基因工程原理与技术培训课件

基因工程原理与技术二、用于构建基因组文库的载体

1、λ噬菌体载体

2基因工程原理与技术2、黏粒载体

3基因工程原理与技术3、酵母人工染色体载体

转化酵母4基因工程原理与技术3、基因组DNA片段与载体的连接(重组DNA分子的构建)连接效率主要受插入片段与载体的摩尔数比以及DNA片段总浓度的影响。因此，应通过连接预试验确定连接反应中载体臂和插入片段的用量。

1.0μgλ噬菌体载体臂需要插入片段的用量连接效率低的解决措施：①调整载体与插入片段的用量；

②使用新鲜购置的连接酶；③重新纯化基因组DNA片段；④重新提取和制备基因组DNA片段。

6基因工程原理与技术4、重组DNA分子导入受体细胞对于λ噬菌体载体、黏粒载体，重组DNA分子在体外包装成噬菌体颗粒，以噬菌体感染的方式将重组的DNA分子导入到大肠杆菌中。效率高，达1.8×108pfu/μgDNA。对于YAC载体，采用电激法导入重组DNA分子。5、转化体的筛选培养及基因组文库的获得6、基因组文库的扩增、分装及保存

基因组文库扩增的方法：液体培养增殖法、影印滤膜培养法。

基因组文库扩增的问题：由于克隆的不均衡生长，从而导致相应克隆的丢失，导致基因组文库的代表性变差。小包装保存，4℃保存半年、-80℃保存几年而滴度保持稳定。

7基因工程原理与技术第二节cDNA文库的构建cDNA文库是指某生物、组织或细胞所有cDNA的的克隆群体。包括组织特异性cDNA文库、区域特异性cDNA文库。一、用于构建cDNA文库的载体及载体片段制备质粒载体、λ噬菌体载体，能满足0.5~10kbcDNA克隆。二、mRNA的提取及其完整性的确定1、mRNA的来源(取材)目标mRNA为高丰度的材料2、mRNA的提取

olig(dT)n-纤维素柱层析法

olig(dT)n-磁珠分离法8基因工程原理与技术3、mRNA完整性的确定无细胞翻译系统检测法(麦胚抽提物、免网状细胞裂解物)蛙卵检测法凝胶电泳检测法(根据28srRNA与18srRNA的条带亮度判定)4、mRNA的富集

特别是低丰度mRNA。琼脂糖凝胶电泳法：回收率较低变性蔗糖密度梯度离心法：回收率高现在，一般是进行cDNA富集。操作烦琐、时间长9基因工程原理与技术三、cDNA克隆片段的制备1、cDNA第一链的合成

AAAAAAAAAGppp引物(OligdT17)退火AAAAAAAAAGpppTTTTTTTTTT逆转录酶、dNTPAAAAAAAAAGpppTTTTTTTTTT鸟类骨髓细胞白血病病毒(AMV)逆转录酶：RNaseH活性强莫洛尼鼠白血病病毒(M-MLV)逆转录酶：RNaseH活性较弱，有利于全长cDNA合成。Supscript逆转录酶：缺失RNaseH活性，反应温度较高(45℃)10基因工程原理与技术2、cDNA第二链的合成

①自身引导合成法

AAAAAAAAAGpppTTTTTTTTTT煮沸NaOHTTTTTTTTTTTTTTTTTT形成发夹环DNA聚合酶TTTTTTTTTAAAAAAATTTTTTTTTAAAAAAAAS1核酸酶造成5’端缺失11基因工程原理与技术②置换合成法

AAAAAAAAAGpppTTTTTTTTTTRNaseHAAAAAAAAAGpppTTTTTTTTTTPolIAAAAAAAAAGpppTTTTTTTTTTAAAAAAAAAGpppTTTTTTTTTTDNA连接酶优点：a、效率高；b、不需纯化cDNA第一链；c、仅缺失5’端几个核苷酸。12基因工程原理与技术③PCR合成法

优点：a、灵敏度高，对起始材料少、低丰度mRNA特别具有优势；b、不需纯化mRNA，避免了纯化过程中信息的丢失；c、不会丢失5’端信息13基因工程原理与技术3、双链cDNA的末端处理及甲基化修饰

①加同聚物尾

14基因工程原理与技术②接上人工接头首先补平cDNA末端及甲基化修饰，然后再接上人工接头。连接子(linker)15基因工程原理与技术衔接头(adaptor)16基因工程原理与技术四、cDNA克隆片段与载体片段的连接及检测1、平头末端连接法，无法回收插入片段2、同聚物接尾法，接dA/dT，通过局部变性和S1处理来回收3、人工接头法五、重组cDNA分子导入受体细胞如构建质粒文库，要有高质量的大肠杆菌感受态细胞(109pfu/μgDNA)六、转化体筛选培养及cDNA文库生成七、cDNA文库的扩增、分装及保存值得注意的是：在构建cDNA文库时，如果用人工接头法，在酶切之前要用甲基化酶保护cDNA中的相应酶切位点。

一般情况下无需构建原核细菌的cDNA文库。

17基因工程原理与技术第三节目的基因的获得

获得目的基因的主要途径：①筛选基因组文库；②筛选cDNA文库；③PCR扩增目的基因；④人工合成法；⑤差异克隆法；⑥图位克隆法；⑦转座子标签法；⑧T-DNA标签法序列已知的基因未知序列的基因⑨基因组计划18基因工程原理与技术一、从文库中分离已知序列的基因1、核酸杂交法(菌落/噬菌斑原位杂交)

利用部分同源探针可以分离不同种属的相同基因或同一基因家族的不同成员。

如果只知基因编码蛋白质的氨基酸序列，可以设计简并探针予以筛选。19基因工程原理与技术2、PCR筛选法

特点：快速、简便。

程序：文库→多孔培养板

→一列或一行培养物于一PCR管中扩增→凝胶电泳检测

→阳性列或行分装培养

→第二轮PCR

→

→

→

→阳性克隆3、免疫学筛选

特点：筛选表达文库

程序：与核酸杂交筛选相似。见右图

20基因工程原理与技术二、从文库中分离未知序列的基因1、染色体步移法(图位克隆法)markerTargetgeneChromosomeFirstcloneTargetclone2、减法杂交克隆法（扣除杂交文库法）将一种组织的cDNA与生物素标记的另一种组织的m