高三生物一轮复习课件动物细胞工程

第52讲

动物细胞工程回归课本：第2章第2节P43-55动物细胞工程常用的技术包括：动物细胞培养P43-47

动物细胞融合技术与单克隆抗体☆P48-51

动物体细胞核移植技术和克隆动物P52-55一、动物细胞培养概念：动物细胞培养是从动物体中取出相关的组织或器官,将它分散成单个细胞，然后在适宜的培养条件下,让这些细胞生长和增殖的技术。动物细胞培养所需的基本条件其他条件营养条件糖类、氨基酸、无机盐、维生素无菌、无毒的环境适宜的温度、pH和渗透压适宜的气体环境实质：动物细胞培养是对体内细胞生长和繁殖的模拟动物细胞工程的基础1、条件营养①无机物：无机盐等②有机物：糖类、氨基酸、维生素、_____等无菌、无毒环境①对培养液和所有培养用具进行灭菌处理②在无菌环境下进行操作③定期更换_______，以便清除代谢物温度、pH和渗透压①温度：哺乳动物细胞多以_____________为宜②pH：多数动物细胞生存的适宜pH为_________气体环境血清培养液36.5±0.5℃7.2～7.495%空气和5%CO2一、动物细胞培养严格配置而成的合成培养基+血清等天然成分还需要考虑渗透压联想：给患者输氧时要含5%CO2，但目的是

。刺激呼吸中枢可以用胃蛋白酶处理吗？不可以，pH不适宜。用胰蛋白酶、胶原蛋白酶等处理，去掉组织间蛋白，将组织分散成单个细胞动物组织处理后的初次培养当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞通常会停止分裂增殖。取动物组织制成细胞悬液放入CO2培养箱中培养转入培养液进行原代培养体外培养的动物细胞悬浮生长类：会因细胞密度过大、有害代谢物积累和培养液中营养物质缺乏等因素而分裂受阻。贴壁生长类：（大多数）除受以上因素影响外，还会发生接触抑制现象。一般取材于动物胚胎或幼龄动物的组织、器官，原因：细胞分化程度低，增殖能力强，容易培养。原因：a.从动物体取出的成块组织中，细胞与细胞靠在一起，彼此限制了生长和增殖；b.能使细胞与培养液充分接触，更易进行物质交换。保证细胞所需的营养物质的供应及有害产物的及时排出。2、过程需贴附于基质表面分瓶后的细胞培养取动物组织制成细胞悬液放入CO2培养箱中培养转入培养液进行原代培养放入CO2培养箱中培养传代培养悬浮生长类：直接用离心法收集贴壁生长类：重新用胰蛋白酶等处理，使之分散成单个细胞，然后再用离心法收集。将收集的细胞制成细胞悬液，分瓶培养。2、过程P45思考题：植物组织培养和动物细胞培养的比较比较项目植物组织培养动物细胞培养原理植物细胞的全能性细胞增殖培养基物理性质固体培养基液体培养基培养基特有成分蔗糖、植物激素血清培养结果植物体细胞群体培养目的快速繁殖、作物脱毒等获得细胞或细胞产物基础过手P116附录1蔗糖：提供能源、调节渗透压(2021.浙江)下图为动物成纤维细胞的培养过程示意图。下列叙述正确的是（）A．步骤①的操作不需要在无菌环境中进行B．步骤②中用盐酸溶解细胞间物质使细胞分离C．步骤③到④的分瓶操作前常用胰蛋白酶处理D．步骤④培养过程中不会发生细胞转化C

细胞转化是指细胞在受到某些因素（如辐射、病毒、化学物质等）影响下，其遗传性状发生改变的过程高考练兵处理贴壁细胞，分散成单个细胞再分瓶培养二、干细胞培养及其应用1.干细胞的定义一类具有______和_______能力的细胞。在一定条件下，可以分化成其他类型的细胞。分裂分化a：分裂增殖，干细胞自我更新b和c：分化，形成其他类型的细胞干细胞(stemcell)的培养成功是动物细胞培养领域重大成就之一。_____________________________等多种组织和器官。2.干细胞的分布早期胚胎骨髓脐带血3.干细胞的种类干细胞胚胎干细胞成体干细胞成体组织或器官内的干细胞，具有组织特异性，只能分化成特定的细胞或组织，不具有发育成完整个体的潜能。存在于早期胚胎中，具有分化为成年动物体内的任何一种类型的细胞，并进一步形成机体的所有组织和器官甚至个体的潜能。二、干细胞培养及其应用胚胎干细胞（简称ES细胞）ES细胞可以在体外分化成心肌细胞、神经元和造血干细胞等细胞。成体干细胞造血干细胞血细胞神经系统中神经干细胞精原干细胞神经细胞精原细胞骨髓、外周血和脐带血中睾丸中分化分化分化二、干细胞培养及其应用4.干细胞的应用有自我更新能力和分化潜能的干细胞与组织、器官的发育、再生和修复等密切相关。移植修复或替换正常干细胞患者体内受损的器官或组织治愈疾病正常的造血干细胞移植患者体内修复或替换受损的血细胞治疗白血病造血系统、免疫系统功能障碍疾病正常的神经干细胞移植患者体内修复或替换受损的神经组织治疗神经组织损伤和神经退行性疾病(帕金森病阿尔茨海默病)二、干细胞培养及其应用5.诱导多能干细胞胚胎干细胞必须从胚胎中获取，这涉及伦理问题，因而限制了它在医学上的应用，如何解决这一问题？已分化的体细胞类似胚胎干细胞的一种细胞体外诱导分化各种类型细胞移植病人体内设想：2006年，科学家通过体外诱导小鼠成纤维细胞，获得了类似胚胎干细胞的一种细胞，将它称为诱导多能干细胞(简称iPS细胞)，之后用iPS细胞治疗了小鼠的镰状细胞贫血。2007年，科学家通过类似的方法成功诱导出人类的iPS细胞。体细胞永生化iPS细胞细胞衰老肿瘤细胞c-MycKlf4Oct3/4Sox2Klf4P46旁栏科学家利用逆转录病毒作为载体将4种特定的基因导入人的体细胞中表达，诱导形成iPS细胞。成纤维细胞T细胞和B细胞iPS细胞导入特定基因导入特定蛋白小分子化合物诱导治疗心血管疾病治疗阿尔茨海默病…

…①诱导过程无需破坏胚胎②iPS细胞可以来源于病人自身的体细胞，将它移植回病人体内后，理论上可以避免免疫排斥反应科学家普遍认为iPS细胞的应用前景优于胚胎干细胞。5.诱导多能干细胞iPS细胞应用的优点：2006年，山中伸弥利用逆转录病毒载体将四个基因的组合转入已分化的小鼠胚胎或成体成纤维细胞，获得小鼠iPS细胞。2012年就获得诺奖。2007年，Jaenisch研究组得到iPS细胞并成功治疗小鼠镰刀状红细胞性贫血，这项研究从理论和实践上为人类单基因遗传病的治疗奠定了基础。0102iPS细胞研究历史（标志性事件）2009年，中国科学家周琪和曾凡一研究组由iPS细胞培育出了具有繁殖能力的小鼠：”小小”。在世界上首次证明了iPS细胞的全能性。由此，iPS细胞的研究进入了新纪元。2008年，YingShaoYao研究组报道，将皮肤癌细胞重编程为iPS细胞，该研究开辟了一条获得iPS细胞的新途径。0403iPS细胞研究历史（标志性事件）2013年，北大邓宏魁研究组用四种小分子化合物组合诱导小鼠体细胞重编程为可分化发育为各种组织器官类型的多潜能干细胞，邓宏魁研究组将其命名为CiPS。该成果向制备无遗传修饰的iPS细胞方面迈出了一大步。2014年，科学家利用iPS细胞分化成视网膜细胞，并移植到一名70多岁的渗出型老年黄斑变性女患者的右眼中。这是世界首例利用iPS细胞完成的移植手术。0506iPS细胞研究历史（标志性事件）武大生物系本科→上交医学院免疫学硕士→UCLA免疫学博士2018年，中国科学家丁胜研究组，通过靶向技术激活內源基因，可成功实现体细胞多功能性的诱导，获得iPS细胞。该研究不仅提供了一种构建诱导性多能干细胞的方法，也帮助人们更好地理解了表观遗传修饰调控细胞命运的机制。07iPS细胞研究历史（标志性事件）2021年，科学家借助基因技术，修改了iPS细胞中的基因，成功培养出只攻击癌细胞的T细胞，其效果已在小鼠实验中得到确认，朝着癌症免疫疗法实用化更进一步。0809在座的你c-Myc作为原癌基因，它的导入增加了细胞的成瘤的概率。iPS细胞存在导致肿瘤发生的风险，导致iPS细胞无法在短期内进入临床应用。体细胞永生化iPS细胞细胞衰老肿瘤细胞c-MycKlf4Oct3/4Sox2Klf4iPS细胞应用的缺点：1970年人-鼠细胞融合实验灭活的仙台病毒诱导三、动物细胞融合技术有没有技术能让不同种动物的体细胞进行杂交，培育出集不同细胞的优势于一身的动物细胞呢？1、定义动物细胞融合技术就是使两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的技术。诱导融合杂交细胞融合后形成的杂交细胞就有原来两个细胞的遗传遗传信息。三、动物细胞融合技术2、诱导融合的方法物理方法：电融合法等诱导融合杂交细胞化学方法：PEG融合法生物方法：灭活病毒诱导法与植物原生质体融合的诱导方法相同P49旁栏：19世纪30年代，科学家曾在肺结核、天花和麻疹等疾病的病人的病理组织中观察到多核细胞。说明病人体内病毒等诱导多个体细胞融合形成了多核细胞。生物方法：灭活病毒诱导法灭活：是指用物理或化学手段使病毒或细菌失去感染能力，但并不破坏它们的抗原结构。原理：病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞相互凝集，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。3、意义①突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能。至今，种间、属间、科间，甚至动物和植物之间的细胞融合都已获得成功。②成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和培育生物新品种等的重要手段。利用动物细胞融合技术而发展起来的杂交瘤技术，为制造单克隆抗体开辟了新途径三、动物细胞融合技术获得杂种植株细胞膜的流动性细胞膜的流动性细胞的全能性去除细胞壁后诱导原生质体融合使细胞分散后诱导细胞融合物理、化学方法灭活的病毒制备单克隆抗体物理、化学方法基础过手基础过手—利用细胞融合定位已知人的体细胞和小鼠的体细胞(2N=40)杂交(融合)后，杂种细胞在有丝分裂过程中，人的染色体逐渐地丢失，最后仅保留少数几条。由于人染色体的丢失是随机的，因此不同的杂种细胞会保留不同的人染色体。举例：测定不同的杂种细胞中人胸苷激酶的活性，结果见下表。由表分析：人胸苷激酶基因位于______号染色体上。17将人、鼠细胞悬液混合并诱导细胞融合（只考虑细胞两两融合）后，在HAT培养基上，同时含有T、H基因（独立遗传）的细胞才能存活和增殖。增殖过程中，细胞内人染色体随机丢失，只残留一条或几条。对处于分裂中期细胞的镜检结果如下表。下列叙述正确的是()BA.在HAT培养基上，融合细胞均能存活和增殖B.可以确定①的基因组成为TTTTHHhhhhC.可以确定①②③的相关基因组成相同D.可以将T（t）基因定位于人第17染色体细胞融合细胞人鼠细胞标号残留人染色体ttHHTThh①17②10、10、17③17、X同时有T和H人17号染色体的HH+鼠的TTTTThhhh（基因已复制）为什么要制备单克隆抗体？传统抗体的生产方法——传统抗体的生产方法有什么缺陷？向动物反复注射某种抗原使动物产生抗体从动物血清中分离所需抗体四、单克隆抗体及其应用缺陷：产量低、纯度低、特异性差为什么产量低、纯度低、特异性差？动物在生活中会接触多种天然抗原，并且每个天然抗原物质可能有多种抗原决定簇。虽然反复给免疫动物注射某种抗原加强免疫，但是动物在免疫反应过程中，体内产生的特异性抗体种类可多达百万种以上。因此在免疫动物血清中会有多种抗体混杂在一起。每个B细胞只分泌一种特异性的抗体，要想获得大量的单一抗体，必需克隆单一的B淋巴细胞，形成细胞群克隆B淋巴细胞不具有无限增殖的能力，因此上述方案不可行。如何获得既能无限增殖又能产生抗体的细胞？一个B淋巴细胞B淋巴细胞群单克隆抗体产生四、单克隆抗体及其应用如何制备单克隆抗体？如何获得既能无限增殖又能产生抗体的细胞？1975年，英国科学家米尔斯坦和德国科学家科勒设计实验获得了单克隆抗体，因此获得1984年诺贝尔生理学或医学奖。多种杂交细胞注射特定的抗原多种B淋巴细胞培养骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞诱导融合将骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合1.制备单克隆抗体的过程多种杂交细胞用特定的选择培养基进行筛选；在该培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长。对上述经选择培养的杂交瘤细胞进行克隆化培养和抗体检测，经多次筛选，就可获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞。杂交瘤细胞(既能迅速大量增殖，又能产生抗体)抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞在体外大规模培养或注射到小鼠腹腔内增殖。体外培养注射到小鼠腹腔内单克隆抗体从细胞培养液或小鼠腹水中获取大量的单克隆抗体。特定抗原多种B淋巴细胞骨髓瘤细胞诱导融合多种融合细胞选择培养基进行筛选杂交瘤细胞抗体检测分泌所需抗体的杂交瘤细胞体外培养注射小鼠腹腔内增殖克隆化培养多次筛选单克隆抗体获取注射小鼠培养骨髓瘤细胞未融合细胞(第一次筛选)(第二次筛选)回顾：制备单克隆抗体的过程第一次筛选获得杂交瘤细胞①细胞合成DNA有D和S两条途径，其中D途径能被氨基喋呤阻断。②人淋巴细胞中有这两种DNA的合成途径，但不能分裂增殖。

③鼠骨髓瘤细胞中只有D途径，没有S途径，但能不断分裂增殖。筛选出杂交瘤细胞方法？B淋巴细胞及同型融合细胞不能无限增殖，死亡骨髓瘤细胞及同型融合细胞不能无限增殖，死亡杂交瘤细胞能无限增殖，生长培养基中加入氨基喋呤知识拓展知识拓展抗体检测的方法——抗原-抗体杂交法在单克隆抗体制备过程中，两次筛选的目的和方法是不相同的。将杂交瘤细胞群稀释，约每孔1个细胞进行培养（克隆化培养）一段时间后，检测各孔上清液中细胞分泌的抗体上清液可与特定“二抗”结合的培养孔为阳性孔多孔细胞培养板抗体检测板分泌抗体能跟特定“二抗”结合的细胞即为所需杂交瘤细胞阳性孔2.单克隆抗体的优点和应用优点灵敏度高、特异性强、可大量制备准确地识别抗原的细微差异与特定抗原发生特异性结合①作为诊断试剂②运载药物应用③作为药物治疗疾病诊断疾病治疗疾病①作为诊断试剂应用利用放射性同位素或荧光标记的单克隆杭体，在特定的组织中成像的枝术，可定位诊断肿瘤、心血管畸形等疾病。病毒蛋白的检测依赖抗体(如图)优点：可以省去提取病毒核酸的繁琐步骤，直接用发病期患者的血清或痰液进行蛋白免疫分析，在短时间内就可得到结果。缺点：相比核酸检测，蛋白检测具有滞后性，不能及时检测出是否感染病毒。思考·讨论资料1:用抗人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体做成的“早早孕诊断试剂盒”在妊娠第8天就可以做出诊断，这比原来的诊断方法提前了10d左右，可以避免孕妇在不知道妊娠的情况下因服用药物而对胎儿造成不利影响。该方法检测的准确率在90%以上。②运载药物应用ADC=单克隆抗体+接头+药物抗体-药物偶联物（ADC）由单克隆抗体、连接子和小分子细胞毒药物偶联而成，可以像精准制导的导弹一样对癌细胞实施精准打击。瞄准装置爆炸装置ADC示意图抗体药物接头ADC的作用机制示意图①ADC②③④溶酶体裂解释放药物⑤细胞凋亡应用③治疗疾病单克隆抗体不仅可以运载药物，而且自身也能用于治疗疾病。单克隆抗体药物占有非常重要的地位。排名药物中文名销售额(亿美元)适应症类型1Humria修美乐199.36自身免疫疾病单抗6Herceptin赫赛汀70.32乳腺癌等多种癌症单抗7Avastin安维汀68.98结肠癌等多中癌症单抗8Rituxan美罗华68.01白血病单抗9Opdivo纳武单抗67.35多种肿瘤单抗2018年全球药物销售额排名前10的单抗药物修美乐已连续8年蝉联榜首。2021年新冠疫苗(mRNA疫苗)位居榜首，修美乐位居第二位。1、（2020.北京）人体感染新冠病毒后，机体会产生多种特异性抗体。我国科学家从康复者的浆细胞中克隆出针对病毒表面抗原的抗体基因相关序列，构建表达载体并在相应系统中表达，可制备出全人源单克隆抗体。以下表述错误的是(

)A．该单抗可直接用于新冠病毒的核酸检测B．在该单抗制备过程中利用了基因工程技术C．该单抗可与新冠病毒相应蛋白特异性结合D．可用抗原—抗体反应检测抗体基因表达产物A高考练兵C对，A错。单抗检测是利用抗体-抗原（即病毒蛋白）结合，检测病毒核酸是利用DNA分子杂交2．（2021.山东）一个抗原往往有多个不同的抗原决定簇，一个抗原决定簇只能刺激机体产生一种抗体，由同一抗原刺激产生的不同抗体统称为多抗。将非洲猪瘟病毒衣壳蛋白p72注入小鼠体内，可利用该小鼠的免疫细胞制备抗p72的单抗，也可以从该小鼠的血清中直接分离出多抗。下列说法正确的是(

)A．注入小鼠体内的抗原纯度对单抗纯度的影响比对多抗纯度的影响大B．单抗制备过程中通常将分离出的浆细胞与骨髓瘤细胞融合C．利用该小鼠只能制备出一种抗p72的单抗D．p72部分结构改变后会出现原单抗失效而多抗仍有效的情况D高考练兵单抗的制备过程有筛选，而多抗从血清直接分离，没有筛选，因此抗原纯度对多抗纯度影响更大书上一直说B淋巴细胞，原因：在实际操作过程中，浆细胞与骨髓瘤细胞的融合极其困难，成功率极低。因此更倾向于使用未彻底分化的b细胞，融合后再诱导。p72有多种抗原决定簇，可分别刺激产生多种抗p72的单抗结构改变只引起部分抗原决定簇的改变，由这些抗原决定簇产生的抗体失效，但由其他抗原决定簇产生的抗体依然有效5、动物细胞核移植技术1概念、原理及类型概念将动物一个细胞的_______移入_______________中，使这个______________发育成_______，继而发育成_________的技术。用核移植的方法得到的动物称为克隆动物原理___________的全能性分类__________核移植；_______核移植细胞核去核的卵母细胞重新组合的细胞新胚胎动物个体动物细胞核胚胎细胞体细胞动物体细胞分化程度高，恢复全能性十分困难。因此动物体细胞核移植的难度就明显高于胚胎细胞核移植在动物体细胞核移植中，非人灵长类尤为困难，原因①②P52①采集牛卵巢中的卵母细胞，在体外培养到MⅡ期②从供体高产奶牛取体细胞,进行培养

③显微操作去核（实际上是去除纺锤体-染色体复合物）

动物细胞培养a、卵母细胞的细胞质内存在激发细胞核全能性表达的物质。b、卵母细胞体积大，便于操作。c、卵母细胞内卵黄多，营养物质丰富显微操作去核法使DNA变性失活，达到去核的目的。没有刺破卵母细胞膜，对卵母细胞伤害小。梯度离心、紫外光短时间照射、化学物质处理P54旁栏一般选用10代以内的细胞，因为10代以内的细胞一般能保持正常的二倍体核型，保证了供体细胞正常的遗传基础。2过程④将供体细胞注射入去核的卵母细胞2过程将供体细胞整个注入去核卵母细胞中的原因：a、保证供体细胞的细胞核不被破坏，操作方便。b、对卵母细胞损伤较小注入到去核卵母细胞透明带——要通过电融合法使两细胞融合，供体核进入卵母细胞，形成重构胚。人工重新构建的胚胎，具有发育成完整个体的能力。电融合法使两细胞融合供体核进入卵母细胞形成重构胚激活重构胚使其完成细胞分裂和发育进程早期胚胎用物理或化学方法：（如电刺激、Ca2+载体、乙醇、蛋白酶合成抑制剂）将胚胎移入（受体）代孕母牛生出与供体奶牛遗传物质基本相同的犊牛（克隆牛）2过程原理：利用动物细胞核的全能性。通过无性繁殖获得克隆动物。利用了动物细胞培养、细胞核移植等技术P54思考题：(1)在体细胞的细胞核移植到受体卵母细胞之前，为什么必须先去掉受体卵母细胞的核？为使核移植的胚胎的核遗传物质全部来自有重要利用价值的动物提供的体细胞，在供体细胞的细胞核移至受体细胞之前，必须将受体细胞的核遗传物