2024海洋贝类片形科吸虫PCR检测方法

范 缩略 试 样 安 附 PCR检测方法，包括试剂、仪器与设备、样品、检测方（Fgigantica）GB/T6682GB19489-2008SN/T1193SC/T7103TAE：Tris、乙酸（Aceticacid）和EDTAITS：内部间隔序列（InternaltranscribedEDTA：乙二胺四乙酸（EthylenediaminetetraaceticSDS：十二烷基磺酸钠（SodiumdodecylTE：Tris盐酸和EDTA缓冲液（EDTATris-EB：溴化乙锭（EthidiumPCR：聚合酶链式反应（PolymerasechainTris：三羟甲基氨基甲烷（Trishydroxymethyl水：符合GB/T6682氯仿/异戊醇混合液（241）酚/氯仿/异戊醇混合液（25241）：吸虫中380bp片段。CR检测阳性对照为已知受片形科吸虫感染的贝类组织样品或添加片形科吸虫保守序列标准品质粒的贝类组织样品，CR8保存。EB（10μg/μL）：按附录A.410%SDS：按附录A.53mol/LNaAc（pH5.0）：按附录A.82×PremixTaqDNA聚合酶：生化试剂，-20℃V~300V）、微量移液器（0.1μL~2.5μL，0.5μL~10μL，10μL~100μL，20μL~200μL，100μL~1000μL规格）、微量移液器吸头（1mL，200μL，1000μL规格）、2mL冻存管、1.5mL离心管、200速不小于12000rpm）。在海洋贝类产地或水产市场，按照SC/T71032mL冻存管中，液氮冷冻。电子天平称取新鲜或冷冻样品的匀浆组织0.05g，转移至1.5mL加入450μL55℃水浴4h～6h，每2h颠倒离心管6～8室温12000rpm离心20min，取上清至新的1.5mL加入等体积酚/氯仿/异戊醇混合液（25:24:1），缓慢颠倒混匀5min，12000rpm离心10min，取上层清液至新的1.5mL离心管。加入等体积氯仿/异戊醇混合液（241），缓慢颠倒混匀5min，12000rpm离心10min，取上层清液至新的1.5mL离心管。加入1/10体积3mol/L的NaAc（pH5.0，4℃保存）和等体积-20℃预冷的无水乙醇，置于-20℃沉淀DNA30min，12000rpm离心5min，弃去上清。加入100μL～150μL-20℃预冷的70%乙醇洗涤，12000rpm离心5min，小心弃去乙醇，用置于烘箱中45℃干燥15min～30min，加入适量TE缓冲液溶解DNA（TE量视DNA沉淀量而定，在30μL～100μL之间，一般为50μL），-20℃保存备用。表 20μL2×PermixTaqDNA10检测引物ITS-F（1021检测引物ITS-R（1021样品50～100补至20伸5min；4℃保温。40mL1.5%琼脂糖凝胶（A.9配制。凝胶冷却后放入电泳槽内，在1×TAE电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶。9μLPCR1μL10DNA分子120V20min380bp380bp实验室安全防护按GB/T19489检测过程中防污染措施按照SN/T1193 录0.5mol/LEDTA-Na2（乙二铵四乙酸二钠）溶液，pH8.0EDTA-Na2H2O 186.1g灭菌去离子 8005mol/LpH8.01000mL，121℃，15min 242冰乙 57.10.5mol/LEDTA溶液 1001000mL，121℃，15min灭菌备用。1×使用。73251000.1EB（1020210SDS10010TE1MTris-Tris 6.06 40mL0.5M 9.306dd 35NaOH颗粒（1g）pH8.050mLTE1MTris- 10.5MEDTA（pH 0.2ddH2O1001MTris-HCl（pH 10.5M 20 0.5844ddH