DB12∕T 840-2018 西瓜种子纯度SSR分子标记鉴定方法

天天津西瓜种子纯度SSR分子标记鉴定方法天津市市场和质量监督管理委员会发布DB1DB12/T840—2018本标准按照GB/T1.12009给出的规则起草。本标准由天津市农村工作委员会提出并归口。本标准起草单位：天津市农业质量标准与检测技术研究所、天津市蔬菜研究中心、黑龙江省农业科学院农产品质量安全研究所。本标准主要起草人：兰青阔、焦定量、赵新、王成、兰璞、焦荻、商纪鹏、陈锐、关海涛、张耀中、焦贺敏。本标准规定了西瓜种子纯度SSR分子标记鉴定方法的原理、仪器设备及试剂、方法步骤、纯度计算。本标准适用于西瓜单交种的纯度鉴定。下列文件对于本标准的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本标准。凡是不注日期的引用文件，其本标准规定了西瓜种子纯度SSR分子标记鉴定方法的原理、仪器设备及试剂、方法步骤、纯度计算。本标准适用于西瓜单交种的纯度鉴定。下列文件对于本标准的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本标准。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本标准。GB/T6682分析实验室用水规格DB12/T840—2018下列术语和定义适用于本文件。一种在体外通过酶促反应扩増特异DNA片段的技术。由几个核苷酸（1〜6个）为重复单位聚集而成的长达几十个至几百个bp(般为100〜200)的串联重复序列，又称微卫星序列或短串联重复序列，其高度多态性主要来源于串联数目的不同。种子在SSR分子标记带型方面典型一致的程度，用具有本品种特异带型的种子粒数占鉴定样品种子粒数的百分率表示，以反映某品种特征特性的一致性程度。以蛋白质、核酸分子的多态性为基础，鉴定生物在遗传上的差异。SSR分布于西瓜整个基因组，每个位点上重复单位的数目不同造成了品种间的多态性，利用PCR技术将多态的SSR扩増出来，通过电泳检测扩増产物，利用电泳图谱进行西瓜种子纯度鉴定。西瓜种子纯度SSR分子标记鉴定方法微量加样器；磁力搅拌器；台式离心机；紫外-可见成像系统；胶片观察灯；水平摇床；高压灭菌锅； 水或符合GB/T6682规定的一级水等。除特殊说明外，所用试剂均为分析纯试剂。相关溶液配制方法见附录A检测样品的分样和保存，应符合GB/T3543.2的规定，从中随机取100粒以上种子，取其父母本材料在玻璃培养皿底部垫上一层厚度约3mm的棉花或滤纸，用水浸湿后均匀地撒上检测样品，再于表面覆盖一层纱布，置于光照培养箱中。培养条件为16h35°C光照培养，8h28°C暗培养，待种子长出子叶后备用。取单株幼苗子叶，放入1.5mL离心管中，在液氮中研碎，放入1.5mL离心管中。将DNA提取液预热到65°C，每管放入400混合样品，将离心管置于65°C金属浴或水浴锅DB12/T840—2018DB12DB12/T840—2018以筛选出来的SSR分子标记为引物扩増送检样品的DNA，通过带型统计，用具有本品种特异带型的种子粒数占检测样品种子粒数的百分率表示纯度，计算公式如下：具有本品种特异带型的种子粒数检测样品种子粒数X°用28对核心引物进行PCR反应，扩増双亲及送检样品各10份DNA，筛选带补性好的引物作为纯度鉴定的SSR分子标记。混匀。按照附录C规定的方法，进行4.5%变性聚丙烯酰胺凝胶制作及电泳检测扩増产物。丙烯酰胺190g，甲叉双丙烯酰胺10g，定容至500mL。尿素450g，10X电泳缓冲液100mL，40%丙烯酰胺胶112.5mL，定容至1000mL。20pL亲和桂焼，20^L冰醋酸，加无水乙醇至2mL。现用现配。DB12/T840—2018汽灭菌后使用。按照引物合成单的说明先配制100^mol/L的储存液，取适量储存液稀释40倍，配制浓度为2.5mmol/L的使用液。附录A1mL剥离桂焼，49mL二氣甲焼。0.1g过硫酸铵溶于1mL超纯水中。现用现配。200200mL冰醋酸，定容至2000mL4g硝酸银，定容至2000mL2000mL蒸馈水中加入40g氢氧化钠和10mL甲酸。DB12/T840—2018表B.128对核心引物表表B.128对核心引物表DB12/T840—2018(规范性附录）28对核心引物28对核心引物见表B.1。DB12/T840—2018待胶凝固后，拔出梳子，将电泳槽组装好，待胶凝固后，拔出梳子，将电泳槽组装好，用洗耳球吹洗加样槽，清除气泡和杂质。每个加样孔加入5^L变性后的PCR产物。80W恒功率电泳至上部的指示带（二甲苯青）到达胶板的中部。电泳结束后，小心分开两块玻璃板，凝胶紧贴在长板上。将长板