DB2305-T 020-2024 牛病毒性腹泻病毒PCR检测规程

ICS65.020.30CCSB41DB2305双鸭山市市场监督管理局发布DB2305/T020—2024 Ⅱ 2规范性引用文件 13术语和定义 4缩略语 5主要仪器设备 16试剂 27样品的采集与处理 37.1样品采集 7.2样品处理 8样品病毒核酸RNA提取 39PCR扩增 39.1引物 9.2反应条件 410结果判定 410.1检测结果成立条件 410.2结果判定 411实验室无害化处理 411.1病料的无害化处理 411.2实验室废弃物处理 411.3实验室分区 411.4实验室生物安全管理 4DB2305/T020—2024本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由双鸭市农业农村局提出并归口。本文件起草单位：双鸭市农业技术综合服务中心、双鸭山市基本建设项目服务中心、黑龙江农业职业技术学院。本文件主要起草人：王宇婷、白鹭、刘云、张红军、杜航、张荣翔、秦藕菊。DB2305/T020—2024牛病毒性腹泻病毒PCR检测规程本文件规定了牛病毒性腹泻病毒PCR检测方法的主要仪器设备、试剂、样品采集与处理、样品病毒核酸RNA提取，PCR扩增、结果判定、实验室无害化处理等技术要求。本文件适用于牛病毒性腹泻病毒PCR检测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求SN/T1193基因检验实验室技术要求NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4缩略语下列缩略语适用于本文件。BVDV：牛病毒性腹泻病毒PCR：聚合酶链式反应RNA：核糖核酸cDNA：与信使RNA链呈互补的碱基序列的单链DNAPBS：磷酸盐缓冲液EP管：微量离心管DEPC：焦碳酸乙二酯EDTA：乙二胺四乙酸PrimeSTARBuffer：聚合酶的缓冲液dNTPMix：脱氧核糖核苷三磷酸混合液DNAPolymerase：高扩增效率的PCR用的DNA聚合酶ddH2O：双蒸水5主要仪器设备5.1二级生物安全柜5.2台式高速冷冻离心机：可控温至4℃,转速12000r/min以上5.3冰箱：2℃~8℃、-20℃、-70℃三种5.4单道（或多道）微量移液器（10μL、100μL、200μL、1000μL）5.5PCR仪2DB2305/T020—20245.6涡旋振荡器5.8水平电泳槽5.9凝胶成像系统5.10全自动高压灭菌锅5.11电子天平：精密度0.001g5.12通风橱5.13pH计6试剂6.1在检测中使用的试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T6682三级水要求。所用液体试剂均需使用无RNA酶的容器进行分装。6.2TRIzol、氯仿、异丙醇（-20℃),均为商品化试剂。6.3无水乙醇，应于-20℃预冷。6.4DNA相对分子质量标准物MarkerDL2000。6.575%乙醇：量取75mL无水乙醇，加入25mL0.1%DEPC水，应于-20℃预冷。6.60.1%DEPC水：将0.1gDEPC加100mL三级水中，充分振荡后作用12h，121℃高压灭菌30min,冷却后冷藏备用，在通风橱中配制。6.730%甘油磷酸盐缓冲液：甘油30mL，氯化钠（Nacl）4.2g，磷酸二氢钾（KH2PO4）1g，磷酸氢二钾（K2HPO4）3.1g，0.02%酚红1.5mL，加三级水定容至100mL，加热熔化，校正Ph为7.6，121℃高压灭菌15min，4℃保存备用。6.850×TAE：称取242gTris、37.2gNa2EDTA·2H2O溶于800mL三级水中，充分搅拌混匀，加入57.1mL的冰乙酸，充分混匀，加三级水定容至1L，室温保存。6.91×TAE：取20mL50×TAE，加三级水定容至1L，室温保存。6.10cDNA合成：反转录试剂盒。6.1110mg/mL的溴化乙锭溶液：三级水100mL，溴化乙锭1g，置棕色容器中搅拌数小时以确保完全溶解，用铝箔包裹容器，保存于室温。6.120.01mol/mLPBS：氯化钠（Nacl）8g、氯化钾（Kcl）0.2g、磷酸氢二钠（Na2HPO4）2.9g、磷酸二氢钾（KH2PO4）0.2g，三级水1000mL。6.131%琼脂糖凝胶：称取1g琼脂糖于100mL1×TAE缓冲液中，加热融化后充分摇匀，待冷至50℃~60℃,加入溴化乙锭溶液5μL。摇匀，倒入插好梳子的电泳板上，凝固后取下梳子，备用。6.14阳性对照：BVDV阳性标准品，阴性对照：灭菌ddH2O。3DB2305/T020—20247样品的采集与处理7.1样品采集按照NY/T541的规定执行。病死牛无菌采集典型、明显的病变组织部位；活体采集EDTA抗凝全血（5mL～10mL），采血后轻轻颠倒混匀；粪便、口鼻分泌物拭子等分别装入灭菌的2mLEP管中（在管中加入30%甘油磷酸盐缓冲液中），所有样品均编号备用。7.2样品处理7.2.1组织样品取样品约1g放入1.5mL的EP管内，用75%乙醇消毒手术剪后再剪碎组织，加入1mLPBS进行研磨，制备组织匀浆，12000r/min离心5min，取上清液用于核酸提取。7.2.2抗凝血样品直接用于核酸提取。7.2.3粪便、口鼻拭子样品将拭子样品，充分振荡后，室温静置5min～10min，取上清1mL加到1.5mLEP管中，12000r/min离心15min，取上清液用于核酸提取。8样品病毒核酸RNA提取8.1在2mLEP管中加入样品上清液200μL，再加入1mLTRIzol，充分混匀，室温放置10min。8.2加入200μL的氯仿，盖紧EP管盖，涡旋振荡15s，室温放置10min，于4℃、12000r/min离心15min。8.3取500μL上层液移入另一个1.5mL的EP管内(切忌吸动白色中间相)，加入500μL异丙醇（-20℃预冷），轻轻颠倒1.5mL的EP管充分混匀液体，室温放置10min。8.4于4℃、12000r/min离心15min，轻轻倒去上清液。加入600μL75%乙醇（-20℃预冷）颠倒洗涤。8.5于4℃、12000r/min离心10min，轻轻倒去上清液。8.6于4000r/min离心30s，室温干燥3min。8.7加入50μLDEPC水，轻轻混匀，溶解RNA，4000r/min离心30s，-20℃保存备用，长期保存需-70℃冷冻。8.9cDNA合成按照试剂试剂盒说明书反转录，得到cDNA。9PCR扩增9.1引物引物序列表见表1。DB2305/T020—2024表1：引物序列表9.2反应条件95℃预变性5min；94℃变性3min30s；60℃延伸40s；72℃退火1min；30个循环，72℃终延伸10min；最后4℃保温。1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，预期扩增片段大小约为300bp。表2PCR反应液配方1521110结果判定10.1检测结果成立条件阳性对照的PCR产物孔出现300bp大小特异性目的条带，阴性对照PCR产物无目的条带，则检测结果成立；否则，结果不成立。如阴性和阳性对照不满足以上条件，则实验视为无效，需重新检测。10.2结果判定检测样品PCR产物电泳后出现300bp大小特异性目的条