋白质+相应抗体→是否出现杂交带以“抗虫棉”为例（含Bt抗虫蛋白基因）苏云金芽孢杆菌提取Bt抗虫蛋白注射小鼠体内抗体标记抗体提取蛋白电泳分离抗原抗体杂交转基因生物放射性检测

（杂交带）抗原与抗体的特异性结合原理：检测目的基因是否表现出相应的性状检测抗虫棉是否具有抗虫性状采摘抗虫棉叶片饲喂棉铃虫观察棉铃虫存活情况04检测内容及方法----个体水平鉴定例如，一个抗虫或抗病的目的基因导入植物细胞后，是否赋予了植物抗虫或抗病特性，需要做抗虫或抗病的接种实验，以确定是否具有抗性以及抗性的程度。又如，有的基因工程产品需要与天然产品的功能进行活性比较，以确定转基因产品的功能活性是否与天然产品相同。转基因生物鉴定方法成功标志抗虫植物抗病毒（菌）植物抗盐植物抗除草剂植物获取目的基因产物的转基因生物饲喂害虫（抗虫接种实验）害虫死亡病毒（菌）感染（抗病接种实验）未出现病斑盐水浇灌正常生长喷洒除草剂正常生长提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较功能、活性正常2.个体生物学水平的鉴定基因探针：是一小段带有放射性同位素标记或荧光标记的单链的DNA片段。能与目的基因的的-条链发生碱基互补配对.检测目的基因是否插入和转录，还可以用探针。基因探针：一般是指一小段单链DNA或RNA，能与目的基因的一条链碱基互补配对，并带有放射性同位素标记或荧光标记。例如，胰岛素基因探针，既能与胰岛素基因的一条链形成杂交分子，也可与胰岛素基因转录形成的mRNA形成杂交分子。用胰岛素基因探针既可以检测受体细胞中是否含有胰岛素基因，也可以检测胰岛素基因是否转录。人体的细胞中，胰岛B细胞的DNA和RNA能与胰岛素基因探针形成杂交分子，而其他细胞中只有DNA能与之形成杂交分子。

在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等作标记，以此作为探针，使探针与基因组DNA或mRNA杂交，若出现杂交带，则目的基因插入成功或转录出相应的mRNA。(1)将目的基因导入植物细胞一般采用农杆菌转化法。(

)(2)为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体。(

)(3)常用卵细胞作为培育转基因动物的受体细胞。(

)(4)转基因抗虫棉植株抗虫效果的鉴定必须通过分子检测。(

)(5)抗虫基因即使成功地插入植物细胞染色体上也未必能正常表达。(

)(6)检测目的基因是否插入受体细胞的DNA中，可用抗原—抗体杂交技术。(

)√×××√×例1：用PCR方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时，得到以下电泳图谱，其中1号为DNA标准样液(Marker)，10号为蒸馏水。PCR时加入的模板DNA如图所示。据此做出分析不合理的是(

)A.PCR产物的分子大小在250至500bp之间B.3号样品为不含目的基因的载体DNAC.9号样品对应植株不是所需的转基因植株D.10号的电泳结果能确定反应体系等对实验结果没有干扰B√农杆菌Ti质粒上的T-DNA可以转移并随机插入被侵染植物的染色体DNA中。研究者将图示中被侵染植物的DNA片段连接成环，并以此环为模板进行PCR，扩增出T-DNA插入位置两侧的未知序列，以此可确定T-DNA插入的具体位置。下列说法不正确的是(

)

注：子链从引物的3′端开始延伸。A．PCR扩增利用的是DNA热变性的原理B．进行PCR扩增需要耐高温的DNA聚合酶C．利用图中的引物②③组合可扩增出两侧的未知序列D．通过与受体细胞的基因组序列比对，可确定T-DNA的插入位置(2023·黑龙江哈尔滨高二月考)据研究，新冠病毒表面的S蛋白是主要的病毒抗原，在康复病人的血清中有抗S蛋白的特异性抗体。下图为某机构研制疫苗的部分过程。请回答下列相关问题：(1)进行核酸检测需要使用__________________________作探针，进行血清抗体检测的方法是_________________________。含放射性同位素的目的基因抗原—抗体杂交(4)S基因在培养的动物细胞中能稳定遗传的关键是_____________________________________________。S基因需要整合到动物细胞中的染色体DNA上(2)选择性扩增S基因的原理是_______________________。(3)研究疫苗的步骤①用到的酶有________________________，获得的表达载体除了S基因外，还有_______________________________________等组成部分。DNA半保留复制限制酶和DNA连接酶启动子、终止子、标记基因、复制原点1.研究人员将一种海鱼的抗冻蛋白基因afp整合到土壤农杆菌的Ti质粒上，然后用它侵染番茄细胞，获得了抗冻的番茄品种。判断下列相关表述是否正确。（1）afp基因是培育抗冻番茄用到的目的基因。（）（2）构建含有afp基因的Ti质粒需要限制酶、DNA连接酶和核酸酶（）（3）只要检测出番茄细胞中含有afp基因，就代表抗冻番茄培育成功（）2.利用PCR既可以快速扩增特定基因，也可以检测基因的表达。下列有关PCR的叙述错误的是（）A.PCR用的DNA聚合酶是一种耐高温酶B.变性过程中双链DNA的解开不需要解旋酶C.复性过程中引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则D.延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP和4种核糖核苷酸√××D练习与应用一、概念检测练习与应用二、拓展应用3.研究人员在研究转基因烟草中外源卡那霉素抗性基因的遗传稳定性时，发现44株转基因烟草中有4株该基因的遗传不符合孟德尔遗传规律，在它们的自交后代中出现了较多的没有卡那霉素抗性的植株。请查找相关资料，尝试对这个问题作出解释。外源基因插入基因组中可能为单位点插入，或者同一染色体多位点插入，或者不同染色体多位点插入。大多数情况下，插入的位点难以做到定点插入；插入的拷贝数也是随机的。因此，外源基因在转基因植物中的遗传是很复杂的。例如，科研人员在对转GUS基因(β-葡糖醛酸糖苷酶基因)的烟草进行基因表达分析时，发现部分转基因植株的染色体DNA中整合了多个拷贝的基因，从而导致GUS基因失活。除此之外，外源基因丢失、基因重排等也都可能影响外源基因的稳定性。2.八氢番茄红素合酶(其基因用psy表示)和胡萝卜素脱饱和酶(其基因用crtl表示)参与β-胡萝卜素的合成。pmi为磷酸甘露醇异构酶基因，它编码的蛋白质可使细胞在特殊培养基上生长。科学家将psy和crtl基因转入水稻，使水稻胚乳中富含β-胡萝卜素，由此生产出的大米称为“黄金大米”。请根据以上信息回答下列问题。（1）科学家在培育“黄金大米”时，将ctrⅠ和psy基因导入含pmi基因的质粒中，构建了质粒pSYN12424。该项研究的