分子生物学技术孔瑾

分子生物学技术孔瑾聚合酶链式反应（PCRPolymeraseChainReaction）

一种人工在体外进行快速DNA片断扩增的方法。PCR技术基本原理

PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。RAPDSSRRFIPRT-PCRNested-PCRPCRmutagenesis(诱变)RaceGenomicwalkingReversetranscriptase(RT)-PCRAAA(A)n5‘-CapmRNA(dT)12~18

primeranneal5‘-CapAAA(A)n3‘5‘ReversetranscriptiondNTP,RT5‘-CapAAA(A)n5‘cDNA:mRNAhybridRegularPCRNestedPCRFirstroundprimersFirstroundPCRSecondroundprimersSecondroundPCRGeneofinterestSP6primerT7primerForwardmutagenicprimerReversemutagenicprimerFirstPCRRemoveprimersDenatureandannealExtendtofulllengthbyDNApolymerase3’3’PCRmutagenesis(诱变)SecondPCRSP6primerT7primerDNAcloning克隆(clone)

一个细胞或个体以无性繁殖的方式产生一群细胞或一群个体，在不发生突变的情况下，具有完全相同的遗传性状，常称无性繁殖(细胞)系。其动词含义指，即技术。

分子克隆(clone,cloned,cloning)

在生物体外用重组技术将特定基因插入载体分子中.将DNA片段(或基因)与载体DNA分子共价连接，然后引入寄主细胞，再筛选获得重组的克隆，按克隆的目的可分为DNA和cDNA克隆两类。

分子克隆Cloningvectors(克隆载体):在基因工程重组DNA技术中将DNA片段（目的基因）转移至受体细胞的一种能自我复制的DNA分子。

E.colicloningvector(circular): plasmids(质粒) bacteriophages(landM13)(噬菌体) plasmid-bacteriophagelhybrids(cosmids) (考斯质粒,质粒和噬菌体杂和体).Yeastcloningvector:yeastartificial chromosomes(YACs，酵母人工染色体) (Linear)限制性内切酶连接酶用相同的限制性内切酶对插入片段和载体同时酶切。用连接酶将插入和载体连接。将连接产物导入感受态细胞中。在有抗生素的培养基上筛选阳性转化子。Recreatedvector:bluetransformantsRecombinantplasmid:containinginsertedDNA:whitetransformantsRecreatedvector(noinsert)Recombinantplasmid(containinsert)克隆载体只是携带外源基因，使其在宿主细胞内扩增，表达载体不仅使外源基因扩增，还要使其表达。凝胶阻滞电泳(ElectrophoreticmobiliyshiftassayEMSA)EMSA是体外分析DNA与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。基本原理蛋白质与DNA结合后将大大增加分子量，在凝胶电泳中，DNA朝正电极移动的距离与其相对分子量的队数成正比。没有结合蛋白质的DNA移动较快，结合了蛋白质的DNA由于受到阻滞移动较慢。用放射性同位素标记待测DNA片段，然后与提取物温育，形成DNA-蛋白质复合物，电泳后用放射性自显影技术可以确定DNA条带的位置，从而确定它与蛋白质是否结合。DNAboundtotwoproteinsDNA-proteincomplexBareDNAADNAboundwithmorethanoneproteintoformalargercomplex.DNaseIfootprinting(DNaseI足迹法)确认和蛋白质互作的DNA序列。AATAAG5’*SequenceladderisrequiredtodeterminetheprecisepositionBindproteinDNase(mild),thenremoveproteinanddenatureDNADNasefootprinting

和蛋白质结合的DNA不被DNase降解.

电泳，放射性自显影015[Protein]ThethreelanesrepresentDNAthatwasboundto0,1,and5unitsofprotein.

Thelanewithnoprotein

showsaregularladderoffragments.Thelanewithoneunitshowssome

protection,andthelane

with5unitsshowscompleteprotectioninthemiddle.

Byincludingsequencingladders,wecantellexactlywheretheproteinbound.TCGGAGCAACGCAAACAAACGTGCTTGG酵母双杂交yeasttwo-hybridsystem很多真核转录调控因子有两个相互独立的结构域组成：DNA结合域（DNAbindingdomain,BD）和转录激活域

(activationdomain,AD)BD能和特定的基因的启动子区结合，但不能接获基因的转录。AD可以在适当的空间激活转录克隆(clone)一个细胞或个体以无性繁殖的方式产生一群细胞或一群个体，在不发生突变的情况下，具有完全相同的遗传性状，常称无性繁殖(细胞)系。RemoveprimersRNAonblot凝胶阻滞电泳(ElectrophoreticmobiliyshiftassayEMSA)酵母单杂交系统很多真核转录调控因子有两个相互独立的结构域组成：DNA结合域（DNAbindingdomain,BD）和转录激活域(activationdomain,AD)Recombinantplasmid(containinsert)colicloningvector(circular):DNAcloningcDNA:mRNAhybridFirstround在有抗生素的培养基上筛选阳性转化子。Removeprimers每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。Thelanewithnoprotein

showsaregularladderoffragments.酵母双杂交的原理

运用基因重组技术将已知蛋白的DNA序列连接到带有酵母转录因子的DNA结合结构域编码区的表达载体上，转化酵母后能够形成融合蛋白（诱饵蛋白）。将已知编码转录激活结构域（AD）的DNA分别与待筛选的cDNA文库中的不同插入片段相连接，在酵母中表达形成融合蛋白（猎物蛋白）。如果诱饵蛋白和猎物蛋白能够相互作用，AD和BD结构域会被拉近，从而激活报告基因的表达。这是一种研究蛋白质相互作用的方法。酵母双杂交yeasttwo-hybridsystem酵母单杂交系统顺式作用元件基本启动子报告基因转录因子AD运用基因重组技术将特定顺式作用元件构建到基本启动子上游，把报告基因连接到基本启动子下游。将待测转录因子cDNA与已知酵母激活域（AD）的融合表达载体转入酵母，如果待测转录因子能和顺式作用元件结合，就能激活基本启动子，从而激活报告基因的表达。这是一种研究DNA和蛋白质互相作用的系统。1.GelelectrophoresisseparatesDNAandRNAmoleculesaccordingtosize,shapeandtopologicalpropertiesGelElectrophoresis（凝胶电泳）1.DNAandRNAmoleculesarenegativelycharged,thusmoveinthegelmatrix(胶支持物)towardthepositivepole(正电极).2.LinearDNAmoleculesareseparatedaccordingtosizes.ThelargeDNAmoleculesmoveslowerthanthesmallmolecules.3.ThemobilityofcircularDNAmoleculesisaffectedbytheirtopologicalstructures.ThemobilityofthesamemolecularweightDNAmoleculewithdifferentshapesis:supercoiled(超螺旋)>linear(线性)>nickedorrelaxed(缺刻或松散)

DNAgelmobility(DNA在胶上的迁移性)Agarose(琼脂糖):amuchlessresolvingpowerthanpolyacrylamide,butcanseparateDNAmoleculesofuptotensofkb1kb0.5kb2kb3kb4kbPolyacrylamide

(聚丙稀酰胺):hashighresolvingcapability,andcanresolveDNA/RNAthatdifferfromeachotheraslittleasasinglebasepair/nucleotide.分子杂交分子杂交是通过各种方法将核酸分子固定在固相支持物上,然后用放射性标记的探针与被固定的分子杂交,经显影后显示出目的DNA或RNA分子所处的位置。

类型核酸探针应用SouthernDNADNAorRNA基因拷贝数等NorthernRNADNAorRNARNA大小和表达丰度WesternProtein抗体蛋白的大小和丰度ComparisonofSouthern,NorthernandWesternbolthybridizationSouthernandNorthernblottingDNAonblotRNAonblotGenomicDNApreparation RNApreparationRestrictiondigestion -Denaturewithalkali -Agarosegelelectrophoresis

DNAblotting/transferandfixationRNA6.Probelabeling

6.Hybridization (temperature)

7.Signaldetection(X-rayfilmorantibody)

SouthernandNorthernblottingDNAonblotRNAonblotGenomicDNApreparation RNApreparationRestrictiondigestion -Denaturewithalkali -Agarosegelelectrophoresis

DNAblotting/transferandfixationRNA6.Probelabeling

6.Hybridization (temperature)

7.Signaldetection(X-rayfilmorantibody)

RemoveprimersThelanewithoneunitshowssome

protection,andthelane

with5unitsshowscompleteprotectioninthemiddle.RNA大小和表达丰度DNAblotting/transferandfixationRNADNAonblotDenaturewithalkali -到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。确认和蛋白质互作的DNA序列。DNaseIfootprinting(DNaseI足迹法)Signaldetection(X-rayfilmorantibody)运用基因重组技术将已知蛋白的DNA序列连接到带有酵母转录因子的DNA结合结构域编码区的表达载体上，转化酵母后能够形成融合蛋白（诱饵蛋白）。在有抗生素的培养基上筛选阳性转化子。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。将已知编码转录激活结构域（AD）的DNA分别与待筛选的cDNA文库中的不同插入片段相连接，在酵母中表达形成融合蛋白（猎物蛋白）。LinearDNAmoleculesareseparatedaccordingtosizes.DNaseIfootprinting(DNaseI足迹法)在有抗生素的培养基上筛选阳性转化子。Thelanewithnoprotein

showsaregularladderoffragments.Recombinantplasmid(containinsert)Recreatedvector(noinsert)酵母双杂交yeasttwo-hybridsystemRNAonblotDNAboundto凝胶阻滞电泳(ElectrophoreticmobiliyshiftassayEMSA)