分子教案第三章DNA的生物合成

第三章DNA的生物合成教学重点：1．DNA的半保留复制及DNA的半不连续复制2．DNA复制的方式3．DNA复制的调控教学难点：线形DNA复制末端问题的解决教学时数：7学时教学要求：1．掌握并理解DNA复制的特点2．掌握并理解DNA复制的过程3．掌握并理解DNA复制的主要方式4．掌握并理解线性DNA复制末端缩短问题的解决方式5．了解DNA复制的调控方式教学方式：讲述、演示与计算机辅助教学教学内容：1.DNA复制的特点证明DNA是遗传物质的两个关键性实验：首先用实验证明基因就是DNA分子的是美国的微生物学家Avery.他的实验是用肺炎球菌感染小鼠。美国遗传学家Hershey用T2噬菌体感染大肠杆菌实验，也证明DNA是遗传物质。这两个实验中主要的论点证据是：生物体吸收的外源DNA改变了其遗传潜能。目前认为生物界遗传信息传递的中心法则为ReplicationofduplexDNAisacomplexendeavorinvolvingaconglomerateofenzymeactivities.Differentactivitiesareinvolvedinthestagesofinitiation,elongation,andtermination.图1双螺旋DNA的复制1.1DNA的半保留复制(semiconservativereplication)Watson和Crick在提出DNA双螺旋结构模型时即推测，DNA在复制时首先两条链之间的氢键断裂两条链分开，然后以每一条链分别做模板各自合成一条新的DNA链，这样新合成的子代DNA分子中一条链来自亲代DNA，另一条链是新合成的，这种复制方式为半保留复制。1958年Meselson和Stahl利用氮标记技术在大肠杆菌中首次证实了DNA的半保留复制，他们将大肠杆菌放在含有15N标记的NH4Cl培养基中繁殖了15代，使所有的大肠杆菌DNA被15N所标记，可以得到15N桪NA。然后将细菌转移到含有14N标记的NH4Cl培养基中进行培养，在培养不同代数时，收集细菌，裂解细胞，用氯化铯(CsCl)密度梯度离心法观察DNA所处的位置。由于15NDNA的密度比普通DNA(14N－DNA)的密度大，在氯化铯密度梯度离心(densitygradientcentrifugation)时，两种密度不同的DNA分布在不同的区带。实验结果表明：在全部由15N标记的培养基中得到的15N桪NA显示为一条重密度带位于离心管的管底。当转入14N标记的培养基中繁殖后第一代，得到了一条中密度带，这是15N桪NA和14N-DNA的杂交分子。第二代有中密度带及低密度带两个区带，这表明它们分别为15N14N－DNA和14N14N-DNA。随着以后在14N培养基中培养代数的增加，低密度带增强，而中密度带逐渐减弱，离心结束后，从管底到管口，CsCl溶液密度分布从高到低形成密度梯度，不同重量的DNA分子就停留在与其相当的CsCl密度处，在紫外光下可以看到DNA分子形成的区带。为了证实第一代杂交分子确实是一半15N-DNA－半14N－DNA，将这种杂交分子经加热变性，对于变性前后的DNA分别进行CsCl密度梯度离心，结果变性前的杂交分子为一条中密度带，变性后则分为两条区带，即重密度带(15N－DNA)及低密度带(14N－DNA)。它们的实验只有用半保留复制的理论才能得到圆满的解释(图2和16-3)。图2DNA的半保留复制第一代分子含有一条亲代的链(用黑色素示)，与另一条新合成的链(用白色表示)配对。在以后的连续复制过程中，原来亲代的两条链仍然保持完整，因此总有两个分子各具有一条原来亲代的链

图3DNA的半保留复制－MeslsonStahl实验密度梯度离心后的DNA位置：左三管为对照；右三管为实验结果1.2半不连续性复制（DNAsynthesisissemidiscontinuous）LaggingstrandofDNAmustgrowoverallinthe3´-5´directionandissynthesizeddiscontinuouslyintheformofshortfragments(5´-3´)thatarelaterconnectedcovalently.

LeadingstrandofDNAissynthesizedcontinuouslyinthe5´-3´direction.

Okazakifragmentsaretheshortstretchesof1000-2000basesproducedduringdiscontinuousreplication;theyarelaterjoinedintoacovalentlyintactstrand.

Semidiscontinuousreplicationismodeinwhichonenewstrandissynthesizedcontinuouslywhiletheotherissynthesizeddiscontinuously.OntheleadingstrandDNAsynthesiscanproceedcontinuouslyinthe5′to3′directionastheparentalduplexisunwound.

Onthelaggingstrandastretchofsingle-strandedparentalDNAmustbeexposed,andthenasegmentissynthesizedinthereversedirection(relativetoforkmovement).Aseriesofthesefragmentsaresynthesized,each5′3′;thentheyarejoinedtogethertocreateanintactlaggingstrand.2．参与DNA复制的有关物质2.1DNApolymerasesinprokaryoticDNApolymerasesareenzymesthatsynthesizeadaughterstrand(s)ofDNA(underdirectionfromaDNAtemplate).Maybeinvolvedinrepairorreplication.DNA聚合酶Ⅰ，(DNApolymeraseⅠ,简写DNApolⅠ)、DNA聚合酶Ⅱ和DNA聚合酶Ⅲ。(DNApolymeraseⅡ，Ⅲ，简写DNApolⅡ,DNApolⅢ)见表1。这种酶的共同性质是：①需要DNA模板，因此这类酶又称为依赖DNA的DNA聚合酶(DNAdependentDNApolymerase,DDDP)。②需要RNA或DNA做为引物(primer)，即DNA聚合酶不能从头催化DNA的起始。③催化dNTP加到引物的3′桹H末端，因而DNA合成的方向是5′→3′。④三种DNA聚合酶都属于多功能酶，它们在DNA复制和修复过程的不同阶段发挥作用。由于DNA聚合酶Ⅰ是研究得最清楚而且代表了其他DNA聚合酶的基本特点，所以我们着重介绍DNApolⅠ的作用并指出另外二种DNApol的特殊性：DNApolymerasestypicallyhavenucleaseactivitiesaswellastheabilitytosynthesizeDNA.A3′5′exonucleaseactivityistypicallyusedtoexcisebasesthathavebeenaddedtoDNAincorrectly.Thisprovidesa"proofreading"error-controlsystem,asweseeinthenextsection.2.1.1DNA聚合酶Ⅰ（DNApolymeraseI）ThefirstenzymetobecharacterizedwasDNApolymeraseI,whichisasinglepolypeptideof103kD.Thechaincanbecleavedintotworegionsbyproteolytictreatment.Thelargercleavageproduct(68kD)iscalledtheKlenowfragment.Itisusedinsyntheticreactionsinvitro.Itcontainsthepolymeraseandthe3′5′exonucleaseactivities.TheC-terminaltwo-thirdsoftheproteincontainsthepolymeraseactivesite,whiletheN-terminalthirdcontainstheproofreadingexonuclease.Theactivesitesare~30Åapartintheprotein,indicatingthatthereisspatialseparationbetweenaddingabaseandremovingone.Thesmallfragment(35kD)possessesa5′3′exonucleolyticactivity,whichexcisessmallgroupsofnucleotides,upto~10basesatatime.Thisactivityiscoordinatedwiththesynthetic/proofreadingactivity.ItprovidesDNApolymeraseIwithauniqueabilitytostartreplicationinvitroatanickinDNA.(NootherDNApolymerasehasthisability.)Atapointwhereaphosphodiesterbondhasbeenbrokeninadouble-strandedDNA,theenzymeextendsthe3′OHend.AsthenewsegmentofDNAissynthesized,itdisplacestheexistinghomologousstrandintheduplex.(1)DNA聚合酶的5′→3′聚合活性：(2)DNA聚合酶的3′→5′外切核酸酶活性：(3)DNA聚合酶的5′→3′外切核酸酶活性：许多实验证实DNApolⅠ并不是DNA复制过程中的主要酶，它的作用主要与DNA损伤后的修复有关。2.1.2DNA聚合酶Ⅱ(DNApolymeraseⅡ)此酶分子量为120KD，每个细胞约有100个酶分子，但活性只有DNApolⅠ的5%，它具有5′→3′聚合活性和3′→5′外切活性，而没有5′→3′外切活性，它的作用可能与DNA损伤修复有关。2.1.3DNA聚合酶Ⅲ(DNApolymeraseⅢ)这是在DNA复制过程中起主要作用的聚合酶，它是由一个多亚基组成的蛋白质分子，其分子量＞600kDa整个酶分子形成一个不对称的二聚体，每个大肠杆菌细胞中只有10?0个酶分子，但催化dNTP参入DNA链的速率却是最快的，约为9000核苷酸/每分钟/每个酶分子。这也证明DNApolⅢ是DNA复制过程中主要发挥作用的酶。在大肠杆菌染色体DNA进行复制时，DNA聚合酶Ⅲ全酶并不是单独起作用的，而是与引发体，介链酶等构成一个复制体(replisome)。由于复制体的存在，先导链和随从链可以同时复制。DNApolⅢ是由多亚基组成的不对称二聚体，它可能同时负责先导链和随从链的复制，在φ×174的复制中观察到引发体总是伴随着DNAloop的存在。DNApolymeraseIII(thereplicase)isalargeenzymecomplex.ThereplicaseactivitywasoriginallydiscoveredbyalethalmutationinthednaElocus,whichcodesforthe130kDαsubunitthatpossessestheDNAsyntheticactivity.The3′5′exonucleolyticproofreadingactivityisfoundinanothersubunit,ε,codedbydnaQ.ThebasicroleoftheεsubunitincontrollingthefidelityofreplicationinvivoisdemonstratedbytheeffectofmutationsindnaQ:thefrequencywithwhichmutationsoccurinthebacterialstrainisincreasedby>103fold.表1大肠杆菌DNA聚合酶特征

DNA聚合酶ⅠDNA聚合酶ⅡDNA聚合酶Ⅲ分子量109KD120KD＞600KD每个细胞中的分子数40017-10010-205′→3′聚合活性+++37℃转化率核苷酸数／酶分子·分钟6003030,0005′→3′外切活性+--3′→5′外切活性+++切刻平移活性+--对dNTP亲和力低低高功能修复不详复制去除引物

填补空缺

2.2真核生物DNA聚合酶(DNApolymerasesinprokaryotic)真核生物DNA聚合酶有α、β、γ、δ及ε。它们的基本特性相似于大肠杆菌DNA聚合酶，其主要活性是催化dNTP的5′→3′聚合活性，基本特征见表2。表2真核生物DNA聚合酶αβγδε亚基数44425分子量（KD)＞25036-38160-300170256细胞内定位核核线粒体核核5′→3′聚合活性＋＋＋＋＋3′→5′外切活性－－－－－

功能复制、引发修复复制复制复制真核细胞在DNA复制中起主要作用的是DNApolα，主要负责染色体DNA的复制。DNApolβ的模板特异性是具有缺口的DNA分子，被认为它与DNA修复有关。DNApolγ在线粒体DNA的复制中起作用。DNApolδ不但有5′→3′聚合活性，而且还具有3′→5′外切酶活性，据认为真核生物DNA复制是在DNApolα和DNApolδ协同作用下进行的，前导链的合成靠DNApolδ催化。而随从链的合成靠DNApolα和引发酶配合作用完成。2.3DNA复制起始引发体的形成及所参与的酶和蛋白质：2.3.1.解链酶(helicase)DNA开始复制时首先在起始点处解开双链，反应是在一种解链酶(helicase)的催化下进行的。解链酶需要ATP分解供给能量。大肠杆菌中DnaB蛋白就有介链酶活性，与随从链的模板DNA结合，沿5′→3′方向移动，还有一种叫做Rep蛋白和前导链的模板DNA结合沿3′→5′方向移动。解链酶的作用就是打开DNA双链之间的氢键。2.3.2单链结合蛋白：(singlestrandbindingproteins,SSBP)它与解开的单链DNA结合，使其稳定不会再度螺旋化并且避免核酸内切酶对单链DNA的水解，保证了单链DNA做为模板时的伸展状态，SSBP可以重复利用。2.3.3引发体的形成：Primerisashortsequence(oftenofRNA)thatispairedwithonestrandofDNAandprovidesafree3´-OHendatwhichaDNApolymerasestartssynthesisofadeoxyribonucleotidechain.(1)引物酶(primase)Aprimaseisrequiredtocatalyzetheactualprimingreaction.ThisisprovidedbyaspecialRNApolymeraseactivitythatistheproductofthednaGgene.Theenzymeisasinglepolypeptideof60kD(muchsmallerthanRNApolymerase).TheprimaseisanRNApolymerasethatisusedonlyunderspecificcircumstances,thatis,tosynthesizeshortstretchesofRNAthatareusedasprimersforDNAsynthesis.DnaGprimaseassociatestransientlywiththereplicationcomplex,andtypicallysynthesizesan1112baseprimer.PrimersstartwiththesequencepppAG,oppositethesequence3′GTC5′inthetemplate.(2)引发体(primosome)高度解链的模板DNA与多种蛋白质因子形成的引发前体促进引物酶结合上来，共同形成引发体，引发体主要在DNA随从链上开始，它连续地与引物酶结合并解离，从而在不同部位引导引物酶催化合成RNA引物，在引物RNA的3′桹H末端接下去合成DNA片段，这就是随从链不连续合成的开始。2.4与超螺旋松驰有关的酶：拓扑异构酶(topoisomerase)是一类改变DNA拓扑性质的酶。在体外可催化DNA的各种拓扑异构化反应，而在生物体内它们可能参与了DNA的复制与转录。在DNA复制时，复制叉行进的前方DNA分子部分产生有正超螺旋，拓扑酶可松驰超螺旋，有利于复制叉的前进及DNA的合成。DNA复制完成后，拓扑酶又可将DNA分子引入超螺旋，使DNA缠绕、折叠，压缩以形成染色质。DNA拓扑异构酶有Ⅰ型和Ⅱ型，它们广泛存在于原核生物及真核生物中。表3大肠杆菌和真核生物中的拓扑异构酶类型作用对超螺旋的作用Ⅰ型拓扑异构酶大肠杆菌切开一股DNA链松驰负超螺旋真核生物切开一股DNA链松驰正，负超螺旋Ⅱ型拓扑异构酶大肠杆菌切开二股DNA链松弛正超螺旋；依赖ATP引入负超螺旋，解环连等真核生物切开二股DNA链松驰正超螺旋，依赖ATP但不能引入负超螺旋拓扑异构酶Ⅰ(TopoⅠ)的主要作用是将环状双链DNA的一条链切开一个口，切口处链的末端绕螺旋轴按照松驰超螺旋的方向转动，然后再将切口封起来。这就使DNA复制叉移动时所引起的前方DNA正超螺旋得到缓解，利于DNA复制叉继续向前打开。拓扑异构酶Ⅰ除上述作用外，对环状单链DNA还有打结或解结作用，对环状双链DNA的环连或解环连以及使环状单链DNA形成环状双链DNA都有作用(图13)。拓扑异构酶Ⅱ(TopoⅡ)是在大肠杆菌中发现的，曾被称为旋转酶(gyrase)，它们作用特点是切开环状双链DNA的两条链，分子中的部分经切口穿过而旋转，然后封闭切口，TopoⅡ还可使DNA分子从超螺旋状态转变为松驰状态，此反应不需要ATP参与。DNA复制完成后，TopoⅡ在ATP参与下，DNA分子从松驰状态转变为负超螺旋。此外，TopoⅡ催化的拓扑异构化反应还有环连或解环连，以及打结或解结。3DNA复制的过程：Initiationinvolvesrecognitionofanoriginbyacomplexofproteins.BeforeDNAsynthesisbegins,theparentalstrandsmustbeseparatedand(transiently)stabilizedinthesingle-strandedstate.Thensynthesisofdaughterstrandscanbeinitiatedatthereplicationfork.Elongationisundertakenbyanothercomplexofproteins.ThereplisomeexistsonlyasaproteincomplexassociatedwiththeparticularstructurethatDNAtakesatthereplicationfork.Itdoesnotexistasanindependentunit(forexample,analogoustotheribosome.AsthereplisomemovesalongDNA,theparentalstrandsunwindanddaughterstrandsaresynthesized.Attheendofthereplicon,joiningand/orterminationreactionsarenecessary.Followingtermination,theduplicatechromosomesmustbeseparatedfromoneanother,whichrequiresmanipulationofhigher-orderDNAstructure.DNA复制的全部过程可以人为地分成三个阶段，第一个阶段为DNA复制的起始阶段，这个阶段包括起始点，复制方向以及引发体的形成，第二阶段为DNA链的延长，包括前导链及随从链的形成和切除RNA引物后填补空缺及连接岗崎片段。第三阶段为DNA复制的终止阶段。3.1DNA复制的起始阶段：3.1.1DNA复制的起始点ThetwostrandsofDNAmustsuffertheirinitialseparation.Thisisineffectameltingreactionoverashortregion.AnunwindingpointbeginstomovealongtheDNA;thismarksthegenerationofthereplicationfork,whichcontinuestomoveduringelongation.Thefirstnucleotidesofthenewchainmustbesynthesizedintotheprimer.Thisactionisrequiredoncefortheleadingstrand,butisrepeatedatthestartofeachOkazakifragmentonthelaggingstrand.很多实验都证明：复制是从DNA分子上的特定部位开始的，这一部位叫做复制起始点(originofreplication)常用ori或o表示。细胞中的DNA复制一经开始就会连续复制下去，直至完成细胞中全部基因组DNA的复制。DNA复制从起始点开始直到终点为止，每个这样的DNA单位称为复制子或复制单元(replicon)。在原核细胞中，每个DNA分子只有一个复制起始点，因而只有一个复制子，而在真核生物中，DNA的复制是从许多起始点同时开始的，所以每个DNA分子上有许多个复制子。DNA复制起始点有结构上的特殊性，例如：大肠杆菌染色体DNA复制起始点Oric由422个核苷酸组成，是一系列对称排列的反向重复序列，即回文结构(palindrome)，其中有9个核苷酸或13个核苷酸组成的保守序列，这些部位是大肠杆菌中DnaA蛋白识别的位置，大肠杆菌染色体DNA是环状双链DNA，它的复制是典型的“θ”型复制(由于形状像希腊字母θ)。从一个起点开始，同时向两个方向进行复制，当两个复制方向相遇时，复制就停止。而有些生物的DNA复制起始区是一段富含A·T的区段。这些特殊的结构对于在DNA复制起始过程中参与的酶和许多蛋白质分子的识别和结合都是必须的。3.2DNA复制的延长阶段DNA的复制实际上就是以DNA为模板在DNA聚合酶作用下，将游离的四种脱氧单核苷酸(dATP,dGTP,dCTP,dTTP,简写为dNTP)聚合成DNA的过程。这是一个非常复杂的酶促反应，需要许多种酶和蛋白质参与，现分别叙述它们在DNA复制中作用。图4DNA聚合酶Ⅲ催化先导链和随从的合成图5大肠杆菌DNA复制叉中复制过程简图AsthereplisomemovesalongDNA,unwindingtheparentalstrands,itelongatestheleadingstrand.PeriodicallytheprimosomeactivityinitiatesanOkazakifragmentonthelaggingstrand.WecanproposetwotypesofmodelforwhathappenstotheDNAreplicasewhenitcompletessynthesisofanOkazakifragment.Itmightdissociatefromthetemplate,sothatanewcomplexmustbeassembledtoelongatethenextOkazakifragment.Orthesamecomplexmaybereutilized.3.3DNA复制的终止阶段DNA在复制过程中，合成出的前导链为一条连续的长链。随从链则是由合成出许多相邻的片段，在连接酶的催化下，连接成为一条长链。连接作用是在连接酶催化下进行的。连接酶(ligase)的作用是催化相邻的DNA片段以3′、5′－磷酸二酯键相连接。连接反应中的能量来自ATP(或NAD＋)。连接酶先与ATP作用，以共价键相连生成E桝MP中间体。中间体即与一个DNA片段的5′－磷酸相连接形成E-AMP-5′－DNA。然后再与另一个DNA片段的3′-OHH末端作用，E和AMP脱下，两个DNA片段以3′、5′磷酸二酯键相连接。随从链的各个DNA片段就是这样连接成一条DNA长链(图14)。图6连接酶的催化反应已有研究证明大肠杆菌染色体DNA具有复制终止位点，此处可以结合一种特异的蛋白质分子叫做Tus，这个蛋白质可能是通过阻止解链酶(Helicase)的解链活性而终止复制的。详细的机制还不完全清楚。DNA复制完成后，靠拓扑酶将DNA分子引入超螺旋结构。3.4五、真核生物DNA复制的特点：DNA复制的研究最初是在原核生物中进行的，有些原核生物的DNA复制已经搞得很清楚。真核生物比原核生物复杂得多，但DNA复制的基本过程还是相似的。在这里我们主要讨论一些重要的区别。图7端粒酶催化端区TG链的合成1.与原核生物不同，真核生物DNA复制有许多起始点，例如酵母S.cerevisiae的17号染色体约有400个起始点，因此，虽然真核生物DNA复制的速度(60核苷酸/每秒钟)比原核生物DNA复制的速度(E.coli1700核苷酸/每秒钟)慢得多，