生物学案：第四章第二节分子生物学技术

学必求其心得，业必贵于专精学必求其心得，业必贵于专精学必求其心得，业必贵于专精第二节分子生物学技术学习目标重点难点1.能记住PCR技术的概念。2．能说出PCR的大致过程。重点：会分析生物体内DNA复制与PCR技术的区别。难点：能运用PCR的原理解决日常生活中的实际问题。一、分子生物学进展1．______________________的建立,奠定了分子生物学的基础。2．____________________具有重大作用和深远意义.3．原核生物、真核生物的细胞已被用于大批量生产________、________等外源蛋白。4．____________也可以作为天然的生物反应器,用于生产新的或改造过的基因产物。5．我国自1986年提出________计划至今，在生物技术方面已取得了一系列突破性进展，许多成果已转化为生产力.预习交流分子生物学近年来进展神速，你了解其在我国农业生产中应用的现状吗？二、PCR技术1．概念：PCR又叫______________，是一种体外迅速____________或__________的实验技术。2．原理:遵循______________原则.3．条件:模板：__________；酶：____________；原料：__________的脱氧核苷酸;引物。4．过程：PCR一般要经过________循环，每一次循环都可以分为______、______、______三步.5．结果：按____进行指数式扩增。预习交流1．DNA分子由两条脱氧核苷酸链组成，和亲代DNA分子相比，子代DNA的两条链有何特点?2。回忆并简述DNA的复制过程。3．PCR的变性过程实质上也是解旋，PCR的解旋和细胞内的DNA解旋有何不同?4．PCR技术有何应用？答案：一、1。DNA分子双螺旋结构模型2．DNA重组技术和基因克隆3．胰岛素干扰素4．植物与动物“863"预习交流：提示：我国已成功培育出转基因水稻、大豆、小麦、棉花、番茄、烟草等品种,其中的一些已经被批准进行大田试种和种植，如抗虫棉。二、1.聚合酶链式反应扩增特定基因DNA序列2．碱基互补配对3．两条母链DNA聚合酶4种游离4．三十多次变性退火延伸5．2n预习交流:1．提示:构成子代DNA的两条链一条链是亲代DNA的链（母链），一条链是新合成的链（新生链），这种复制叫半保留复制。2．提示：DNA分子首先在解旋酶的作用下解旋，然后以解开的每一段母链为模板，在DNA聚合酶等酶的作用下合成与母链碱基互补的一段子链,随着模板链解旋过程的进行,新合成的子链也不断延伸，同时，每条新链与其对应的模板链盘绕成双螺旋结构.3．提示：PCR在高温条件下（90～100℃）解旋，而细胞内的DNA在解旋酶的作用下解旋.4．提示:基因克隆、DNA序列测定、遗传疾病的诊断、刑侦破案、古生物学。在预习中还有哪些问题需要你在听课时加以关注？请在下列表格中做个备忘吧！我的学困点我的学疑点一、PCR技术的原理及条件1．细胞内DNA复制需要的基本条件有哪些?该条件在DNA复制中起何作用?2．DNA复制过程为什么需要引物？哪种物质可以作为引物?3．讨论：DNA合成的方向有什么特点？两条子链的合成起始于DNA的同一端吗？4．在DNA复制时，双链的解开是进行DNA复制的前提，在体外如何使双螺旋结构打开呢？5．由于PCR过程的温度很高，导致DNA聚合酶失活,人们是怎样解决这一问题的呢？6．PCR扩增需要哪些条件呢?1．美国科学家莫里斯发明的PCR技术，是一种DNA分子“复印机”,它可以在数小时内将一个DNA分子复制出1千亿个,解决了检测样本扩增的难题。在人类基因组计划实施中，PCR技术使每个核苷酸的识别成本降至5~10美元。莫里斯因发明PCR技术荣获了诺贝尔奖。(1)DNA分子在复制时需要大量的______________作原料，在DNA聚合酶的催化下利用解旋后的单链为________，进行生物合成。（2）在DNA分子解旋时必须加热，普通的酶容易________________，莫里斯从温泉中找到了耐95℃高温的__________，解决了酶重复使用的难题,使链式反应成为可能.每次循环可以分为________、________、________三步。（3）高温酶的发现与应用说明了地球生物____________的重要，大自然的________库是人类的宝贵财富。2．下图是PCR体外扩增DNA过程中哪次循环的产物？()A．第一次循环B．第二次循环C．第三次循环D．第四次循环1．PCR技术与体内DNA复制的比较体内复制PCR反应不同点解旋在解旋酶作用下，细胞提供能量，部分解开加热至94℃左右,双链全部解开，不需解旋酶引物一小段RNA可以是RNA或单链DNA分子片段合成子链在引物基础上，一条链连续合成，另一条链不连续合成分别从两条链的引物端开始，都是连续合成,控制温度72℃特点边解旋边复制，半保留复制体外迅速扩增TaqDNA聚合酶不需要需要循环次数受生物体自身控制30多次温度体内温和条件高温（可变）相同点①需提供DNA复制的模板②四种脱氧核苷酸为原料③都需要一定的缓冲溶液④子链延伸的方向都是从5′端到3′端2．DNA母链的3′端对应着子链的5′端，即DNA的两条链是反向平行的。3．解旋酶的作用是使DNA两条链的氢键断开，而DNA聚合酶与DNA连接酶都是催化形成磷酸二酯键的.4．DNA聚合酶是将单个核苷酸加到已有的单链片段的3′端上，需要模板，而DNA连接酶连接的是两条DNA片段的缺口，不需要模板.二、PCR技术的过程1．PCR一般要经历三十多次循环,每次循环可以分为哪几步？2．PCR循环之前，常要进行一次预变性，预变性的目的是什么？3．PCR缓冲液相当于细胞内的什么成分？4．当PCR反应体系的温度由变性后缓慢冷却到50℃左右时,引物与模板可结合，而解开的两个DNA模板链能够重新结合吗？为什么？5．PCR过程中的DNA聚合酶能对最初的DNA模板进行完整的复制吗?为什么？标准的PCR过程一般分为变性、退火、延伸三大步，这三大步需要的温度依次是（）。A．94℃、55℃、72℃B．72℃、50℃、92℃C．50℃、92℃、72℃D．80℃、50℃、72℃1．PCR反应过程图解（1）变性：当温度上升到90℃以上时，双链DNA解旋为单链，如下图：（2）退火：系统温度下降至55℃时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，如下图：（3）延伸:当系统温度上升至72℃左右，溶液中的四种脱氧核苷酸（A、T、G、C）在DNA聚合酶的作用下，据碱基互补配对原则合成新的DNA链，如下图:2．PCR过程的温度条件和时间控制变性退火延伸预变性94℃，5min——30次94℃，30s55℃，30s72℃，1min最后一次94℃，1min55℃,30s72℃，1min三、PCR实验操作和结果分析评价1．讨论PCR实验过程中有哪些注意事项.2．如何判断DNA扩增成功?PCR实验中使用的微量离心管、缓冲溶液以及蒸馏水使用前必须进行的关键步骤是（）.A．反复洗涤B．用酒精擦洗C．高压灭菌D．在－20℃下储存1．DNA扩增数目的理论计算理论上DNA扩增呈指数增长。若只有一条DNA模板，则复制n次后有2n条；若一开始有m条DNA模板，则复制n次后有m×2n条；实际操作过程中由于无关变量的影响，一般来说实验值要略小于理论值。2．DNA含量的测定稀释：2μLPCR反应液,加入98μL蒸馏水，即将样品进行50倍稀释↓对照调零：以蒸馏水作为空白对照，在波长260nm处，将紫外分光光度计的读数调节至零↓测定：取DNA稀释液100μL至比色杯中，测定260nm处的光吸收值↓计算：DNA含量（μg/mL）＝50×(260nm的读数）×稀释倍数答案：活动与探究一：1．提示：细胞内DNA复制需要的基本条件和作用分别是：（1）解旋酶：打开DNA双链.（2）DNA母链：提供DNA复制的模板.（3）4种脱氧核苷酸：合成子链的原料。（4）DNA聚合酶:催化合成DNA子链。(5）引物：使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。2．提示：DNA聚合酶不能从头开始合成DNA,而只能从3′端延伸DNA链，因此，DNA复制需要引物.RNA或小段单链DNA都可以作为引物。3．提示：（1）DNA的羟基末端称为3′端,磷酸基团的末端称为5′端,且DNA的一条链为3′→5′，另一条互补链为5′→3′，即DNA的两条链是反向的.（2）DNA合成的方向总是从子链的5′端向3′端延伸（即沿母链的3′→5′)，所以两条子链的合成分别起始于DNA的两端。4．提示:PCR原理：利用DNA的热变性原理。即在90～100℃的温度范围内，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开,这个过程称为变性，当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA单链又会重新结合成双链。5．提示：发现和应用了耐高温的TaqDNA聚合酶，大大增加了PCR的效率。6．提示：PCR反应需要提供组分：DNA模板、分别与两条模板链相结合的两种引物、四种脱氧核苷酸、耐热的DNA聚合酶。同时，在一定的缓冲液中，通过控制温度使DNA复制在体外反复进行。迁移与应用：1．解析：DNA复制过程中需要的条件是:模板、原料（四种脱氧核苷酸）、酶、能量和引物，酶一般是蛋白质，而蛋白质不能耐受60～80℃的高温,而DNA在80℃以上才会变性，解开双链。为了解决DNA聚合酶失活问题，20世纪80年代发现了耐高温的TaqDNA聚合酶。PCR的每次循环可分为变性、退火、延伸三步。答案：（1）脱氧核苷酸模板（2）变性（失活）TaqDNA聚合酶变性退火延伸（3）多样性基因2．A解析：在PCR反应中,以引物为起点，第一次循环时，以加入的DNA为模板，两条DNA链可分别由引物Ⅰ和引物Ⅱ与其结合，并在DNA聚合酶的作用下延伸，所以形成的每个子DNA中只有一种引物；从第二次循环开始，上次产生的DNA分子又可作为模板参与反应，所以会形成DNA分子两端均含引物的情况,如下图所示：因此题干中所出现的情况是第一次循环的产物。活动与探究二:1．提示:每次循环可以分为变性、退火和延伸三步。2．提示：预变性的目的是增加大分子模板DNA彻底变性的概率。3．提示：由于缓冲液为DNA的复制提供场所，相当于细胞内DNA复制的场所，所以缓冲液相当于核基质。4．提示：不能。（1）模板DNA链比引物长得多而且复杂得多，不易重新结合。（2）引物和模板之间的碰撞机会远远高于两个DNA模板链之间的碰撞机会.（3)加入的引物的量足够大，而模板数量少。5．提示：不能。由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合，进行DNA的延伸,这样，DNA聚合酶只能特异地复制处于两个引物之间的DNA序列,使这段固定长度的序列呈指数扩增。迁移与应用：A解析：当温度上升到94℃时，作为模板的双链DNA解旋成为单链DNA，称之为变性；当温度下降到40～60℃时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合；当温度回升到72℃左右（TaqDNA聚合酶的最适反应温度)时，在单链上4种脱氧核苷酸按照碱基互补配对原则连接在引物之后，使引物链延伸，形成互补的DNA双链.活动与探究三:1．提示：（1）避免外源DNA污染：所用仪器、缓冲液、蒸馏水等使用前必须进行高压灭菌。(2）缓冲液和酶分装成小份，－20℃低温保存.（3）每添加一种反应成分，更换一个移液器的枪头.(4）混匀后离心处理，使反应液集中在离心管底部。2．提示：（1)教材中的方法，可以通过计算DNA含量来评价扩增的效果。（2）电泳检测的方法,可以通过在紫外线下直接观察DNA带的分布及粗细程度来评价扩增的效果。迁移与应用:C解析:为了避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌。PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份,并在－20℃下储存。使用前，将所需的试剂从冰箱内拿出,放在冰块上缓慢融化。1．PCR过程与细胞内的DNA复制过程相比,主要有两点不同，它们是（).①PCR过程需要的引物是人工合成的单链DNA或RNA②PCR过程不需要DNA聚合酶③PCR过程中DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的④PCR过程中，DNA不需要解旋，直接以双链DNA为模板进行复制A．③④B．①②C．①③D．②④2．DNA的复制需要引物，其主要原因是（）。A．可加快DNA的复制速度B．引物可与DNA母链通过碱基互补配对结合C．引物的5′端有助于DNA聚合酶延伸DNA链D．DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链3．PCR技术利用了DNA的热变性原理，PCR仪实际上是一种能自动调控温度的仪器。下列对PCR过程中“温度的控制”的说法,错误的是（).A．PCR反应需要高温，是为了确保模板是单链B．延伸的温度必须大于退火温度，而小于变性温度C．要用耐高温的DNA聚合酶D．需要耐高温的解旋酶4．从第二次循环开始，复制的DNA片段呈______扩增（）。A．直线B．