实验三酶联免疫吸附试验

BioengineeringCollegeDalianUniversity定义：

利用抗体分子能与抗原分子特异性结合的特点，将游离的杂蛋白和结合于固相载体的目的蛋白分离，并利用特殊的标记物对其定性或定量分析的一种检测方法。BioengineeringCollegeDalianUniversityBioengineeringCollegeDalianUniversity采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。测定的对象可以是抗体也可以是抗原。在这种测定方法中有3种必要的试剂：①固相的抗原或抗体（免疫吸附剂）②酶标记的抗原或抗体（标记物）③酶作用的底物（显色剂）基本原理BioengineeringCollegeDalianUniversity基本原理

三个基本原理抗原或抗体能物理性地吸附于固相表面，并且保持其免疫活性；抗原或抗体能与酶通过共价键形成酶结合物，同时保持各自的免疫活性和酶活性；酶结合物与相应的抗原或抗体结合后，能通过加入底物的颜色反应来确定免疫反应的发生，颜色反应的深浅与标本中相应抗原或抗体的量成正比。BioengineeringCollegeDalianUniversity

是指酶标抗原或抗体直接与包被在酶标板上的抗体或抗原结合形成酶标抗原-抗体复合物，加入酶反应底物，测定产物的吸光值。直接法：ELISA方法的分类BioengineeringCollegeDalianUniversity

是当抗体（一抗）和包被在酶标板的抗原结合形成复合后，再以酶标二抗和复合物结合，加入酶反应底物，测定产物的吸光值。间接法：BioengineeringCollegeDalianUniversity

是先将未标记的抗体包被在酶标板上，用于捕获抗原，再用酶标的抗体与抗原反应形成抗体-抗原-酶标抗体复合物

。夹心法：BioengineeringCollegeDalianUniversityBioengineeringCollegeDalianUniversity96孔酶标板

包被抗原（牛血清白蛋白，BSA）；封闭液（3%脱脂奶粉）

兔抗BSA抗体

酶标记羊抗兔IgG抗体（酶标记物）；

底物

（OPD）；抗体稀释液（PBS）；

洗涤液（PBS-0.05%Tween20）；

反应终止液

（2N硫酸）。试剂BioengineeringCollegeDalianUniversity实验步骤1.抗原的处理：2.包被抗原：取酶标板，加入50μL/孔的抗原稀释液（5ug/孔）37℃，放置1.5h抗原50ug/ul利用PBS稀释抗原500倍1234AB56789101112123456789101112BioengineeringCollegeDalianUniversity包被：将抗原或抗体固定在固相载体的过程称为包被。加样时应将所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。BioengineeringCollegeDalianUniversity洗涤：PBS-0.05%Tween20洗3次BioengineeringCollegeDalianUniversity4℃，放置一周3封闭加入200μL/孔的3%脱脂奶粉1234AB5678910111212345678910111237℃，放置1hBioengineeringCollegeDalianUniversity封闭：是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。目的：抗原或抗体包被时所用的浓度较低，吸收后固相载体表面尚有未被占据的空隙，封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥在ELISA其后的步骤中干扰物质的再吸附。BioengineeringCollegeDalianUniversity取出酶标板，甩干孔内液体以PBS-0.05%Tween20（200μL/孔）洗涤3次洗涤：BioengineeringCollegeDalianUniversity4.加兔抗BSA抗体标记各孔，加入相应液体100μL/孔阴性阳性37℃，40min1234AB567891011121234567891011122004008001600……阴性阴性…………XXXX抗原+++-一抗+---二抗+-++一抗1234AB5678910111212342004008001600……一抗1234CD5678910111212342ul兔抗BSA抗体+198ulPBS100ul取100ul）100ul取100ul）100ul取100ul100ul取100ul）100ul取100ul）………BioengineeringCollegeDalianUniversity取出酶标板，甩干孔内液体以PBS-0.05%Tween20（200μL/孔）洗涤3次洗涤：BioengineeringCollegeDalianUniversity4.加二抗：各孔加入酶标羊抗兔IgG100μL/孔（4000倍稀释）37℃，40minBioengineeringCollegeDalianUniversity取出酶标板，甩干孔内液体以PBS-0.05%Tween20（200μL/孔）洗涤3次洗涤：BioengineeringCollegeDalianUniversity

显色显色是ELISA中的最后一步温育反应，此时酶催化无色的底物生成有色的产物。底物显色一般在室外温或37℃反应20-30分钟后即不再加深，再延长反应时间，可使本底值增高。底物液受光照会自行变色，显色反应应避光进行，显色反应结束时加入终止液终止反应。BioengineeringCollegeDalianUniversity5.显色：加入底物溶液100μL/孔避光显色，37℃10-20min底物溶液:

邻苯二胺（OPD）10mg

0.1M柠檬酸6.1ml

0.2MNa2HPO46.4ml

蒸馏水12.5ml

搅拌10min临用前加入30%H2O24ul每组分2.5mlBioengineeringCollegeDalianUniversity阴性对照(negativecontrol)1，不加抗原孔

2，不加一抗孔

3，不加二抗孔阳性对照(positivecontrol)7.观察结果6.终止反应加入50ul/孔2MH2SO4取出包被好抗原的酶标板（4孔/组），甩干孔内液体以洗涤液（200μL/孔）洗涤3次，3min/次4.加兔抗BSA抗体标记各孔，加入相应液体100μL/孔1234阴性空白阳性待测4.加二抗：37℃，湿盒内，30min甩干孔内液体以洗涤液（200μL/孔）洗涤3次，3min/次各孔加入酶标二抗100μL/孔37℃，湿盒内，30min5.显色：甩干孔内液体以洗涤液（200μL/孔）洗涤3次，3min/次加入底物溶液100μL/孔避光显色，10min6.观察结果Bioengi