生物化学实验技能及基本训练102

生物化学实验技能及基本训练YOURLOGO化学实验、公开课、教师说课、教学培训PPT模板第一部分生物化学实验基本技术一、离心分离技术离心分离原理离心是指利用旋转运动的离心力以及物质的沉降系数或浮力、密度的差异进行分离、浓缩和提纯的一种方法。颗粒的沉降速度取决于离心机的转速及其自身与中心轴的距离。按转速不同可将离心机分为常速、高速和超速3类一、离心分离技术2.离心分离基本方法1.差速离心法2.速率区带离心3.等密度梯度离心二、分光光度技术分光光度计的基本原理分光光度计进行比色分析的基本原理是根据朗伯一比尔（Lambert-Beer）定律，这个定律是讨论有色溶液对单色光的吸收程度与溶液浓度及液层厚度间的定量关系，公式为E=kcL式中：E一一消光度（光密度OD，吸光度A);K-－消光系数，仅与入射光波长有关；c一一溶液浓度；L一一液层厚度。二、分光光度技术2.分光光度检测的基本方法(1）样品溶液的配制：对紫外光、可见光或红外光有选择性吸收特性的物质，只需选择适当的溶剂配制成一定浓度范围的样品溶液即可进行分光光度检测。二、分光光度技术2.分光光度检测的基本方法(2）样品检测与定性、定量分析：根据待测物质的吸收光谱特性，选择好入射光线的波长，用蒸馆水或空白液调节好零点，即可进行样品的检测。欲确定待测物质，有下列3种方法。1）将样品溶液在一定条件下（pH、温度、缓冲液等）的吸收光谱（吸光度－波长曲线）与物质的标准吸收光谱（有关手册可以查到）相对照，借以推断样品属于什么物质。二、分光光度技术2.分光光度检测的基本方法(2）样品检测与定性、定量分析：根据待测物质的吸收光谱特性，选择好入射光线的波长，用蒸馆水或空白液调节好零点，即可进行样品的检测。欲确定待测物质，有下列3种方法。2）根据吸收光谱中峰顶与峰谷吸光度比值与相当条件下资料所载的比值相比较，推断样品是何物质。例如：ATP:OD280/OD260=0.85OD250/OD260=0.90AMP:OD250/0D260=0.85OD280/0D260=0.22二、分光光度技术2.分光光度检测的基本方法(3）用分光光度法测定注意事项1）分光光度计滤光性能。2）吸光度值应控制在0.05~1.0。3）正确选用参比溶液，当显色剂及其他试剂均元色而被测溶液中又元其他离子时，可用蒸馆水作参比溶液；如显色剂本身具有颜色，则用显色剂作对照。三、电泳技术各种生物大分子在一定pH条件下，可以成为带电荷的颗粒，这种带电颗粒在电场的作用下向相反电极移动的现象称为电泳。电泳技术广泛应用在生化物质的分析检测中。1.电泳基本原理三、电泳技术各种生物大分子在一定pH条件下，可以成为带电荷的颗粒，这种带电颗粒在电场的作用下向相反电极移动的现象称为电泳。电泳技术广泛应用在生化物质的分析检测中。2.常用的电泳技术(1）薄膜电泳：(2）薄层电泳:(3）凝胶电泳：四、层析分离技术层析法是利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等）尽管各种层析的原理和操作有所不间，但其基本步骤是相同的，包括选择适当的层析材料、上样（点样）、洗脱（展层）、检测鉴定等4个环节。(1）柱层析法：四、层析分离技术尽管各种层析的原理和操作有所不间，但其基本步骤是相同的，包括选择适当的层析材料、上样（点样）、洗脱（展层）、检测鉴定等4个环节。(2)纸层析法：纸层析法又称纸色谱法，是以纸为载体的色谱法。四、层析分离技术(2)纸层析法：纸层析法又称纸色谱法，是以纸为载体的色谱法。1）原理纸层析法是依据极性相似相溶原理，以滤纸纤维的结合水为固定相，以有机溶剂作为流动相的分离方法2）操作方法。将试样点在纸条的一端，然后在密闭的槽中用适宜溶剂展开，最后形成互相分离的斑点。四、层析分离技术(3）离子交换层析法：离子交换层析法是以具有离子交换性能的物质作固定相，利用它与流动相中的离子能进行可逆的交换来分离离子型化合物的一种方法。基本原理：离子交换层析中，基质是由带有电荷的树脂或纤维素组成。带有正电荷的称之为阴离子交换树脂，带有负电荷的称之阳离子交换树脂。四、层析分离技术(4)凝胶层析法：凝胶层析法适用于分离和提纯蛋白质、酶、多肽、激素、多糖、核酸类等物质。1）凝胶层析法原理。四、层析分离技术(4)凝胶层析法：凝胶层析法适用于分离和提纯蛋白质、酶、多肽、激素、多糖、核酸类等物质。2）凝胶层析的基本技术。凝胶的选择与处理：凝胶的处理：其过程为吸水溶胀→除去微小颗粒→减压排气等。凝胶层析的基本过程：凝胶层析常采用柱层析，其操作方法与其他柱层析相似，包括装柱、加样、洗脱收集飞检测等。层析柱如图3所示。第二部分生物化学实训实训一血清蛋白醋酸薄膜电泳实训一

血清蛋白醋酸薄膜电泳一、目的要求(1）了解醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白的原理。(2）掌握醋酸纤维薄膜电泳的操作方法。二.原理电泳是指带电粒子在电场中向相反电极移动的现象。蛋白质分子在溶液中的电泳是由于蛋白质的分子具有一些可解离的基团，因而在某种pH值溶液中蛋白质分子就带有一定电荷。实训一

血清蛋白醋酸薄膜电泳三、试剂和器材试剂(1)pH值8.6巴比妥缓冲液：巴比妥纳12.76g，巴比妥1.66g，溶于蒸馆水，定容至1000mL。(2）染色液：氨基黑10B5g溶于水400mL，甲醇500mL，冰醋酸100mL中。(3）漂洗液：959毛乙醇450mL，冰醋酸50mL，水500mLo(4）透明液：无水乙醇7份，冰醋酸3份。(5）洗脱液：0.4mol/LNaOH溶液。(6）动物血清（制备时要无溶血现象）。实训一血清蛋白醋酸薄膜电泳三、试剂和器材2.器材醋酸纤维素薄膜（2cmX8cm）、常压电泳仪和电泳槽、点样器（盖玻片）,培养皿（染色及漂洗用）、滤纸、剪刀、慑子（元齿）、玻璃板、白瓷反应板、分光光度计、吹风机、铅笔。实训一血清蛋白醋酸薄膜电泳四、操作步骤准备用慑子取醋酸纤维薄膜1张（识别出光泽面与无光泽面，并在无光泽面角上用铅笔做上记号）放在缓冲液中浸泡20min。若放在缓冲液中后迅速润湿，整条薄膜色泽深浅一致，则表明薄膜质地均匀；若润湿时，薄膜出现深浅不一的条纹或斑点等，则为薄厚不匀的薄膜。实验中应选用质地均匀的薄膜，因为纤维素薄膜的质量对电泳的结果影响很大。实训一血清蛋白醋酸薄膜电泳四、操作步骤2.点样把膜条从缓冲液中取出夹在两层粗滤纸内吸干多余的液体，然后平铺在玻璃板上（元光泽面朝上），将点样器先在白瓷板上的血清中蘸一下，再在膜条一端2~3cm处轻轻地水平落下并随即提起这样即在膜条上点上了细条状的血清样品。实训一血清蛋白醋酸薄膜电泳四、操作步骤3.电泳在电泳槽内加入缓冲液使两个电极槽内的液面等高将膜条元光泽面向下平悬于电泳槽支架的滤纸桥上（先剪裁尺寸合适的滤纸条，取双层滤纸条附着在电泳槽的支架上，使它的一端与支架的前沿对齐，而另一端浸入电极槽的缓冲液内.膜条上点样的一端靠近负极，盖严电泳室，通电，调节电压至160V，电流强度0.4~0.7mA/cm膜宽，电泳时间为40~60min，待电泳区带展开3~5cm时关闭电源。实训一血清蛋白醋酸薄膜电泳四、操作步骤4.染色和漂洗电泳完毕后将膜条取下并放在染色液中浸泡10min。将膜条从染色液中取出，置漂洗液中漂洗数次至无蛋白区底色脱净为止，可得色带清晰的电泳图谱。5.结果判断一般经漂洗后，薄膜上可呈现清晰的5条区带，由正极端起，依次为清蛋白、αl球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白和γ球蛋白。实训一血清蛋白醋酸薄膜电泳五、结果方法一：将上述漂净的薄膜用滤纸吸干剪下各种蛋白质色带分别浸于4.0mL洗脱液（37℃）中5~10min，色泽浸出后，比色（590nm）。设各部分的光密度分别为：OD清、ODα1飞ODα2、ODβ、ODγ。则光密度总和OD总为实训一血清蛋白醋酸薄膜电泳五、结果方法二：把薄膜放在滤纸上用电吹风吹干待薄膜完全干燥后，浸入透明液中5~10min，取出，平贴于干净玻璃片上，自然干燥或用电吹风冷风吹干，即得背景透明的电泳图谱，可用刀片刮开并从玻板上取下图谱。可用光密度计测定各蛋白斑点。此图谱可长期保存。实训一血清蛋白醋酸薄膜电泳(1）血清样品为何点在负极端？(2）总结醋酸纤维薄膜用作电泳支持物的特点。思考題:实训二双缩服法测定蛋白质含量实训二

双缩服法测定蛋白质含量一、目的要求(1）掌握双缩腮法测定蛋白质浓度的原理和标准曲线的绘制方法。(2）熟悉双缩腺法测定蛋白质浓度的实验操作。二、原理双缩服（NH2CONHCONH2）在碱性溶液中与硫酸铜反应生成紫红色化合物，称为双缩服反应；蛋白质分子中含有许多肤键，在碱性溶液中也能与Cu2＋反应产生紫红色化合物。在一定范围内其颜色的深浅与蛋白质浓度成正比。因此，可以利用比色法测定蛋白质浓度。实训二

双缩服法测定蛋白质含量三.试剂和器材1.试剂6mol/LNaOH溶液：称取240g氢氧化纳溶于1000mL水中。0.9%NaCl溶液：称取9g氯化纳溶于1000mL水中。蛋白质标准液（10mg/mL）：称取干燥的牛血清蛋白100.0mg，以少量生理盐水溶解后倒入10mL容量瓶中，淋洗称量瓶数次，一并倒入容量瓶中，最后加生理盐水至刻度线，或用凯氏定氮法测定血清蛋白质含量，然后稀释成10mg/mL作为蛋白质标准液。双缩腺试剂：称取CuS04·5H203.0g，酒石酸饵纳9.0g和腆化饵5.0g，分别溶解后混匀，加6mol/LNaOH100mL，最后加水至1000mL，贮于棕色瓶中，避光，可长期保存。待测血清：将人血清或动物血清用生理盐水稀释10倍。2.器材试管、移液管（1mL,10mL）、水浴锅、721型分光光度计、坐标纸、分析天平。实训二

双缩服法测定蛋白质含量四、操作步骤取试管7支，按下表操作。各管混匀，放置37℃水浴中保温20min.540nm比色，以空白管调零点，读取各管吸光度值。实训二

双缩服法测定蛋白质含量六、思考题(1）绘制标准曲线时的注意事项有哪些？(2）双缩服法有何特点？实训三动物组织核酸的提取与鉴定实训三

动物组织核酸的提取与鉴定一、目的要求(1）掌握从动物组织中提取核酸的实验原理。(2）熟练掌握从动物中提取核酸的实验技术。二、原理核酸是广泛存在于生物细胞内的一类高分子物质。在细胞核内核酸通常与某些组织蛋白质结合成复合物，即以脱氧核糖核蛋白（DNP）和核糖核蛋白（RNP）的形式存在，在提取过程中这两种核蛋白会混在一起。实训三

动物组织核酸的提取与鉴定三、试剂和器材试剂(1)0.14moVLNaCl-0.01moVLEDTA溶液（pH7.0）：称取NaCl8.18ι乙二胶四醋酸二纳盐3.27g，加蒸馆水溶解，调pH至7，定容至1000mL。(2)250g/LSDS溶液：称取十二烧基硫酸纳25g，溶于50%乙醇中，定容至100mL。(3)2moVLNaCl溶液：称取11.7gNaCl，用蒸馅水配成100mL溶液。(4)氯仿－异戊醇：氯仿24份与异戊醇1份混合。(5)95%乙醇。(6）动物肝脏。2.器材紫外分光光度计、玻璃匀浆器、离心机、恒温水浴锅、玻棒、量筒、吸管、三角瓶、烧杯等。实训三

动物组织核酸的提取与鉴定四、操作步骤提取DNA(1）选取鸡或兔肝脏为实验材料，实验动物应在实验前饥饿1~2d，使肝糖原含量降低以免干扰试验。(2）将实验动物放血处死，取其肝脏或肾脏（约2剖，浸于预冷至0℃的0.14moVLNaCl一0.01moVLEDTA中，除去脂肪、血块等杂物，反复洗几次，用滤纸吸干水分。(3）低温下将组织剪碎，加入7mL0.14moVLNaCl-0.01moVLEDTA溶液混匀，在玻璃匀浆器中捣至大部分细胞破碎为止。(4)2500r/min离心15min，弃上层液体，向沉淀中再加入0.14moVLNaCl-0.01moVLEDTA液混匀再次离心洗涤。实训三动物组织核酸的提取与鉴定四、操作步骤提取DNA(5）经洗涤后的沉淀，加入3mL0.14mol/LNaCl-0.01mol/LEDTA边搅拌边缓缓滴入250g/LSDS0.4mL，转入匀浆器内匀浆使沉淀悬浮均匀再加入2mol/LNaCl4mL，此时由于大分子DNP的溶出，溶液由教稠变稀薄。(6）转入三角瓶，加入等容积的氯仿－异戊醇8mL剧烈振摇15min0将混合液于3000r/min离心10min。上层为水溶液，下层为氯仿，中间层为变性蛋白。吸出上层水溶液，加入等体积的氯仿－异戊醇，剧烈振摇15min再于3000r/min离；Ù•lOmin,如此重复直至中间蛋白层消失。(7）取上层水溶液，加入2倍体积959毛乙醇，边加边用玻棒搅拌此时可不断见到有结稠状物质（DNA）逐渐缠于玻棒上，尽量将水分在玻璃壁上挤干，然后溶于1mL2mol/LNaCl溶液中，留作定量、电泳用。实训三动物组织核酸的提取与鉴定四、操作步骤2.测定DNA(1）吸取5μLDNA样品，加水至1mL（稀释200倍），混匀后用石英比色杯进行吸光度值测定。(2）分光光度计先用1mL蒸馆水校正零点，在260nm处读出样品吸光度值。如果A2旷A2&0比值大于1.8，说明存在RNA，可以考虑用RNA酶处理样品；比值小于1.6，说明样品中存在蛋白质，应再次抽提，之后用乙醇沉淀纯化DNA。五、结果把实验结果代入下面公式中：样品中DNA的浓度＝A260x核酸稀释倍数x50/1000实训三动物组织核酸的提取与鉴定五、结果把实验结果代入下面公式中：样品中DNA的浓度＝A260x核酸稀释倍数x50/1000实训三动物组织核酸的提取与鉴定六、注意事项(1）由于组织中广泛存在DNA核酸酶，因此全部提取过程应在低温下（4℃以下）操作，并加入拧棱酸盐、EDTA等核酸酶的抑制剂，以防止其降解。(2）由于核酸极不稳定，在较剧烈的化学、物理因素和酶的作用下很容易被降解，因此在制备过程中应尽量避免这些因素的影响。(3）由于DNA分子大而长，为了获得大的DNA分子而不被破坏在实验中应尽量避免剧烈振荡、用力过猛。不可用口径小的滴管、吸头吸取转移DNA溶液。(4）酚有腐蚀性，操作时应小心，若沾在皮肤上应立即用水或70%乙醇擦洗。实训三动物组织核酸的提取与鉴定七、思考题?(1）如何防止大分子核酸在提取过程中被降解？?(2）氯仿一异戊醇的作用是什么？?(3）在提取DNA的过程中，应该注意哪些问题？实训四牛乳中酪蛋白的制备实训四

牛乳中酪蛋白的制备一、目的要求掌握从牛乳中制备酶蛋白的原理和操作。二.原理酪蛋白是牛乳中主要的蛋白质，它在牛乳中的含量约为35g/L。将牛乳pH调到4.6，酪蛋白即可从牛乳中分离出来。实训四

牛乳中酪蛋白的制备三、试剂和器材试剂pH4.6醋酸纳缓冲液（0.2moνL):A液（0.2moVL醋酸纳溶液）：称NaAc•3H2054.44g于2000mL容量瓶内，定容至2000mL0B液（O.2moVL醋酸溶液）：称纯醋酸（含量大于99.8%)12.0g，定容至1000mL。取A液1770mL,B液1230mL混合即得pH4.6醋酸纳缓冲液。(2)95%乙醇。(3)95%乙醋。(4）乙醇－乙醚混合液(1:1体积比）(5）牛乳.2.器材离心机、pH试纸、温度计、布氏漏斗、抽滤瓶,电炉、烧杯飞量筒等。实训四

牛乳中酪蛋白的制备四、操作步骤1.酪蛋白的粗提(1）将100mL牛乳放到500mL烧杯中，加热至40℃，边搅拌边慢慢加入100mL40℃左右的醋酸纳缓冲液，直到pH达到4.6左右，用pH试纸或酸度计调试。(2）将上述悬浮液冷却至室温，放置5min,3000r/min离心15min，弃去上清液，即得酷蛋白粗制品。实训四牛乳中酪蛋白的制备2.酪蛋白的纯化(1）用水洗涤沉淀3次，3000r/min离心10min，弃去上清液。(2）在沉淀中加入30mL95%乙醇，搅拌片刻，将悬浊液转移至布氏漏斗中，抽滤除去乙醇溶液再倒入乙醇一乙醚混合液洗涤沉淀两次，最后用乙醚洗涤沉淀两次，抽干。”(3）将布氏漏斗中的沉淀移出，在表面皿上摊开、风干，即得自各蛋白纯品。3.准确称重。实训四牛乳中酪蛋白的制备五、结果(1）准确称重后，计算出每100mL牛乳中制备出的酪蛋白含量（g)。(2）求出自酪蛋白收率，即收率（%）＝测得含量／理论含量x100%实训四牛乳中酪蛋白的制备六、思考题实训五唾液淀粉酶的特性实验实训五

唾液淀粉酶的特性实验一.目的要求(1）了解酶的性质，掌握不同因素对酶活性影响的原理。(2）掌握不同因素对酶活性影响的测定方法。实训五唾液淀粉酶的特性实验三、试剂和器材1.试剂(1)1%淀粉溶液：取淀粉1g加蒸馆水少许，搅拌成糊状然后用煮沸的1%NaCl溶液稀释至100mL0(2)0.1moVLpH值5~8磷酸盐缓冲液：分别配制下列两种溶液，再按下表混合后稀释1倍即可。0.2moVLNaH2P04液：称取NaH2P04·2H2031.2g，加水准确定容至1000mL。0.2moVLNa2HP04·12H2O液：称取0.2moVLNa2HP04·12H2071.64g，加水准确定容至1000mL。实训五唾液淀粉酶的特性实验三、试剂和器材1.试剂(3）腆溶液：腆化饵1g加少许水溶解后，再加腆0.5g，溶后加水至100mL，用时加10倍水稀释。(4)0.1%淀粉溶液：将1%淀粉溶液稀释至10倍。(5)1%NaCl溶液。(6)1%CuS04溶液。(7)1%Na2S04溶液。(8)1%震糖。(9）班氏试剂：拘橡酸纳173g和碳酸纳100g溶于约700mL水中，另将硫酸铜17.3g溶于100mL水中。可分别加热助溶。冷却后将两液混合，再加水至1000mL混匀。2.器材水浴锅、电炉、比色板＼吸管、试管、烧杯。实训五唾液淀粉酶的特性实验四、操作步骤1.唾液淀粉酶的制备每人用自来水漱口3次，然后取20mL蒸馆水含于口中，1min后吐入烧杯中，纱布过滤，取滤液10mL，稀释至20mL为稀释酶液。2.温度对酶活性的影响取4支试管，编好号，加入淀粉酶，分别放入冰水浴、37℃水浴和沸水浴中，待管内温度与水浴温度一致时，向4支试管同时迅速加入稀释唾液，摇匀后及时放回原水浴中。实训五唾液淀粉酶的特性实验四、操作步骤(1）在比色板各孔中置腆液1滴，每隔1~2min用滴管从第3管中取反应液1滴，滴入比色板一孔中观察腆液颜色变化每次取反应液之前，都应将滴管洗净后才能取反应液。待检查到腆液颜色不变时取出第4管冷却后，再取出第1管，两管同时各加入腆液1滴，摇匀，观察并记录各管颜色。(2）取出第2管置于37~40℃水浴中，10min后加入2滴腆液，其颜色与第1管比较有何变化？根据观察和记录结果说明温度对酶活性的影响。实训五唾液淀粉酶的特性实验3.pH对酶活性的影响(1）比色板中加腆液备用，准备好37℃水浴。(2）取小试管4支，编号，按下表加入试剂，混匀。实训五唾液淀粉酶的特性实验(3)4号管加稀释酶液10滴，放37℃水浴中，计时，每隔1min由第4号试管中取出1滴溶液做腆反应，待腆反应呈浅红色或橙黄色时，取出试管，记录保温时间。(4)1~3号试管放入37℃水浴中，向1~3号管中加入稀释唾液10滴，摇匀，按照4号管的保温时间，取出各管，并立即加腆液2滴，混匀。观察各管呈现的颜色，判断在不同pH值下淀粉被水解的程度，分析pH对淀粉酶活性的影响，并确定其最适pH值。实训五唾液淀粉酶的特性实验4.激活剂和抑制剂对酶活性的影响取4支试管，按下表编号后进行实验。实训五唾液淀粉酶的特性实验5.酶的专一性取试管3支，编号，按下表操作：将各管放沸水浴中煮沸3~5min，观察结果。实训五唾液淀粉酶的特性实验五、思考题(1)认真填写各项表格，分析实验结果。(2)实验中必须控制哪些条件？为什么？实训六琥珀酸脱氢酶作用及其竞争性抑制观察实训六

琥珀酸脱氢酶作用及其竞争性抑制观察一、目的要求(1）理解竞争性抑制作用的原理。(2）理解丙二酸对琥珀酸脱氢酶的抑制作用。二、原理本实验利用肝细胞中提取的玻王自酸脱氢酶，在无氧的情况下使琥珀酸脱氢，脱下的氢由蓝色亚甲蓝（甲烯蓝）接受，将蓝色的亚甲蓝还原成无色的甲烯白。反应如下：实训六

琥珀酸脱氢酶作用及其竞争性抑制观察三、试剂和器材1.试剂(1)0.1moVL磷酸盐缓冲液（pH7.4）：取0.1moVLNa2HP04溶液19mL和0.1moVLNaH2P04溶液81mL混合。(2)1.5%珑王自酸纳溶液：取琉王自酸纳1.5g，用蒸馆水溶解并定容到100mL。(3)1%丙二酸纳溶液：取丙二酸纳1g，用蒸馆水溶解并定容到l00mL。(4)0.02%亚甲蓝溶液。(5）生理盐水。(6）液体石蜡。2.器材水浴锅、匀浆器或研钵、剪刀、试管、滴管等。实训六琥珀酸脱氢酶作用及其竞争性抑制观察四、操作步骤1.琥珀酸脱氢酶液的制备取新鲜动物肌肉或肝脏5g左右，放入研钵，用剪刀将组织剪碎，按20%浓度加入在冰箱中保存的pH7.4的磷酸缓冲液l0mL充分研磨均匀，过滤备用。2.酶反应及竞争性抑制作用的观察(1）取4支试管分别编号，按下表操作。实训六琥珀酸脱氢酶作用及其竞争性抑制观察五、思考题(1）竞争性抑制作用与非竞争性抑制作用有何不同？(2）加液体石蜡的目的是什么？实训七层析法分离测定氨基酸实训七

层析法分离测定氨基酸一、目的要求(1）掌握纸层析法分离氨基酸的原理和方法。(2）能够利用纸层析法分析样品氨基酸的成分。二原理层析法是利用混合物中各组分之间物理化学性质的差异，使各组分不同程度地分布在两相中（固定相和流动相），从而达到分离。分配系数＝物质在固定相中的浓度／物质在流动相中的浓度实训七

层析法分离测定氨基酸三、试剂和器材1.试剂(1）扩展剂：4份水饱和的正丁醇和1份乙酸的混合物。将20mL正丁醇和5mL冰乙酸放入分液漏斗中，与15mL水混合，充分振荡，静置后分层，放出下层水层。取漏斗内的扩展剂约5mL置于小烧杯中做平衡溶剂，其余的倒入培养皿中备用。(2）氨基酸溶液：0.5%赖氨酸、脯氨酸、缴氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸溶液及它们的混合液（各组分浓度均为0.5%），各5mL。(3）显色贮备液：0.1%水合苟三百同的正了醇溶液。2.器材层析缸、毛细管、喷雾器、培养皿、小烧杯飞铅笔、电吹风机、针、白线飞手套、层析滤纸（新华一号）实训七

层析法分离测定氨基酸四、操作步骤(1）将盛有平衡溶剂的小烧杯置于密闭的层析缸中。(2）取层析滤纸（长22cm、宽14cm）一张。在纸的一端距边缘2~3cm处用铅笔画一条直线，在此直线上每间隔2cm做一记号，如图4所示。实训七

层析法分离测定氨基酸四、操作步骤(3）点样：用毛细管将各种氨基酸样品分别点在这6个位置上，干后再点一次，每点在纸上扩散的直径最大不超过3mmo(4）扩展：用线将滤纸缝成筒状，纸的两边不能接触。将盛有约20mL扩展剂的培养皿迅速置于密闭的层析缸中，并将滤纸直立于培养皿中（点样的一端在下，扩展剂的液面需低于点样线1cm）。待溶剂上升15~20cm时即取出滤纸，自然干燥或用吹风机热风吹干。(5）显色：用喷雾器均匀喷上0.1%苟三四同正丁醇溶液，然后置烘箱中烘烤5min(100℃），或用热风吹干即可显出各层析斑点。注意操作过程中避免用手接触层析滤实训七

层析法分离测定氨基酸五、结果用铅笔轻轻描出显色斑点的形状，并用一直尺测量每一显色斑点中心与原点之间的距离和原点到溶剂前沿的距离，计算各色斑的Rf值，与标准氨基的Rf值对照，确定水解液中含有哪些氨基酸。实训七

层析法分离测定氨基酸六、思考题(1）为什么几种氨基酸的Rr值不同？(2）为什么显色过程中避免用于接触滤纸？实训八福林一吴宪法测定血糖含量实训八

福林一吴宪法测定血糖含量一、目的要求(1）掌握福林一吴宪法测定血液葡萄糖含量的原理和方法。(2）掌握分光光度计的原理和使用方法。二、原理动物血液中的糖主要是葡萄糖。正常情况下，血糖浓度相对恒定。实训八

福林一吴宪法测定血糖含量三、试剂和器材1.试剂(1)10%鸽酸纳溶液：取鸽酸纳（Na2W04·2H20)10g，用蒸馆水溶解并稀释至100mL。(2)0.333mol/L硫酸溶液：取1份1mol/LH2S04溶液，加2份水。(3）碱性铜试剂：在400mL水中加入无水碳酸纳40趴在300mL水中加入酒石酸7.5趴在200mL水中加入结晶硫酸铜4~5g。以上分别加热溶解，冷却后将酒石酸溶液倾入碳酸纳溶液中，再将硫酸铜溶液倾人，并加水至1000mL。混匀，贮存于棕色瓶中。(4）磷铝酸试剂：取夺目酸35g和鸽酸纳10g，加入10%NaOH溶液400mL及蒸馆水400mL，混合后煮沸20~40min，以除去铝酸中存在的氨（直至元氨味为止），冷却后加入浓磷酸（80%)250mL，混匀，贮存于棕色瓶中。(5)0.259毛苯甲酸溶液：称取苯甲酸2.5g加入1000mL蒸馆水中，煮沸使之溶解，冷却后补加至1000mL，此试剂可长期保存。实训八

福林一吴宪法测定血糖含量三、试剂和器材(6）葡萄糖贮存标准溶液（10mg/mL）：将少量元水葡萄糖（A.R.或C.P）置于硫酸干燥器内一夜后精确称取此葡萄糖1.000g，以0.259毛苯甲酸溶液溶解并移入100mL容量瓶内再以0.259毛苯甲酸溶液稀释至100mL，置冰箱中可长期保存。(7）葡萄糖应用标准溶液（0.1mg/mL）：准确吸取葡萄糖贮存标准溶液1.0mL,置100mL容量瓶内以0.25%苯甲酸溶液稀释至100mL。(8）动物血清。2.器材试管及试管架、奥氏吸管、吸管、锥形瓶、血糖管、电炉、分光光度计、漏斗、滤纸等。实训八福林一吴宪法测定血糖含量四、操作步骤1.无蛋白血滤液的制备鸽酸铀与硫酸混合生成鸽酸和硫酸纳，血液中蛋白质在pH小子等电点的溶液中可被鸽酸沉淀，将沉淀液过滤或离心，上层清液即为无色透明、pH约等于6的无蛋白滤液。(1）取20mL锥形瓶1只，加入蒸馆水7mL0(2）用奥氏吸管吸取抗凝血lmL，擦去管壁外血液，将吸管插入锥形瓶底部，缓缓放出血液。放完血液后，将吸管提高吸取上清液再吹入，反复洗管3次。充分混匀，使红细胞完全溶解。实训八福林一吴宪法测定血糖含量四、操作步骤(3）加入0.333mol/L硫酸溶液1mL，边加边摇，充分混匀，此时血液由鲜红色变成棕色，静置5~10min，使其酸化完全。(4）加入10%钨酸纳1mL，边加边摇。(5）放置约5min后，直至振摇也不再发生泡沫，说明蛋白质已经完全变性沉淀。用定量滤纸过滤或离心（2500r/min,10min），即得完全澄清无色的无蛋白血滤液。实训八福林一吴宪法测定血糖含量四、操作步骤2.取血糖管3支按下表操作。实训八福林一吴宪法测定血糖含量五、结果将测得数值代入下列公式计算：实训八福林一吴宪法测定血糖含量六、注意事项(1）正常畜禽在饲喂前采血，病畜禽要在补糖前采血，否则结果偏高。(2）采血后最好在2~4h测定完毕。若放置过久，由于红细胞的酵解作用，会使结果偏低；如不能及时测定，应制成无蛋白血滤液置于冰箱内保存。(3）在本法的元蛋白血滤液中，除含有葡萄糖外，尚有微量的其他还原物质，故测定结果比实际血糖含量高10%左右。(4）一定要等水沸后再放入血糖管加热时间必须准确否则会影响实验结果的准确性。(5）加入磷铝酸试剂后显色不稳定应立即进行比色。(6）若酸性铝酸盐试剂出现蓝色，表示试剂本身已被还原，不能再用，应重新配制。(7）若碱性硫酸铜试剂出现红黄沉淀，则不宜使用须重新配制。实训八福林一吴宪法测定血糖含量七、思考题(1）此法测定葡萄糖的原理是什么？(2）实验中，若测定管颜色明显深于或浅于标准管颜色时应如何处理？(3）实验中哪些操作会影响测定结果？实训九粗脂肪含量的测定一一索氏抽提法实训九粗脂肪含量的测定一一索氏抽提法一、目的要求(1）了解索氏提取器的基本结构及索氏抽提法的提取原理。(2）掌握用滤纸包减量法提取样品中的粗脂肪并计算其含量的方法。二、原理脂肪是丙三醇（甘油）和脂肪酸结合成的脂类化合物，能溶于脂溶性有机溶剂中，其广泛存在于许多植物的种子和果实中，测定脂肪的含量可以作为鉴别其品质优劣的一个指标。实训九粗脂肪含量的测定一一索氏抽提法三试剂和器材1.试剂无水乙醚或石油醚、滤纸、饲料或食品。2.器材索氏脂肪抽提器、恒温水浴锅、烘箱、电子分析天平。实训九粗脂肪含量的测定一一索氏抽提法四、操作步骤(1）用电子分析天平准确称取2.000g（精确至0.01mg）原料，用滤纸包好（保证样品不散漏），在100~105℃烘箱中烘干脱水，放入干燥器中冷却，达到恒重后称重（前后两次称量差不超过2mg）。(2）将索氏脂肪抽提器安装妥当，并将烘干称重的滤纸包放入抽提管（图5）中，注入无水乙醚以滤纸包全部浸泡于乙醚中为准。盛乙醚瓶应提前注入无水乙醚60~100mL。实训九粗脂肪含量的测定一一索氏抽提法四、操作步骤(3）加热水浴锅使温度达45~65℃，使乙醚回流，控制乙醚回流为6~8min/次，共回流50次（含油高的试样约70次），或检查抽提管流出的乙醚挥发后不留下油迹为抽提终点。样品中所含脂肪可全部抽提出而积存于乙醚瓶中。(4）提取完毕后，移去上部的冷凝管，取出滤纸包，放在盘子中，通风使乙醚挥发，然后再置100~105℃烘箱中，需1~2h，取出滤纸包，放入干燥器中冷却，达到恒重时称重（前后两次称量差不超过2mg）。实训九粗脂肪含量的测定一一索氏抽提法五、结果根据恒重前后滤纸包的质量，按下式计算样品中粗脂肪含量：实训九粗脂肪含量的测定一一索氏抽提法六、注意事项(1)抽提剂乙酿是易燃、易爆物质，应注意通风并且不能有火源。(2）样品滤纸包的高度不能超过虹吸管，否则上部脂肪因不能提净而造成误差。(3）试样必须充分磨碎和烘干，否则溶剂不易浸透和不易抽出脂肪。(4）用滤纸包样品时应注意一定不能散漏，否则实验结果不准确。(5）样品和自迷浸出物在烘箱中干燥时，时间不能过长，以防止极不饱和的脂肪酸受热氧化而增加质量。(6）脂肪烧瓶在烘箱中干燥时，瓶口侧放，以利于空气流通，而且先不要关上烘箱门，于90℃以下鼓风干燥10~20min，驱尽残余溶剂后再将烘箱门关紧，升至所需温度。(7）反复加热可能会因脂类氧化而