第21章 高效液相色谱课件

第21章高效液相色谱

高效液相色谱法第21章高效液相色谱概述流动相是液体的色谱法称为液相色谱(liquidchromatography,LC)液相色谱可分为平板色谱和柱色谱。前者如纸色谱和薄层色谱，后者如离子交换色谱等。现代高效液相色谱不同于传统液相色谱主要采用了高效色谱柱与高压输液泵。第21章高效液相色谱高效液相色谱法比起经典液相色谱法的最大优点在于高速、高效、高灵敏度、高自动化。高速是指在分析速度上比经典液相色谱法快数百倍。由于经典色谱是重力加料，流出速度极慢；而高效液相色谱配备了高压输液设备，流速最高可达103cm·min-1。高效液相色谱配备了高效分离柱，比经典层析柱分离效率高。配有高灵敏度的检测器。第21章高效液相色谱气相色谱法与液相色谱法比较液相色谱法不受试样挥发度和热稳定性的限制，非常适合分离生物大分子，离子型化合物、不稳定天然产物以及各种高分子化合物等。高效液相色谱法流动相可选用不同极性的液体，流动相对组分可产生一定亲和力，并参与固定相对组分作用的剧烈竞争，对分离起很大作用，相当于增加了一个控制和改进分离条件的参数，这为选择最佳分离条件提供了极大方便。第21章高效液相色谱高效液相色谱法包括四种基本类型：分配色谱吸附色谱（液固色谱）离子交换色谱尺寸排斥色谱（凝胶色谱）第21章高效液相色谱第21章高效液相色谱21-1液相色谱的柱效一、液相色谱的速率理论速率理论是在分析气相色谱分离原理后得出的速率方程，这个方程作适当修改后也适用于液相色谱。与气相色谱不同的是：由于液态流动相密度比气态流动相高4~5数量级，因此液相色谱分子扩散项可忽略不计。流动传质阻力项与气相色谱有较大不同，见图21-2、21-3第21章高效液相色谱第21章高效液相色谱在液相色谱中，可采用减小填料的孔穴深度、粒径、采用低粘度及流低速流动相、适当提高柱温等方式操作提高柱效。第21章高效液相色谱二、液相色谱的柱外展宽以前对色谱峰展宽因素的讨论只限于柱分离，液相色谱的柱外因素对谱峰宽度的影响也很大，进样系统、连接管件、检测器等，这是由于流动相在管壁邻近区的流速明显低于管中心区，导致柱外展宽。气相色谱谱峰展宽的主要因素是纵向扩散，而液相色谱则较大程度上受到柱外展宽的影响。第21章高效液相色谱21-2高效液相色谱仪高效液相色谱仪一般分为四个部分高压输液系统、进样系统、分离系统、检测系统。图21-5除上述四个系统外，高效液相色谱仪还可能配备其它一些附属部件，如梯度洗脱、自动进样、数据处理装置等。一、高压输液系统由于高效液相色谱分离柱所用固定相颗粒极细，对流动相阻力很大，靠重力作用是不可能使流动相通过分离柱，为使流动相较快流动，必须配备有高压输液系统。高压输液系统由储液罐、高压输液泵、过滤器、压力脉动阻力器等组成。核心部件是高压输液泵第21章高效液相色谱第21章高效液相色谱第21章高效液相色谱一、高压输液系统高压输液泵的性能要求：高压输液泵应具备密封性好，输出压力高、流量范围大、流量恒定、无脉动，流量精度和重复性为0.5%左右。此外，还应耐腐蚀，密封性好。高压输液泵按其操作原理可分为恒压泵和恒流泵两大类。恒流泵是能给出恒定流量的泵，其流量与流动相粘度和柱渗透无关。恒压泵是保持输出压力恒定，而流量随外界阻力变化而变化。如果系统阻力不发生变化，恒压泵就能提供恒定的流量。第21章高效液相色谱机械往复色谱输液泵第21章高效液相色谱二、进样系统因高效液相色谱柱比气相色谱柱短得多（约5～30cm），所以柱外扩宽（又称柱外效应）对色谱分离影响很大。柱外展宽主要发生在进样系统与连接管件及检测器中，其中进样系统是引起柱前展宽的主要因素，因此设计一个好的进样系统至关重要。常用的进样方式有三种：直接注射式进样、停留进样、高压六通阀进样。第21章高效液相色谱第21章高效液相色谱三、色谱柱在高压液相色谱中一般采用优质不锈钢管制备，一般色谱柱长5～30cm，内径为4～5mm；凝胶色谱柱内径3～12mm；制备柱内径较大，可达25mm以上。一般采用匀浆法填充法装柱，先将填料调成悬浮的匀浆，然后在高压泵作用下，快速将其压入装有洗脱液的色谱柱内，经冲洗后，即可备用。目前这种装柱法可达到每米柱效8万塔板数。

第21章高效液相色谱四、检测系统在液相色谱中，有两种基本类型的检测器。一类是溶质性检测器：它仅对被分离组分的物理或物理化学特性有响应。属于这类检测器的有紫外、荧光、电化学检测器等。另一类是总体检测器：它对试样和洗脱液总的物理或物理化学性质有响应，属于这类检测器的有示差折光，介电常数检测器等。表21-1列出了常用检测器及特性第21章高效液相色谱第21章高效液相色谱五、附属系统

它包括脱气、梯度淋洗、恒温、自动进样、馏分收集以及数据处理等装置。其中梯度淋洗装置是高压液相色谱仪中尤为重要的附属装置。第21章高效液相色谱21-3分配色谱在液-液分配色谱是四种液相色谱方法中最为广泛的一种,流动相和固定相都是液体,它能适用于各种样品类型的分离和分析，无论是极性和非极性，水溶性和油溶性，离子型和非离子型化合物。分离原理与液-液萃取相同，都是根据物质在两种互不相溶的液体中溶解度的不同，具有不同的分配系数。第21章高效液相色谱分配色谱分液液色谱与分配色谱两类。液液色谱的固定相是通过物理吸附的方法将固定液涂在载体表面，键合相色谱的固定相是通过化学反应将有机分子键合到载体上。第21章高效液相色谱一、化学键合固定相键合固定相一般采用硅胶为基体，利用硅胶表面的硅醇基(Si一OH)与有机分子间成键,即可得到各种性能的固定相。一般可分两类（1）疏水基团：如不同链长的烷烃（C8和C18。）和苯基等（2）极性基团如氨丙基（—C3H6NH2），氰乙基（—C2H4CN）、二醇与氨基等。第21章高效液相色谱正相分配色谱和反相分配色谱在液液色谱中，为了减少固定液的流失，选择流动相尽可能与固定相极性差别越显著越好。。根据所使用的流动相和固定相的极性程度，将其分为正相分配色谱和反相分配色谱。如果采用流动相的极性小于固定相的极性，称为正相分配色谱，它适用于极性化合物的分离。其流出顺序是极性小的先流出，极性大的后流出。如果采用流动相的极性大于固定相的极性，称为反相分配色谱。它适用于非极性化合物的分离，其流出顺序与正相色谱恰好相反。第21章高效液相色谱二、固定相与流动相色选择色谱柱类型的选择固定相的极性与分析物的极性粗略匹配，用极性明显不同的流动相洗脱（能成功分离）。流动相的极性与分析物的极性粗略匹配，用极性明显不同的固定相（不能成功分离）。固定相的极性与分析物的极性极为匹配，以流动极性的差异洗脱分析物（保留时间太长）。