生物技术制药课堂重点

第一章绪论酶工程技术

•生物技术(biotechnology)：是发酵工程技术

指将生物用于有价值产品的生•生物技术制药的主要内容

产。基因工程制药

,生物技术制药(biotechnology细胞工程制药

pharmaceutics):用现代生物技酶工程制药

术制造药物。发酵工程制药

是指利用基因工程、细胞工•基因工程技术：是将一种生物

程、发酵工程、酶工程、蛋白质体的基因与载体在体外进行连

工程等生物技术，来研究、开发接，然后转入另一种生物体内，

和生产用于预防、治疗、诊断疾使重组基因在受体细胞内表达，

病的药物。产生出人类所需要的基因产物。

•生物药物(biologicaldrug)：•细胞工程技术：包括细胞及转

从生物体中制取的各种天然活性基因细胞的离体培养、繁殖、再

物质及其人工合成或半合成的天生、融合以及细胞核、细胞器(如

然物质类似物。线粒体、叶绿体等)的移植与改

性物技术药物(biotechnological建等操作技术。

drug):利用现代生物技术生产的•酶工程技术：在一定生物反应

蛋白质或核酸类等生物药物。装置中利用酶的催化作用，将相

•现代生物技术的主要内容应的原料转化成有用物质的技

基因工程技术术。

细胞工程技术•发酵工程技术：培养活细胞以

取得生物体或代谢产物的技术。、膜分离、双水相萃取。

（抗生素、氨基酸、维生素）•基因重组蛋白的主要纯化技术:

•生物制药：从生物材料中提取、1.离子交换层析

分离、纯化药物的过程。2.亲和层析

3.凝胶过滤层析（分子量大

第二章基因工程制药的先洗脱下来）

•基因工程制药：是指利用基因4.反相色谱和疏水色谱

工程技术生产蛋白质或多肽类药•亲和层析的主要步骤：

物。a.配体固定化

•基因工程药物制造步骤：b.亲和吸附阶段

上游阶段：分离目的基因，c.洗涤阶段

构建工程菌，目的基因的表达。d.洗脱解离阶段

下游阶段：从工程菌的大量e.再生阶段

培养到产品的分离纯化和质量控•凝胶过滤法的用途：

制。脱盐、分级分离、分子量的测

•分离纯化的步骤：细胞分离-定

细胞破碎-固液分离-浓缩与初步•反相色谱和疏水色谱：根据蛋

分离-高度纯化直至得到纯品-成白质疏水性的差异来实现分离纯

品加工化的。

里因重组蛋白的主要分离技术:•基因工程药物的改造的目的：

分离、沉淀（等电点沉淀法、提高疗效降低毒副作用。

盐析法）•基因定点突变技术

(site-directedmutagenesis):能表达后所得的蛋白质产物称为融

够在基因水平上对所合蛋白(fusionprotein,FP)。

编码的蛋白质分子进行改造。•融合蛋白的作用：延长半衰期、

•融合蛋白：在人工条件下将两降低清除率

个或多个基因的编码区首尾连接,

由同一调控序列控制构成的基因

基因工程产物分再纯匕的基本过程

发醉液

细胞分毒(离心或■■过渡)

产品

胞内产物T

胞外产物制剂

T

固液分离(去肯细聘碎片)T

纯化

包满佯可港旁口t

浓缩

空kT

初步分离

•选择分离纯化方法的依据

1.据产物表达形式来选择

2.根据分离纯化单元之间的衔接选择

3.根据分离纯化工艺的要求来选择

•疏水层析和反相层析的区别：

色谱种类反相色谱疏水色谱

介质表面疏水性强弱

流动相有机相水相

分离产物易变性天然产物

•基因工程药物的修饰与改造：兔体温。

1、构建突变体b.宿主蛋白：免疫分析试剂

2、融合蛋白盒。

嘎因工程药物的质量控制项目：c.核酸残留：核酸杂交法、

1、蛋白质的含量测定PCR

2、蛋白质的纯度检测方法和高亲和力DNA结合

3、蛋白质Mr测定蛋白。

4、蛋白质等电点测定

5、蛋白质序列分析

6、内毒素分析、宿主蛋白与第三章动物细胞工程制药

核酸残留分析•动物细胞生产药物的优缺点：

•蛋白质纯度的鉴定：优点:有翻译后修饰，与天然

电泳法、色谱法、质谱法、产品一致;分泌胞外、纯化方便。

末端氨基酸残基分析法缺点:培养条件高、成本高、

•蛋白质分子量测定：产量低。

SDS—卧GE、凝胶色谱法、•体外培养动物细胞的类型：

质谱法贴壁依赖性细胞、贴壁非依

赖性细胞（悬浮细胞）、兼性贴壁

•内毒素分析、宿主蛋白与核酸细胞

残留分析*显著污染的标志是：培养基的

a.内毒素分析：赏试剂、家pH值迅速改变，细胞外形模糊。

•动物细胞培养的环境条件：(无一个培养器皿中消化、分散并接

细胞壁，对环境条件非常敏感)种至另一个培养器皿中的操作称

培养温度为细胞传代。

pH值•细胞克隆培养的方法：

通氧量有限稀释法，软琼脂平板克隆

防止污染法。

基本营养物质细胞的冻存：加保护剂如甘油、

渗透压DMSO；缓慢降温。

•实验室动物细胞培养的基本技•动物细胞冻存注意事项：

术：①选对数生长期细胞；

细胞的原代培养②冻存前一天要换液培养；

细胞的传代培养③细胞密度1X106~2X

细胞克隆培养106个/ml

动物细胞的冻存与复苏④冻存液加保护剂(DMSO、

•原代细胞(primai*ycell)：直甘油)

接将动物组织或器官经过粉碎、⑤冻存管封口后要检查其密

消化而制得的悬浮细胞称为原代封性；

细胞。⑥标签标注细胞名称，编号

・原代培养方法：组织块培养法、和冻存日期。

单层细胞培

养法。­细胞复苏的注意事项：

•细胞传代(passage)：将细胞从*细胞复苏的原则是快速融化

①戴面罩和手套；3.细胞消化液：(1)胰蛋白

②37℃水浴中迅速融化；酶溶液

③用乙醇擦拭冻存管的外壁；(2)EDTA溶液(非酶性

④尽早将细胞离心或稀释；解离)

⑤隔天看细胞，再换液一次。4.抗生素溶液

­动物细胞的营养要求：水、碳•细胞系(CellLine)：原代培

源、氮源、维生素、激素及无机养物经首次传代成功即成细胞

盐等。系，由原先存在于原代培养物中

的细胞世系(LineageofCells)

•动物细胞培养基的分类：所组成。这种细胞世系由多种细

天然培养基；胞组成。

合成培养基；,细胞株(CellStrain)：通过

无血清培养基。选择法或克隆法从原代培养物或

•动物细胞培养基的消毒：细胞系中获得具有特殊性质或标

*不能采用高压法灭菌。志物的细胞称为细胞株。

用膜过滤除菌、分装、储•生产用动物细胞的种类：

存。1.原代细胞系

动物细胞培养常用的其他溶液:2.传代细胞株

1.平衡盐溶液：由生理盐水3.转化细胞株

和葡萄糖组成。4.工程细胞株

2.培养基pH调整液：NaHCOa•转化细胞株：正常细胞经过某

溶液、HEPES个转化过程，失去正常细胞的特

点而获得无限增殖的能力，得到中高密度大量培养动物细胞用于

的细胞株。生产生物制品的技术。

*CHO细胞(中国仓鼠卵巢细胞):•动物细胞的大规模培养方法：

已成功应用于表达促红细胞生成悬浮培养法

素(EPO)、重组乙肝疫苗等。微载体培养法

(Chinesehamsterovary多孔载体培养法

cell)微囊化培养法

*SP2：小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞中空纤维培养法

的融合细胞•常用的动物细胞生物反应器

搅拌式生物反应器

­细胞库的建立：气升式生物反应器

1•原始细胞库(mastercell中空纤维式生物反应器

bank,MCB)透析袋式或膜式生物反应

2.生产用细胞库器

(manufacturerAs固定床或流化床式生物反

workingcellbank,MWCB)应器

(workingcellbank)一次性摇袋式细胞培养生

物反应器

•动物细胞生物反应器的主要操

­动物细胞的大规模培养：作模式：

是指在人工条件下(设定温度、1.分批操作

pH、溶氧等)，在细胞生物反应器2.补料-分批操作

3.半连续操作中；

4.连续式操作b.筛选导入外源基因的体细

5.灌流式操作胞；

*工厂采用的操作模式主要是？c.此体细胞的核移植到去核

工业上为了防止出现菌种卵母细胞中。

衰退和杂菌污染等实际问题，大

都采用分批操作或补料分批操作

这两种方式。•体细胞核移植的优点：

•转基因动物制作方法：(1)事先筛选转基因阳性细

采用基因工程技术把外源目的基胞作为核供体，极大提高阳性转

因导入动物生殖细胞、胚胎干细基因动物生产率；

胞和早期胚胎，并在受体动物的(2)培养的体细胞更易于进

染色体上稳定整合，再经过发育行基因打靶等基因操作；

途径把外源目的基因稳定地传给(3)可以事先确定核移植后

子代，通过这项技术所获得的动代的性别，定向生产转基因动

物即为transgenicanimalo物。

施用的转基因动物生物反应器:

乳腺、血液、尿液、鸡第四章抗体工程制药

蛋•抗体工程制药：利用基因工程、

•体细胞核移植技术：细胞工程、发酵工程和转基因动、

a.目的外源基因和标记基因植物技术生产抗体药物的过程。

的融合基因导入培养的体细胞•人工制备抗体经历了三个阶段

第一代：多克隆抗血清responsesafterbinding:

第二代：单克隆抗体（细胞工1.激活补体(complement

程抗体）dependentcytotoxicity,CDC)

第三代：基因工程抗体2.结合Fc受体：

,抗原表位：epitope又称抗原a.调理作用

决定簇（antigenicb.介导

determinant,AD）指抗原分子中antibody-dependent

决定抗原性的特殊化学基团。cell-mediatedcytotoxicity,

•抗体的结构ADCC

c.介导I型超敏反应

3.穿越胎盘和黏膜

­抗体的功能：

a.binding（V区的功能）

b.Induceimmuneresponses•单克隆抗体制备流程图：

afterbinding（C区的功能）

・V区的功能：

培养中的骨疏瘤细胞是

HGPRT突变株不能在HAT

特异性结合抗原（Recognizeand培养基中生长

bindantigen）：

1.中和作用（病毒、毒素）

2.阻止黏附

在聚乙二醇中缰胞融合

3.凝集细菌

•c区的功能:Induceimmune

细胞放入HAT

选择性培养基・单链抗体：是利用DNA重组技

术将抗体一条VH和一条VL基因

杂交细胞（杂交痛）生

存，未融合细胞死亡通过一短肽链（接头DNA,

♦♦・♦

linker）连接后表达出来的抗体

检测阳性孔（含有抗免挖原

抗体的细胞孔）

片断。

培养产生抗免疫原•人源化抗体：用鼠的互补决定

n抗体的细胞克隆

区序列替换人的相应序列。也叫

•抗原的制备:

CDR移植抗体（CDRgrafting

重组蛋白抗原

antibody）或改型抗体。

提取纯化的天然抗原

•传统的鼠单抗在治疗应用方面

合成多肽半抗原

有那些局限？

小分子半抗原

鼠单抗被机体认为是外源蛋白

半抗原与载体偶联

质，在人体内引发严重的免疫反

•免疫方法:

应。这种免疫反应不只中和了抗

体内、体外、脾内免疫法

体的治疗作用，而且当机体再遇

­细胞准备：

到此抗体时会发生严重的过敏反

1.饲养细胞（feedercells）

应。鼠抗体在应用中受到的第二

2.骨髓瘤细胞

个限制是其不能有效地激活效应

*选对数生长期，活细胞计数〉

物功能（ADCC和CDC）,正是因为

95%

这一限制使其无法作为肿瘤治疗

3.免疫脾细胞

药物得以应用。

•杂交瘤细胞的克隆化方法:

•什么是噬菌体抗体库？

有限稀释法、软琼脂法

用体外基因克隆技术将B细胞全淘选(Panning)；

套可变区基因克隆出来，插入噬表达与鉴定。

菌体表达载体，转化细菌进行表•简述抗体库技术产生的三项技

达，在噬菌体表面形成噬菌体抗术基础

体的群体，即为噬菌体抗体库RT-PCR：能够克隆全套抗体可

(surfacedisplayantibody变区基因；

library)o表达技术:抗体基因片段在大

•采用什么方法可获得部分或全肠杆菌中的成功表达；

部人源的治疗用抗体？噬菌体表面展示技术(phage

人血清来源display)。

人杂交瘤一单克隆抗体

鼠单抗人源化•噬菌体抗体库技术？

噬菌体抗体库是丝状噬菌体展示技术与抗体组

转基因小鼠合文库技术相结合而产生的技

重组人多克隆抗体技术术。

从人外周血高效筛选分泌特

异性单抗的单个细胞操作法•单克隆抗体药物的分类

•简述噬菌体抗体库技术的基本抗体或抗体片段(裸抗体):

方法完整的抗体包括嵌合抗体、人源

扩增全套抗体可变区基因；化抗体和人抗体，抗体片段包括

构建表达载体；Fab,F(ab')2,ScFv等。

导入细胞、表达；抗体偶联物或称免疫偶联

物：由抗体或抗体片段与“弹头”人工减毒、灭活或利用基因工程

物质连接而成，可用作“弹头”等方法制成的用于预防传染病的

的物质有放射性核素、化疗药物免疫制剂。

与母索寸o•抗原具有免疫原性和免疫反应

融合蛋白：由抗体片段和活性性。

蛋白两个部分构成。•疫苗的类型：

•理想的抗肿瘤分子靶点应具备①减毒活疫苗

下列3个特点：②灭活疫苗

①特异性③亚单位疫苗：

②重要性：生长与扩散将被抑制纯化亚单位疫苗

③可检测性合成肽亚单位疫苗

•简述已上市抗体药物治疗哪些基因工程亚单位疫苗

疾病④联合疫苗

抗肿瘤⑤核酸疫苗（未上市）

免疫疾病治疗⑥治疗性疫苗（未上市）

器官移植•灭活疫苗特点

抗感染（1）灭活疫苗常需多次接种；

心血管疾病（2）接种灭活疫苗产生的抗体滴

度随着时间而下降；

第五章疫苗及其制备技术（3）灭活疫苗需要量大。

,疫苗（vaccine）：主要是指将,减毒活疫苗的优点：

病原微生物及其代谢产物，经过①通过自然感染途径接种，诱导

全面免疫应答，使机体获得较广•纯化亚单位疫苗：

泛的免疫保护；由单个蛋白或寡糖组成的疫苗，

②只需接种一次；如从致病微生物中纯化出来的细

③可能引起水平传播，扩大免疫菌脂多糖、病毒表面蛋白和去掉

效果，增强群体免疫屏障；了毒性的毒素，称为纯化亚单位

④不需要佐剂，不需要浓缩纯化,疫苗。

价格低廉。需要佐剂增强免疫原性。

•减毒活疫苗的缺点：需要大规模培养致病微生物，成

①一般减毒活疫苗均保留一定残本较高，具有病原微生物扩散的

余毒力和“返祖”现象；隐患。

②减毒活疫苗是活微生物制剂，•基因工程活载体疫苗：将抗原

可能造成环境污染而引发交叉感编码基因克隆入表达载体，用以

染等，并可能滞留在环境中形成转染细胞或真核细胞微生物及原

传染源；核细胞微生物后得到的产物。

③缺损颗粒可能干扰疫苗的免疫,多价疫苗(multivalent

效果；vaccine)

④保存、运输等条件要求较高。预防由同一种病原微生物的不同

,亚单位疫苗：亚型引起的传染病，例如23价肺

利用微生物的某种表面结构成分炎多糖疫苗，由代表23种不同血

(抗原)制成、能诱发机体产生清型的细菌多糖所组成，只能预

抗体的疫苗，称为亚单位疫苗防肺炎球菌的感染。

(subunitvaccine)•一、灭活全毒疫苗制备方法举

例——流感全病毒灭活疫苗的制③可操作性强，可以人为地设计

备毒种种子批的建立及检定成不同用途的疫苗或基因治疗转

(1)血凝素型别鉴定试验载系统。

(2)病毒滴度2.联合疫苗、结合疫苗、多价疫

(3)血凝滴度苗区别

(4)无菌检查、支原体检查联合疫苗(combinedvaccine)：

(5)外源性禽白血病病毒、禽腺是由疫苗厂家将不同

病毒检测抗原进行物理混合后制成的一种

(6)毒种保存混合制剂。

•单价原液的制备结合疫苗(conjugatevaccine)

(1)病毒收获：是通过化学方法将

(2)尿囊收获液检定及合并：两种以上的抗原相互偶联而制成

(3)病毒灭活：的疫苗。

(4)浓缩和纯化及除菌过滤：多价疫苗(multivalent

(5)单价原液保存：vaccine)

1基因工程活载体疫苗的特点预防由同一种病原微生物的不同

①可制备出不含感染性物质的亚亚型引起的传染病，例如23价肺

单位疫苗、稳定的减毒疫苗及能炎多糖疫苗，由代表23种不同血

预防多种疾病的多价疫苗。清型的细菌多糖所组成，只能预

②基因工程活载体疫苗具有减毒防肺炎球菌的感染。

活疫苗相似的特点，可模拟天然3.DNA疫苗和基因工程活载体疫

感染途径；苗区别

DNA疫苗是将编码外源性抗原是指在分离出病原体特异抗原编

的基因插入到含真核表达系统的码基因的基础上，将外源基因转

质粒上，然后将质粒直接导入人入另外一个通常是非致病性的微

或动物体内，让其在宿主细胞中生物(如大肠杆菌或酵母)内表

表达抗原蛋白，诱导机体产生免达基因产物，然后通过分离和纯

疫应答。化而获得特异的蛋白质。

基因工程活载体疫苗：将抗原编

码基因克隆入表达载体，用以转

染细胞或真核细胞微生物及原核

细胞微生物后得到的产物。

4.基因工程亚单位疫苗和基因工

程活载体疫苗区别

基因工程亚单位疫苗(genetic

engineeringsubunitvaccine)

第六章酶工程制药

,酶(Enzyme):具有催化活性和高度专一性的生物催化剂。

,酶的催化特点：

催化效率高；

专一性；

不稳定性；

酶的活性受到调节控制

•酶的本质：蛋白质和核酸

•酶的分子组成（以蛋白质类酶为例）

单纯酶：仅由蛋白质组成；利用的一种技术。

结合酶（全酶）：•设计一个完整的实验分离提取

蛋白质部分：酶蛋白胰蛋白酶？

辅助因子：金属离子、1.原材料选择及预处理：称取1

小分子化-1.5Kg新鲜猪胰脏，在冰浴下

合物剥除脂肪和结缔组织，在低温下

•酶分离纯化的一般程序：用绞肉机绞碎胰脏

1.原材料的选择和预处理2.稀酸溶液提取：H2s04调节PH

2.酶的分离（盐析、等电点至2.5-3.0

沉淀、离心分离等技术等）3.盐析：滤液加固体粉状硫酸镂

3.酶的精制（凝胶过滤、离进行盐析，使溶液至75%饱和

子交换层析、亲和层析等）度；4.结晶

4.酶的浓缩干燥及结晶（旋

转蒸发、透析等）

•固定化酶（immobilized

enzyme）或固定化细胞

（immobilizedcell）：是将具

有一定生理功能的酶或生物细

胞，用物理或者化学方法将其固

定，作为固体生物催化剂而加以

・微生物发酵法产酶的优点？3.常用的固定化酶载体材料

一、固定化酶（细胞）的制备二、固定化酶（细胞）的性质和指

1.固定化酶概念标

2.酶（细胞）固定化的方法

三、固定化酶的应用

固定酶和固定化细胞的优点各是副产物

什么？怎样制备？B.细胞膜、细胞壁和载体都存

2.固定化细胞的特点：在着扩散限制作用

优点：C.载体形成的空隙大小影响高

A.无需进行酶的分离纯化分子底物的通透性

B.细胞保持酶的原始状态，固

定化状态中酶的回收率高

C.细胞内酶比固定化酶稳定性

高

D.细胞内酶的辅助因子可以自

动再生

E.细胞本身含多酶体系，可催

化一系列反应

F.抗污染能力强

缺点：

A.利用的仅是胞内酶，而细胞

内多种酶的存在会形成不需要的

方

优点缺点

法

吸制作条件温和、简便、成结合力弱，对pH、离子强度、

附本低、载体再生、可反复温度等因素敏感，酶易脱落，酶

法使用的装载容量较小

共载体与偶联方法可选择性偶联条件激烈，易引起酶失活；

价大；酶的结合力强，非常成本高，某些偶联试剂有一定毒

法稳定性

交可用的交联试剂多，技术

联简易，酶的结合力强，稳交联条件激烈，机械性能差

法定性高

包包埋材料、包埋方法可选

仅可用于低分子量的底物，常有

埋余地大，固定化酶的使用

扩散限制问题

法面广，包埋条件温和

（4）新型载体

各种酶固定化方法的比较

固定化酶载体材料•一、酶反应器

（1）高分子载体•二、酶工程的研究现状

（2）无机载体突变酶和酶分子的定向进

（3）复合载体化

•酶工程在制药工业中的应又称理性分子设计。

用

突变酶(mutationalenzyme)：•酶定点突变的方法：

采用基因工程技术对天然酶基因寡聚甘酸引物诱变

进行剪切、修饰或突变，通过表盒式诱变

达修改的基因获得的在酶学性质•定向进化：在试管中模拟达尔

上符合需要的酶。文进化的过程，利用分子生物学

酶分子的定向进化手段在分子水平创造分子的多样

在试管中模拟达尔文进化的过性，结合灵敏的筛选技术，迅速

程，利用分子生物学手段在分子得到理想的变异。

水平创造分子的多样性，结合灵,抗体酶(abzyme)是一类免疫

敏的筛选技术，迅速得到理想的系统产生的、具有催化活性的抗

变异。体。

•突变酶(mutationalenzyme)：第7章发酵工程制药

采用基因工程技术对天然酶基因概念

进行剪切、修饰或突变，通过表*发酵:泛指利用微生物制造或生

达修改的基因获得的在酶学性质产某些产品的过程。

上符合需要的酶。*发酵工程:培养活细胞以取得生

•定点突变：对酶的改造是在已物体或代谢产物的技术。

知酶的结构与功能的基础上，有*发酵工程制药:是指利用微生物

目的地改变酶的某一活性基团或发酵过程生产药物的技术。

模块，从而产生新性状的酶，故*一、发酵的定义

*发酵是用生物催化剂应称为微生物转化。

(biocatalyst)使培养物质转变脱氢反应、氧化反应、脱水反应、

成产品的生物化学反应过程。缩合反应、脱竣反应、氨化反应、

生物催化剂通常是细菌、放线菌、脱氨反应和异构化反应等。

真菌或其解体产物和动物植物细四、发酵工程制药的特点和发展

胞等。趋势

(一)微生物菌体发酵(1)菌种

*是以获得微生物菌体细胞为目(2)理论产量

的产品的发酵。*(3)常温常压

*初级代谢产物(4)防止污染

初级代谢产物是菌体对数生长期(5)产品较单一

产生的产物，这类产物对菌体生(6)达到分子水平

长、分化和繁殖都是必需的。*(7)投资少、见效快

*次级代谢产物*(8)还可用动植物细胞和工程

从合成代谢的中间产物出发，细菌

胞合成的一些生理功能不明确，诱变育种的类别

化学结构特殊，而且对细胞生命物理诱变：利用辐射，诱发基因

并非必须的产物，这类产物称为突变和染色体变异。

次级代谢产物。次级代谢产物一化学诱变：应用有关化学物质诱

般在菌体生长的稳定期合成。发基因和染色体变异。

(四)微生物转化发酵*三、菌种保藏

*利用微生物来进行生物化学反斜面低温保藏法

石蜡油封藏法温度较高

沙土管保藏法灭菌时间较长

款皮保藏法*2.实罐灭菌（实消）

甘油悬液保藏法将培养基置于发酵罐中用蒸汽加

冷冻真空干燥法热，达到预定灭菌温度后，维持

液氮超低温保藏法一定时间，再冷却到发酵温度，

宿主保藏法然后接种发酵,这叫做实罐灭菌,

*典型的发酵设备包括又称分批灭菌。

种子制备设备，主发酵设备，辅*3.连续灭菌：高温短时

助设备（无菌空气和培养基的制连续灭菌法（连消）是指灭菌的

备），发酵液预处理设备，粗产品操作的加热、保温维持、冷却这

的提取设备、产品精制与干燥设三个过程，在同一时间内进行。

备、流出物回收、利用和处理设名词解释

备等。发酵：发酵是用生物催化剂

（二）培养基灭菌方法（biocatalyst）使培养物质转变

对于大量的培养基和发酵设备的成产品的生物化学反应过程。

灭菌，最有效、最常用的灭菌方前体物质：在药物的生物合成过

法是蒸汽灭菌（即湿热灭菌）。程中，被菌体直接用于药物合成

*空罐灭菌（空消）而自身结构无显著改变的物质称

*实罐灭菌（实消）为前体

*连续灭菌：高温短时（连消）初级代谢产物：初级代谢产物是

*1.空罐灭菌（空消）菌体对数生长期产生的产物，这

类产物对菌体生长、分化和繁殖大多数情况下设备要进行严格冲

都是必需的。洗、灭菌，空气不需要过滤。(X)

次级代谢产物：从合成代谢的中

间产物出发，细胞合成的一些生按培养基的形态分，培养基可以

理功能不明确，化学结构特殊，分为固体培养基和液体培养基。

而且对细胞生命并非必须的产(X)

物，这类产物称为次级代谢产物。

次级代谢产物一般在菌体生长的培养基采用(D)时，需在培养

稳定期合成。基进入发酵罐前，直接用蒸汽进

行空罐灭菌。

发酵工业生产上常用的微生物主A、间歇灭菌

要有(B)B、实消

A枯草芽抱杆菌，放线菌，酵母C、连消D、空消

菌，霉菌

B细菌，放线菌，酵母菌，霉菌(B)是在每批培养基全部进流入

C细菌，放线菌，酵母菌，青霉发酵罐后，就在罐内通入蒸汽加

菌热至灭菌温度，维持一定时间，

D金黄葡萄球菌，放线菌，酵母再冷却到接种温度。

菌，霉菌A、连续灭菌B、实消C、连消

D、空消

发酵过程中需要防止杂菌污染，菌种保藏方法中保藏时间最短的

（A）目

A、斜面低温保藏法*发酵过程的中间分析是生产控

B、石蜡油封存法制的指示，它显示了发酵过程中

C、砂土管保藏法微生物的代谢变化，作为分析和

D、冷冻真空干燥保藏法控制发酵情况以及处理异常发酵

的主要依据。

为了避免菌种衰退，应尽量增加四、发酵过程的影响因素及控制

传代次数。（X）*目的：控制影响因素达到最佳发

酵效果，获得最高的产品收率。

*作为种子应具备的条件（P206）△四、发酵过程的影响因素及控

菌种的生长活力强制

生理状态稳定（五）溶氧

菌体总量及浓度能满足大容量发（六）C02

酵罐的要求（七）泡沫

无杂菌污染（八）染菌

保持稳定的生产能力

*发酵周期影响因素（二）营养物质

空罐灭菌、培养基的灭菌、接种、3.磷酸盐：对抗生素发酵，采用

发酵过程、放罐和洗罐等过程，生长亚适量浓度。

所用的时间总和为一个发酵周*4.补料:在发酵过程中补加基质

期。和前体，称为补料

△三、发酵过程中的中间分析项补料的目的是使菌体处于半饥饿

状态。周期分别是什么？

*发酵过程温度的选择有什么依是将发酵培养基组分一次性投入

据？发酵罐，经灭菌、接种和发酵后

菌种及生长阶段再一次性的将发酵液放出的一种

培养条件：如通气的好坏。间歇式发酵操作类型。

菌种生长情况：如生长快慢。延滞期、对数期、稳定期、衰亡

名词解释期

接种量：移种的种子液体积和接发酵工程的内容包括了以下的基

种后发酵罐培养液体积之比称为本步骤

接种量，一般采用5%~15%o菌种的选育

补料：在发酵过程中补加基质和培养基的配置

前体，称为补料。灭菌

连续发酵技术与与分批发酵相种子的扩大培养和接种

比，有哪些优越性？发酵过程

产率和产品质量稳定；分离提纯

机械化和自动化程度高；

减少设备清洗、准备和灭菌时间，(A)可采用高温短时灭菌，培养

提高设备利用率，节省劳动力；基受热时间短,营养成分破坏少。

发酵罐小，易控制反应速率和过A.连消B.实消C.间歇灭菌

程。D.空消

什么是间歇式发酵？间歇培养时造成发酵染菌的原因有很多，尤

细胞生长过程中包括典型的生长以(C)造成染菌较为普遍且严重

A.设备渗漏B.空气带菌初级代谢

C.A+BD.培养基灭菌不彻底能使营养物质转变成机体的结构

物质和对机体具有生理活性作用

控制泡沫的方法有化学消泡和机的物质，或是为机体生长提供能

械消泡两种方法。（X）量的一类代谢。

*代谢调控次级代谢

运用人为的方法对微生物的代谢存在于某些生物中（如某些植物

调节系统进行遗传改造和条件的和微生物），并在一定的生长期内

控制，在保证微生物适当生长的出现的一类代谢。在抵御恶劣环

条件下，建立新的代谢方式，以境、伪装躲避、清除自身毒素和

期按照人们的意志有目的地过量排泄物时很重要。

积累所需的代谢产物，提高生产第八章微生物转化

效率。,微生物转化（microbial

transformation）是微生物通过酶

*代谢工程催化将一种物质（底物）转化成

利用基因工程方法改变代谢流，另一种物质（产物）的化学反应。

扩展和构建新的代谢途径，或将•微生物转化反应的类型和应用

两个相关的代谢途径通过相关酶实例

连接成新的代谢流，这种涉及多（一）氧化反应

个基因的基因工程称为代谢工（二）还原反应

程，或途径工程。（三）水解反应

*一、初级代谢与次级代谢（四）缩合反应

（五）其他胺化反应酰基化反3.反应速度高

应脱竣反应脱水反应4.反应条件温和

•体外蛋白质药物化学修饰的意优点：可在常温常压、接近中性

义pH的水溶液中进行，减少器材损

循环半衰期延长；耗与环境污染。对反应物与产物

免疫原性降低或消失，毒副之立体异构物具有专一性。

作用减小；缺点：易受有机溶剂或极端酸碱

物理、化学和生物稳定性增度的破坏O酶活性易受产物抑制o

强等。•微生物转化常体的特点：

⑴增大药物分子量,避免被肾小1.两阶段发酵

球过滤；阻碍蛋白酶的降解作2.两相发酵

用；（2）屏蔽药物的免疫位点；⑶第九章蛋白质药物的化学修饰

赋予药物优良的理化性质，与药,蛋白质的化学修饰（chemical

物间的化学键在体内随时间水modificationofprotein）：凡

解，缓慢释放药物是通过基团的引入或去除而使蛋

白质一级结构发生改变的过程，

・微生物转化反应的特点：统称为