2023年微生物学实验教案

微生物学实验报告要求

实验报告，就是在某项科研活动或专业学习中，实验者把实验的目

的、方法、步骤、结果等，用简洁的语言写成书面报告。

实验报告必须在科学实验的基础上进行。成功的或失败的实验结果

的记载，有利于不断积累研究资料，总结研究成果，提高实验者的观察

能力、分析问题和解决问题的能力，培养理论联系实际的学风和实事求

是的科学态度。

1、实验报告要求

实验报告书写使用实验中心统一实验报告纸。

主要内容有：

(1)实验名称

要用最简练的语言反映实验的内容。

(2)实验目的

要明确，抓住重点，可以从理论和实践两个方面考虑。在理论上，

验证定理定律，并使实验者获得深刻和系统的理解，在实践上，掌握仪

器或器材的使用技能技巧。

(3)实验原理

要写明依据何种原理、定律或操作方法进行实验

(4)仪器和材料

选择主要的仪器和材料填写。如能画出实验装置的结构示意图，再

配以相应的文字说明更好。

(5)操作步骤

要写明经过哪几个具体实验操作步骤，也可用流程图说明；实验报

告要简明扼要、字迹整洁。同预习报告一样左边写步骤，右边写实验现

(6)实验结果

从实验中测到的数据计算结果，或从图像中观察实验结果。

(7)分析与讨论

结果即根据实验过程中所见到的现象和测得的数据，做出结论。

讨论可写上实验成功或失败的原因，对实验中的异常现象、实验(设

计)后的心得体会、改进建议等等。

2、报告撰写时的注意事项

写实验报告是一件非常严肃、认真的工作，要讲究科学性、准确性、

求实性。在撰写过程中，常见错误有以下几种情况：

(1)观察不细致，没有及时、准确、如实记录。

在实验时，由于观察不细致，不认真，没有及时记录，结果不能准

确地写出所发生的各种现象，不能恰如其分。实事求是地分析各种现象

发生的原因。故在记录中，一定要看到什么，就记录什么，不能弄虚作

假。为了印证一些实验现象而修改数据，假造实验现象等做法，都是不

允许的。

(2)说明不准确，或层次不清晰。

(3)尽量采用专用术语来说明事物。例如：“用搅拌棒在混合物里转动”

一语，应用专用术语“搅拌”较好，既可使文字简洁明白，又合乎实验的

情况。

(4)外文、符号、公式不准确，没有使用统一规定的名词和符号。

(5)学生应独立完成实验报告的书写，严禁抄袭、复印。一旦发现抄

袭、复印的实验报告，该学生实验报告成绩为。分。

实验一显微镜油浸系物镜的使用

一、实验目的和内容

目的：复习显微镜低倍镜和高倍镜的使用技术，了解油浸系物镜的基本

原理，掌握油浸系物镜的使用方法。

内容：1、学习油浸系物镜的使用方法。

2、用油镜观察枯草芽泡杆菌或金黄色葡萄球菌染色装片。

二、实验材料和用具

枯草芽抱杆菌（5ac〃/ussubitilis）,金黄色葡萄球菌（Ss加zy/ococcus

的染色装片。香柏油、二甲苯、显微镜、擦镜纸。

三、操作步骤

（一）观察前的准备

1、将显微镜置于平稳的实验台上，镜座距实验台边沿约为4cm。坐正，

用左眼观察。

2、调节光源：将低倍物镜转到工作位置，把光圈完全打开，聚光器升

至与载物台相距约1mm左右。转动反光镜采集光源，光线较强的天然

光源宜用平面镜，光线较弱的天然光源或人工光源宜用凹面镜，对光至

视野内均匀明亮为止。观察染色装片时，光线宜强；观察末染色装片时，

光线不宜太强。

（二）低倍镜观察染色装片

首先上升镜简，将枯草芽抱杆菌染色装片置于载物台上，用标本夹

夹住，将观察位置移至物镜正下方，物镜降至距装片0.5cm处，适当缩

小光圈然后两眼从目镜观察，转动粗调节器使物镜逐渐上升（或使镜台下

降）至发现物像时，改用细调节器调节到物像清楚为止。移动装片，把合

适的观察部位移至视野中心。

（三）高倍镜观察

眼睛离开目镜从侧面观察，旋转转换器，将高倍镜转至正下方，注

意避免镜头与玻片相懂。再由目镜观察，仔细调节光圈，使光线的明亮

度适宜。用细调节器校正焦距使物镜清晰为止。将最适宜观察部位移至

视野中心，绘图。不要移动装片位置，准备用油镜观察。

（四）油镜观察

1、提起镜筒约2cm,将油镜转至正下方。在玻片标本的镜检部位（镜头

的正下方）滴一滴香柏油。

2、从侧面注视，小心慢慢降下镜筒，使油镜浸在油中至油圈不扩大为

止，镜头几乎与装片接触，但不可压及装片，以免压碎玻片，损坏镜头。

3、将光线调亮，左眼从目镜观察，用粗调节器将镜筒徐徐上升（切忌反

方向旋转），当视野中有物像出现时，再用细调节器校正焦距。如因镜头

下降未到位或镜头上升太快末找到物像，必须再从侧面观察，将油镜降

下，重复操作直至物像看清为止。仔细观察并绘图。

4、再次观察提起镜筒，换上金黄色葡萄球菌染色装片，依次用低倍镜、

高倍镜和油镜观察，绘图。重复观察时可比第一次少加香柏油。

（五）镜检完毕后的工作

1、移开物镜镜头。

2、取出装片。

3、清洁油镜，油镜使用完毕后，须用擦镜纸擦去镜头上的香柏油，再

用擦镜纸沾少许二甲苯擦掉残留的香柏油，最后再用干净的擦镜纸擦干

残留的二甲苯。

4、擦净显微镜，将各部分还原。将接物镜呈“八”字形降下，不可使其正

对聚光器，同时降下聚光器，转动反光镜使其镜面垂直于镜座。最后套

上镜罩，对号放入镜箱中，置阴凉干燥处存放。

四、注意事项

1、不准擅自拆卸显微镜的任何部件，以免损坏。

2、拿显微镜时，一定要右手拿镜臂，左手托镜座，不可单手拿，更不

可倾斜拿。

3、下降镜头时，一定要从侧面注视，切忌用眼睛对着目镜，边观察

边下降镜头的错误操作，以免压碎玻片而损坏镜头。

4、观察标本时，必须依次用低、中、高倍镜，最后用油镜。特别在使

用油镜时，切不可使用粗调节器，以免压碎玻片或损伤镜面。使用油镜

后，及时用二甲苯清洁油镜和载玻片。使用二甲苯擦镜头时，注意二甲

苯不能过多，以防溶解固定透镜的树脂。

5、注意保持显微镜的洁净，对金属部分要用软布擦拭，擦镜头必须用

擦镜纸，切勿用手或用普通布、纸等，以免损坏镜头。

6、显微镜应存放在阴凉干燥处，以免镜片滋生霉菌而腐蚀镜片。

五、实验报告

分别绘出在高倍镜和油镜下观察到的枯草芽抱杆菌及金黄色葡萄球

菌的形态，注明物、目镜放大倍数和总放大率。

六、问题和思考

1、使用油镜应特别注意哪些问题？为什么必须用香柏油？

2、使用显微镜绘图时，眼睛的位置。

3、镜检标本时，为什么先用低倍镜观察，而不是直接用高倍镜或油镜

观察？

4、转到高倍镜和油镜时，对照明度有何要求？应如何调节？

显微镜的基本结构与原理

普通光学显微镜由机械和光学两大部分组成。

1、机械部分

(1)镜简

镜筒上端装目镜，下端接转换器。镜筒有单筒和双筒两种。单筒有

直立式和后倾式两种。双筒全是倾斜式的，其中一个筒有屈光度调节装

置，以备两眼视力不同者调节使用。两筒之间可调距离，以适应两眼宽

度不同者调节使用。

(2)物镜转换器

转换器装在镜筒的下方，其上有3个孔，甚至4个或5个孔，用于

安装不同规格的物镜。

(3)镜台(载物台)

又称镜台，是放置标本的地方，多数为方形和圆形的平台，中央有

一通光孔；载物台上有移动器，作用是夹住和移动标本，转动螺旋可使

标本前后和左右移动，其上的刻度标尺可指明标本所在位置。

(4)镜臂

镜臂支撑镜筒、载物台、聚光器和调节器。镜臂有固定式和活动式

(可改变倾斜度)。

(5)镜座

镜座连接镜臂，支撑整台显微镜，其上有反光镜。

(6)调焦装置

调节物镜和被观察物体之间距离的机件。有镜臂调节器和镜台调节

器两种，前者通过升降镜臂来调焦距，后者通过升降载物台来调焦距。

包括大、小螺旋调节器各一个，前者又称粗调节器，后者也叫微调节器,

通过调节器调焦，可清晰地观察到标本。

2、光学部分

(1)物镜

是接近被观察物品(标本)的镜头，亦称接物镜。根据物镜的放大

倍数和使用方法的不同，分为低倍物镜、高倍物镜和油镜三种，低倍物

镜有4x、10x、20x；高倍物镜有40x和45x；油镜有90x、95x和100x

等。数字越大，放大倍数越高。

(2)目镜

是接近观察者的眼睛的镜头，亦称接目镜。把经物镜放大的实像再

放大一次，并映入观察者的眼中。通常有5x、10x、16x等规格。

(3)聚光器

安装在载物台下，能将平行的光线聚焦于标本，增强照明度。聚光

器可以升降。

(4)反光镜

是普通光学显微镜的取光设备，使光线射向聚光镜，分平、凹两面。

(5)内光源

是较好的光学显微镜自身带有的照明装置，安装在镜座内部，由强

光灯泡发出光线，通过安装在镜座的集光镜射入聚光镜。

油镜的基本原理

(一)油镜头的辨认

油镜头上常刻有OI(oilimmersion)或HI(homogeneneousimmersion)

字样，有的还刻有一圈红线或黑线标记，在低倍物镜、高倍物镜和油镜

3物镜中，油镜的放大倍数和数值孔径（numericalaperture）最大，而工

作距离最短。

（二）显微镜的分辨率

显微镜性能的优劣不单是看它的总放大倍数，更重要的是看它分辩

率的大小。分辨率是指显微镜能分辨出物体两点间最小距离（D）的能

力。D值愈小表明分辨率愈高。D值与光线的波长（入）成正比，与物镜

的数值孔径（NA）成反比。

从上式可看出，缩短光波长和增大数值孔径都可提高分辨率。

数值孔径指光线投射到物镜上的最大角度（称镜口角，a）的一半

正弦与介质折射率（n）的乘积；

a

N7AA=nxsm•——

2

影响数值孔径大小的因数，一是镜口角，二是介质的折射率。

当镜与装片之间的介质为空气时，由于空气（n=1.52）的折射率不

同，光线会发生折射，不仅使进入物镜的光线减少，降低了视野的照明

度，而且会减少镜口角（图5—2A）。当以香柏油（n=L515）为介质时,

由于它的折射率与玻璃相近，光线经过载玻片后可直接通过香柏油进入

物镜而不发生折射，不仅增加了视野的照明度，更重要的是通过增加数

值孔径达到提高分辨率的目的。可见光的波长平均为0.55|im。当使用数

值孔径为0.65的高倍镜时，它能辨别两点之间的距离为0.42）im；而使

用数值孔径为1.25的油镜时，能辨别两点之间的距离则为0.22|im。

4眼睛

光学显微镜的成像原理（倒立的虚像）。介质为空气与介质为香柏油时

光线通过的比较。

油镜使用的原理

油镜，即油浸接物镜。当光线由反光镜通过玻片与镜头之间的空气

时，由于空气与玻片的密度不同，使光线受到曲折，发生散射，降低了

视野的照明度。若中间的介质是一层油（其折射率与玻片的相近），则

几乎不发生折射，增加了视野的进光量，从而使物象更加清晰。

实验二细菌的革兰氏染色

一、目的要求

1.学习并初步掌握细菌的革兰氏染色法。

2.了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。

二、实验材料

1.菌种：金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)大肠杆菌(E.coli)

2.试剂：草酸铁结晶紫、路哥氏碘液、95%乙醇、番红液

3.其他：显微镜、载玻片、接种环、酒精灯、无菌水、香柏油、二甲

苯等。

三、实验原理

革染氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。是1884年由丹麦病

理学家ChristainGram创立的。通过革兰氏染色可把细菌区分为两大类。

革染氏染色的基本步骤：先用结晶紫初染、次经碘液媒染、再用95%

乙醇脱色、最后用蕃红复染。经过此法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色

的细菌为革染氏阳性菌；如果细胞染上复染的红色的细菌为革染氏阴性

菌。大肠杆菌是标准的革染氏阴性菌，金黄色葡萄球菌是标准的革染氏

阳性菌。

革染氏染色的机理，与细菌细胞壁的化学组成和结构有关。经结晶

紫初染以后，所用的细菌都被染成蓝紫色。碘作为媒染剂，它能与结晶

紫结合形成复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。当用乙醇脱色时,

两类细菌的脱色效果是不同的，革染氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖

形成的网状结构组成、壁厚、类脂含量低，用乙醇脱色处理时细胞壁脱

水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫-碘的复

合物不易被洗脱而保留在细胞内；革染氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖层

在内层且较薄、类脂含量高，所以当脱色处理时，类脂被乙醇溶解、细

胞壁透性增加，使结晶紫-碘的复合物被洗脱出来。用蕃红复染时染上红

色。

四、操作步骤

1.细菌的活化：将细菌接种营养琼脂斜面，培养约24h。

2.制片：取菌种培养物常规涂片、干燥、固定。

3.初染：于制片上滴加结晶紫染液，染色Imin后，用水洗去剩余染料。

4.媒染：用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约Imin,水洗。

5.脱色：用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，直

接用95%乙醇从载玻片上端冲洗脱色，直到流下的酒精无明显的紫

色时，立即水洗。酒精的浓度、用量及涂片厚度都会影响脱色速度。

脱色是革兰氏染色中最关键的一步。

6.复染：滴加番红液，染色2min,水洗。

7.用滤纸吸干，油镜镜检。

五、注意事项

为了保证革染氏染色结果的正确性，制片过程中要注意：要选用活

跃生长的幼培养物作革染氏染色，涂片不宜过厚，火焰固定不宜过热，

脱色时间的控制。另外，可选用标准的革染氏阳性菌和革染氏阴性菌和

未知菌一起混合涂片和染色。

六、实验内容

1.分别对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌进行革兰氏染色

2.对上述两种菌进行混合涂片，再进行革兰氏染色。

七、实验报告

1.图示所观察到的菌体细胞的形态与革兰氏染色结果；

2.在下表中依次填入革兰氏染色所用染料的名称，并填上革兰氏阳性

和革兰氏阴性菌在每步染色后菌体所呈的颜色。在不影响革兰氏反

应的前提下，哪一步可被省略？

3.填写下列表格

步骤所用染料菌体所呈颜色

革兰氏阳性菌革兰氏阴性菌

1

2

3

4

实验三（上）酵母菌细胞大小的测定

一、实验目的

1.了解测量微生物大小的原理；

2.学习并掌握接目测微尺的校正方法及微生物大小的测定方法，增强

微生物细胞大小的感性认识。

二、实验材料

1.菌种：啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)菌悬液。

2.仪器或其他用具：显微镜，目镜测微尺，镜台测微尺，载玻片，盖

玻片

三、实验原理

微生物细胞的大小是微生物基本的形态特征，也是分类鉴定的依据

之一。微生物细胞个体较小，需要在显微镜下借助于特殊的测量工具一

测微尺来测定其大小。测微尺包括镜台测微尺和目镜测微尺。

镜台测微尺是一张中央部分刻有精确等分线的载玻片，专门用于校

定接目镜测微尺每小格的相对长度。通常，刻度的总长是1mm,被等分

为100格，每格0.01mm(即10|im)。镜台测微尺不直接用来测量细胞

的大小。

目镜测微尺是一块可以放入接目镜的圆形小玻片，其中央有精确的

等分刻度，有等分为50小格和100小格的两种。在测量时将目镜测微

尺放在目镜的隔板上，即可来测量经显微镜放大后的细胞物象。也有专

用的目镜，里面已经安放好了目镜测微尺。

由于目镜测微尺所测量的是经显微镜放大后的细胞物象，因此，在

不同的显微镜或不同的目镜和物镜组合放大倍数不同，目镜测微尺每一

小格所代表的实际长度也不一样。所以，在用目镜测微尺测量微生物大

小之前，必须先用镜台测微尺校定目镜测微尺，以确定该显微镜在特定

放大倍数的目镜和物镜下，目镜测微尺每一小格所代表的实际长度，然

后根据微生物细胞相当于的目镜测微尺格数，计算出微生物细胞的实际

大小。

四、操作步骤

1.装目镜测微尺：取下显微镜的目镜，换上专用目镜。如果没有专用

的目镜，则取下显微镜的目镜，旋下透镜，将目镜测微尺刻度朝下

放在目镜的隔板上，再旋上目镜透镜，将装有测微尺的目镜装回镜

筒。

2.目镜测微尺的标定：

1）放镜台测微尺：将镜台测微尺刻度面朝上固定在显微镜的载物台上，

注意不可放反。

2）标定：将低倍镜转入光路，镜台测微尺有刻度的部分移至视野中央，

调节焦距，当清晰地看到镜台测微尺的刻度后，转动目镜使目镜测微

尺与镜台测微尺的刻度相平行。利用移动钮移动镜台测微尺，使两尺

在某一区域内两线完全重合，然后分别数出两重合线之间镜台测微尺

和目镜测微尺所占的格数。（使目镜测微尺的一条刻度线与镜台测微

尺的一条刻度线相重合，再寻另一重合线，分别数出其间镜台测微尺

和目镜测微尺所占的格数）

3）用同样的方法，分别在高倍镜和油镜下对目镜测微尺进行标定。（观

察时光线不宜过强，否则难以找到镜台测微尺的刻度，换高倍镜和油

镜标定时，务必十分细心，防止接物镜压坏镜台测微尺和损坏镜头）

4）计算：已知镜台测微尺每格长10叩1,根据下列公式即可分别计算出

在不同放大倍数下，目镜测微尺每格所代表的长度。

目镜测微尺每格长度（gm）=10n/m

n：两重合线间镜台测微尺格数

m：两重合线间接目测微尺格数

3.微生物细胞大小的测量

目镜测微尺标定完毕后，取下镜台测微尺，换上微生物标本片，将

其固定在载物台上，先用低倍镜找到标本片图象，然后根据不同的微生

物对象分别转换到高倍镜或油镜下，用目镜测微尺测量微生物细胞的直

径或宽和长所占的格数，再依据所标定的高倍镜或油镜下每一格的实际

长度计算细胞的实际大小。通常测定对数生长期菌体来代表该菌的大

小，为了尽量减小实验误差，应在同一标本片上测量10〜20个细胞，取

其平均值作为该菌的大小。

维护：测量完毕，换上原有的显微镜目镜（或取出目镜测微尺，目

镜放回镜筒），用擦镜纸将测微尺擦拭干净后放回盒内保存，并按照显

微镜的使用和维护方法擦拭物镜。

五、实验内容

1.分别在低倍镜、高倍镜下对目镜测微尺进行标定。

2.高倍镜下测定酿酒酵母细胞的大小。

六、实验报告

1.目镜测微尺标定结果：

低倍镜下一倍目镜测微尺每格长度是gmo

高倍镜下倍目镜测微尺每格长度为Mmo

2.菌体大小测定结果：

酿酒酵母细胞测定结果

菌号目镜测微尺格数实际长度

宽长宽长

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

平均值

实验三（下）酵母菌细胞数量的测定

一、目的要求

1.学习并掌握血球计数板计数的原理；

2.掌握利用血球计数板进行微生物计数的方法。

二、实验材料

1.菌种：酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)麦芽汁培养液

2.其它：显微镜、血球计数板、手动计数器、擦镜纸、吸水纸等

三、基本原理

利用血球计数板在显微镜下直接计数，是一种常用的微生物计数方

法。该方法是将菌悬液放在血球计数板与盖玻片之间容积一定的计数室

中，在显微镜下进行计数，然后根据计数结果计算单位体积内的微生物

总数目。

血球计数板是一块特制的载玻片，其上由4条槽构成3个平台。中

间较宽的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格

网，每个方格网共分为9个大方格，中间的大方格即为计数室。计数室

的边长为1mm,中间平台下陷0.1mm,故盖上盖玻片后计数室的容积为

3

0.1mmo

常见血球计数板的计数室有两种规格：一种是16x25型，即计数室

共分为16个中方格，每个中方格又分为25个小方格；另一种是25x16

型，即计数室先被分成25个中方格，每个中方格又分为16个小方格。

但无论是哪一种规格的血球计数板，其计数室的小方格都是400个。我

们采用的是25x16型。

计数时，通常数5个中方格的总菌数，再换算成1ml菌液中的总菌

数。计算公式：1ml菌液中总菌数=5x104A・B

A为5个中方格中的总菌数，B为稀释倍数。

四、操作步骤

1.菌悬液的制备：以无菌生理盐水将酿酒酵母培养物制成浓度适当的

菌悬液。

2.加样品：将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，再用无菌的毛细滴

管将摇匀的酵母菌悬液由盖玻片边缘滴一小滴，让菌液沿缝隙靠毛

细作用自动进入计数室（注意取样前要摇匀菌液；加样时计数室不

可有气泡产生）。

3.找计数室：加样后静止5min,然后将血球计数板置于显微镜载物台

上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数（注

意调节显微镜光线强弱，使菌体和计数室线条清晰）。

4.显微镜计数：取左上、右上、左下、右下和中央5个中方格进行计

数。位于中方格边线上的菌体一般只计上边和右边线上的（或只计

左边和下边线上的）。如遇到酵母出芽，芽体大小达到母细胞一半以

上时，即作为两个菌体计数。计数一个样品要从上下两个计数室中

得到的平均数值来计算样品的含菌量。

5.清洗血球计数板：使用完毕后，将血球计数板在水龙头上用水冲洗

干净，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹风机吹干。镜检，

观察计数室内是否有残留菌体或其它沉淀物。若不干净，则必须重

复洗涤至干净为止。

五、实验内容

按上述方法及步骤测定所给酿酒酵母培养液的细胞浓度。

六、实验报告

1.将结果记录于下表中。

各中方格菌数二室

菌数

AB平均

12345/ml

值

第一

室

第二

室

2.根据你的体会，说说用血球计数板计数的误差主要来自哪些方面？

应如何尽量减少误差，力求准确？

3.能否用血球计数板在油镜下对细菌进行计数？为什么？

实验四培养基的制备与灭菌

一、目的要求

1.掌握培养基（牛肉膏蛋白腺培养基）的配置方法。

2.掌握高压蒸汽灭菌的操作方法。

二、基本原理

正确掌握培养基的配制方法是从事微生物学实验工作的重要基础。

由于微生物种类及代谢类型的多样性.因而用于培养微生物的培养基的

种类也很多，它们的配方及配制方法虽各有差异。但一般培养基的配制

程序却大致相同.例如器皿的准备，培养基的配制与分装，棉塞的制作，

培养基的灭菌，斜面与平板的制作以及培养基的无菌检查等基本环节大

致相同。

三、实验材料

1.药品：待配各种培养基的组成成分、琼脂、lmol/L的NaOH和HC1

溶液。

2.仪器及玻璃器皿：天平、高压蒸汽灭菌锅、移液管、试管、烧杯、

量筒、三角瓶、培养皿等。

3.其他物品：药匙、称量纸、pH试纸、记号笔、棉花等。

四、操作步骤

（一）玻璃器皿的洗涤

玻璃器皿在使用前必须洗刷干净。将三角瓶、试管、培养皿、量筒

等浸入含有洗涤剂的水中.用毛刷刷洗，然后用自来水及蒸镭水冲净。

移液管先用含有洗涤剂的水浸泡，再用自来水及蒸镭水冲洗。洗刷干净

的玻璃器皿置于烘箱中烘干后备用。

（二）液体及固体培养基的配制过程

1.液体培养基配制

(I)称量：一般可用0.01g天平称量配制培养基所需的各种药品，先按

培养基配方计算出各成分的用量.然后进行准确称量。

(2)溶解：将称好的药品置于一烧杯中，先加入少量水(根据实验需要

可用自来水或蒸镭水)，用玻璃棒搅动，加热溶解。

(3)定容：待全部药品溶解后，倒入一量筒中，加水至所需体积。如

某种药品用量太少时，可预先配成较浓溶液，然后按比例吸取一定体积

溶液，加入至培养基中。

(4)调pH：一般用pH试纸测定培养基的pH。用剪刀剪出一小段pH

试纸，然后用镶子夹取此段pH试纸，在培养基中蘸一下，观看其pH范

围，如培养基偏酸或偏碱时，可用Imol/LNaoH或Imol/LHCl溶液进行

调节。调节pH时，应逐滴加入NaOH或HCI溶液，防止局部过酸或过

碱，破坏培养基中成分。边加边搅拌，并不时用PH试纸测试，直至达

到所需pH为止。

(5)过滤：用滤纸或多层纱布过滤培养基。一般无特殊要求时，此步

可省去。

2.固体培养基的配制

配制固体培养基时，应将已配好的液体培养基加热煮沸，再将称好

的琼脂(1.5〜2%)加入，并用玻棒不断搅拌，以免糊底烧焦。继续加热至

琼脂全部融化，最后补足因蒸发而失去水分。

(三)培养基的分装

根据不同需要，可将已配好培养基分装入试管或三角瓶内，分装时

注意不要使培养基沾污管口或瓶口，造成污染。如操作不小心，培养基

沾污管口或瓶口时，可用镶子夹一小块脱脂棉，擦去管口或瓶口的培养

基，并将脱脂棉弃去。

1.试管的分装

取一个玻璃漏斗，装在铁架上，漏斗下连一根橡皮管，橡皮管下端

再与另一玻璃管相接，橡皮管的中部加一弹簧夹。分装时，用左手拿住

空试管中部，并将漏斗下的玻璃管嘴插入试管内，以右手拇指及食指开

放弹簧夹，中指及无名指夹佐玻璃管嘴，使培养基直接流入试管内。装

入试管培养基的量视试管大小及需要而定，若所用试管大小为15x150

mm时，液体培养基可分装至试管高度1/4左有为宜；如分装固体或半

固体培养基时，在琼脂完全融化后，应趁热分装于试管中。用于制作斜

面的固体培养基的分装量为管高1/5（约3TmI）,半固体培养基分装量

为管高的1/3为宜。

2.三角瓶的分装

用于振荡培养微生物时，可在250ml三角瓶中加入50ml的液体

培养基；若用于制作平板培养基用时，可在250ml三角瓶中加入150ml

培养基，然后再加入3g琼脂粉（按2%计算），灭菌时瓶中琼脂粉同时被

融化。

（四）棉塞的制作及试管、三角瓶的包扎

为了培养好气性微生物，需提供优良通气条件，同时为防止杂菌污

染，则必须对通入试管或三角瓶内空气预先进行过滤除菌。通常方法是

在试管及三角瓶口加上棉花塞等。

1.试管棉塞的制作

制棉塞时，应选用大小、厚薄适中的普通棉花一块，铺展于左手拇

指和食指扣成的团孔上，用右手食指将棉花从中央压入团孔中制成棉

塞.然后直接压入试管或三角瓶口。也可借用玻璃棒塞入，也可用折叠

卷塞法制作棉塞。

制作的棉塞应紧贴管壁，不留缝隙，以防外界微生物沿缝隙侵入，

棉塞不宜过紧或过松，塞好后以手提棉塞，试管不下落为准。棉塞的2

/3在试管内，1/3在试管外。目前也有采用硅胶塞代替棉塞直接盖在

试管口上。

将装好培养基并塞好棉塞或硅胶塞的试管捆成一捆，外面包上一层

牛皮纸。用记号笔注明培养基的名称称及配制日期，灭菌待用。

2.三角瓶棉塞制作

通常在棉塞外包上一层纱布，再塞在瓶口上。有时为了进行液体振

荡培养加大通气量，则可用8层纱布代替棉塞包在瓶口上，目前也有采

用硅胶塞直接盖在瓶口上。

在装好培养基并塞好棉塞或包扎八层纱布或盖好硅胶塞的三角瓶

口上，再包上一层牛皮纸并用线绳捆好，灭菌待用。

（五）培养基的灭菌

培养基经分装包扎后，应立即按配制方法规定的灭菌条件进行进行

高压蒸汽灭菌。

（六）斜面和平板的制作

1.斜面的制作

将已灭菌装有琼脂培养基的试管，趁热置于木棒或玻棒上，使成适

当斜度，凝固后即成斜面。斜面长度不超过试管长度1/2为宜。如制作

半团体或固体深层培养基时，灭菌后则应垂直放置至凝固。

2.平板的制作

将装在三角瓶或试管中已灭菌的琼脂培养基融化后，待冷至50℃左

右倾入无菌培养皿中。温度过高时，皿盖上的冷凝水太多；温度低于

50℃,培养基易于凝固而无法制作平板。

平板的制作应在火旁进行，左手拿培养皿，右手拿三角瓶的底部或

试管，左手同时用小指和手掌将棉塞打开，灼烧瓶口，用左手大拇指将

培养皿盖打开一缝，至瓶口正好伸入，倾入10〜15mL培养基，迅速盖好

皿盖，置于桌上，轻轻旋转平皿，使培养基均匀分布于整个平皿中，冷

凝后即成平板。

（七）培养基的灭菌检查

灭菌后的培养基，一般需进行无菌检查。最好取出1〜2管（瓶），置

于37℃温箱中培养1〜2天，确定无菌后方可使用。

五、实验内容

1.根据要求清洗各种玻璃器皿，并进行包扎。

2.根据要求配制培养基。（每大组6个人，配制牛肉膏蛋白膝固体平板

6个，斜面2支）

3.用高压蒸汽灭菌锅对所配各培养基灭菌。

六、实验报告

1.为什么微生物实验室所用的三角瓶口或试管口都要塞上棉塞才能使

用？

2.配制培养基时为什么要调节pH?

3.高压蒸汽灭菌为什么比干热灭菌要求温度低、时间短？

附录灭菌技术

一、目的要求

了解消毒和灭菌的原理，并掌握各种灭菌方法的操作步骤。

二、实验材料

1.仪器或其他用具：上述包扎的培养皿、试管，高压蒸汽灭菌锅，

注射器，镶子，玻璃涂棒。

2.培养基：上述配制的培养基

三、基本原理

在微生物实验中，需要进行纯培养，不能有任何杂菌污染，因此必

须对所用器材、培养基和工作场所进行灭菌和消毒。灭菌是指杀死一定

环境中的所有微生物，包括微生物的营养体、芽抱和抱子。实验室常用

的灭菌方法包括直接灼烧、恒温干燥箱灭菌、高压蒸汽灭菌、间歇灭菌、

煮沸灭菌等方法。这些方法的基本原理是通过加热使微生物体内蛋白质

凝固变性，从而达到灭菌的目的。

四、操作步骤

（一）高压蒸汽灭菌

高压蒸汽灭菌是将物品放在密闭的高压蒸汽灭菌锅内，在一定的压

力下保持15〜30分钟进行灭菌。此法适用于培养基、无菌水、工作服等

物品的灭菌，也可用于玻璃器皿的灭菌。

将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌

锅夹套间的水沸腾而产生蒸汽。待水蒸汽急剧地将锅内的冷空气从排气

阀中排尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸汽不能溢出，而增

加了灭菌锅内的压力，从而使沸点增高，获得高于100℃的温度，导致

菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。

在相同的温度下，湿热灭菌的效果好于干热灭菌。有三点原因：在

湿热灭菌中菌体吸收水分，蛋白质容易凝固变性，蛋白质随着含水量的

增加，所需凝固温度降低；湿热灭菌中蒸汽的穿透力比干燥空气大；蒸

汽在被灭菌物体表面凝结，释放出大量的汽化潜热，能迅速提高灭菌物

体表面的温度，从而增加灭菌效力。

实验室常用的灭菌锅有非自控手提式高压蒸汽灭菌锅和自控式灭

菌锅，其结构和工作原理是相同的。本实验介绍的是非自控手提式高压

蒸汽灭菌锅，自控式灭菌锅的使用可参考厂家说明书。具体操作步骤如

下：

1.加水：首先将内层锅取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面没

过加热蛇管，与三角搁架相平为宜。切勿忘记检查水位，加水量过

少，灭菌锅会发生烧干引起炸裂事故。

2.装料：放回内层锅，并装入待灭菌的物品。注意不要装得太挤，以

免妨碍蒸汽流通而影响灭菌效果。装有培养基的容器放置时要防止

液体溢出，三角瓶与试管口端均不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿

包扎的纸而透入棉塞。

3.加盖：将盖上与排气孔相连的排气软管插入内层锅的排气槽内，摆

正锅盖，对齐螺口，然后以对称方式同时旋紧相对的两个螺栓，使

螺栓松紧一致，勿使漏气，并打开排气阀。

4.排气：打开电源加热灭菌锅，将水煮沸，使锅内的冷空气和水蒸汽

一起从排气孔中排出。一般认为当排出的气流很强并有嘘声时，表

明锅内的空气已排尽，沸腾后约需5分钟。

5.升压：冷空气完全排尽后，关闭排气阀，继续加热，锅内压力开始

上升。

6.保压：当压力表指针达到所需压力时，控制电源，开始计时并维持

压力至所需的时间。如本实验中采用O.IMpa,121.5℃,20分钟灭菌。

灭菌的主要因素是温度而不是压力，因此锅内的冷空气必须完全排

尽后，才能关闭排气阀，维持所需压力。

7.降压：达到灭菌所需的时间后，切断电源，让灭菌锅温度自然下降,

当压力表的压力降至“0”后，方可打开排气阀，排尽余下的蒸汽，旋

松螺栓，打开锅盖，取出灭菌物品，倒掉锅内剩水。压力一定要降

至『0"后，才能打开排气阀，开盖取物。否则就会因锅内压力突然下

降，使容器内的培养基或试剂由于内外压力不平衡而冲出容器口，

造成瓶口被污染，甚至灼伤操作者。

8.无菌检查：将已灭菌的培养基放入37℃恒温培养箱培养24h,检查

无杂菌生长后，即可使用。

实验五环境中微生物的检测

、目的要求

1.证明实验室环境与体表存在微生物。

2.比较来自不同场所与不同条件下细菌的数量和类型。

3.观察不同类群微生物的菌落形态特征。

4.体会无菌操作的重要性。

二、基本原理

平板培养基含有细菌生长所需要的营养成分，当取自不同来源的样

品接种于培养基上，在适宜温度下培养1〜2d内每一菌体即能通过很多

次细胞分裂而进行繁殖，形成一个可见的细胞群体集落，称为菌落。每

一种细菌所形成的菌落都有它自己的特点，例如菌落的大小，表面干燥

或湿润、隆起或扁平、粗糙或光滑，边缘整齐或不整齐，菌落透明或半

透明或不透明，颜色以及质地疏松或紧密等。因此，可通过平板培养来

检查环境中细菌的数量和类型。

三、器材

1.培养基肉膏蛋白陈琼脂平板。

2.仪器或其他用具无菌水，接种环，试管架，酒精灯，记号笔，废

物缸。

四、操作步骤

1.写标签

任何一个实验，在动手操作前均需首先将器皿用记号笔做上记号，

写上班级、姓名、日期，本次实验还要写上样品来源（如实验室空气或无

菌室空气或头发等），字尽量小些，写在皿底的一边，不要写在当中，以

免影响观察结果。

培养皿的记号一般写在皿底上。如果写在皿盖上，同时观察两个以

上培养皿的结果，打开皿盖时，容易混淆。

2.实验室细菌检查

(1)空气将一个肉膏蛋白陈琼脂平板放在当时做实验的实验室，移去

皿盖，使琼脂培养基表面暴露在空气中；将另一肉膏蛋白陈琼脂平板放

在无菌室或无人走动的其他实验室，移去皿盖。lh后盖上两个皿盖。

3.人体细菌的检查

(1)手指(洗手前与洗手后)

①分别在两个琼脂平板上标明洗手前与洗手后(班级、姓名.日期)。

②移去皿盖，将未洗过的手指在琼脂平板的表面，轻轻地来回划线，盖

上皿盖。

③用肥皂和刷子，用力刷手，在流水中冲洗干净，干燥后，在另一琼脂

平板表面来回移动，盖上皿盖。

(2)头发

在揭开皿盖的琼脂平板的上方，用手将头发用力摇动数次，使细菌

降落到玻脂平板表面，然后盖上皿盖。

(3)咳嗽

将去皿盖的琼脂平板放在离口约6〜8cm处，对着琼脂表面用力咳

嗽(注意是干咳，不要有太大的气流和口水)，然后盖上皿盖。

4.将所有的琼脂平板翻转，使皿底朝上，放37℃培养箱，培养1〜2d。

五.结果记录方法

⑴菌落计数在划线的平板上，如果菌落很多而重叠，则数平板最后

1/4面积内的菌落数。不是划线的平板，也一分为四，数1/4面积的菌落

数。

（2）根据菌落大小、形状、高度、干湿等特征观察不同的菌落类型。但要

注意，如果细菌数量太多，会使很多菌落生长在一起，或者限制了菌落

生长而变得很小，因而外观不典型，故观察菌落的特点时，要选择分离

得很开的单个菌落。

菌落特征描写方法如下：（参考教科书59面）

①大小大、中、小、针尖状。可先将整个平板上的菌落粗略观察

一下，再决定大、中、小的标准。

②颜色黄色、金黄色、灰色、乳白色、红色、粉红色等。

③干湿情况干燥、湿润、粘稠。

④形态圆形、不规则等。

⑤高度扁平、隆起、凹下。

⑥透明程度透明、半透明、不透明。

⑦边缘整齐、不整齐。

五、实验报告

1.结果

将你自已的平板结果记录于下表中。（4种样品来源，每种分别写5

种类型）

样菌落数菌特征描写

品(近似落大形干高透颜边

来值)类小态湿度明度色缘

源型

2.思考题

⑴比较各种来源的样品，哪一种样品的平板菌落数与菌落类型最多？

(2)人多的实验室与无菌室(或无人走动的实验室)相比，平板上的菌落数

与菌落类型有什么区别？你能解释一下造成这种区别的原因吗？

⑶洗手前后的手指平板，菌落数有无区别？

(4)通过本次实验，在防止培养物的污染与防止细菌的扩散方面，你学到

些什么？有什么体会。

实验六水中细菌学检查

一、目的要求

1.学习水样的采取方法和水样细菌总数测定的方法。

2.了解水源水的平板菌落计数的原则。

二、基本原理

本实验应用平板菌落计数技术测定水中细菌总数。由于水中细菌种

类繁多，它们对营养和其他生长条件的要求差别很大，不可能找到一种

培养基在一种条件下，使水中所有的细菌均能生长繁殖，因此，以一定

的培养基平板上生长出来的菌落，计算出来的水中细菌总数仅是一种近

似值。目前一般是采用普通肉膏蛋白陈琼脂培养基。

三、器材

1.培养基

肉膏蛋白陈琼脂培养基平板，无菌水。

2.仪器或其他用具

灭菌三角烧瓶，灭菌的带玻璃塞瓶，移液枪，灭菌枪头，灭菌试管，

灭菌涂布器等。

四、操作步骤

1.水样的采取

(1)自来水先将自来水龙头用火焰烧灼3min灭菌，再开放水龙头使水

流5min后，以灭菌三角烧瓶接取水样，以待分析。

(2)池水、河水或湖水应取距水面10〜15cm的深层水样，先将灭菌的

带玻璃塞瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻转过来，除去玻璃塞，水即流

入瓶中，盛满后，将瓶塞盖好，再从水中取出，最好立即检查，否则需

放入冰箱中保存。

2.细菌总数测定

(1)自来水

①分别吸取