DB31∕T 1287-2021 实验东方田鼠病原学等级及监测

实验东方田鼠病原学等级及监测上海市市场监督管理局发布I 1 1 14缩略语 2 2 36.1外观要求 36.2病原学检测项目 37检测程序 3 49监测规则 49.1检测频率 49.2采样要求 49.3样本采集 5 5 5附录A(规范性)实验东方田鼠病原体PCR检测方法 6Ⅱ本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由上海市科学技术委员会提出并组织实施。本文件由上海市实验动物标准化技术委员会归口。本文件起草单位：上海实验动物研究中心、上海海关动植物与食品检验检疫技术中心。本文件主要起草人：谢建芸、魏晓锋、冯洁、熊炜、林金杏、薛俊欣、王胜昌、高诚。本文件为首次发布。1实验东方田鼠病原学等级及监测本文件规定了实验东方田鼠病原学等级及监测，包括实验东方田鼠病原2规范性引用文件仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本GB14922.1实验动物寄生虫学等级及监测GB14922.2实验动物微生物学等级及监测GB/T14926.1实验动物沙门菌检测方法GB/T14926.4实验动物皮肤病原真菌检测方法GB/T14926.6实验动物支气管鲍特杆菌检测方法GB/T14926.12实验动物嗜肺巴斯德杆菌检测方法GB/T14926.14实验动物金黄色葡萄球菌检测方法GB/T14926.41实验动物无菌动物生活环境及粪便标本的检测方法GB/T14926.42实验动物细菌学检测标本采集GB/T14926.43实验动物细菌学检测染色法、培养基和试剂GB/T14926.52实验动物免疫荧光试验GB/T14926.53实验动物血凝实验GB/T18448.1实验动物体外寄生虫检测方法GB/T18448.2实验动物弓形虫检测方法GB/T18448.3实验动物兔脑原虫检测方法GB/T18448.4实验动物卡氏肺孢子虫检测方法GB/T18448.6实验动物蠕虫检测方法GB/T18448.10实验动物肠道鞭毛虫和纤毛虫检测方法3术语和定义实验东方田鼠laboratoryreed普通级东方田鼠conventional(CV)reed2除普通级东方田鼠应排除的病原外，不携带对实验东方田鼠健康有较大危害、主要潜在感染或条PCR:聚合酶链反应(polymerasechainreaction)东方田鼠等级无菌级普通级沙门菌Salmonellaspp.●皮肤病原真菌PathogenicdermalfungiO●汉坦病毒Hantavirus(HV)●体外寄生虫(节肢动物)Ectoparasites●弓形虫Toxoplasmagondii●无特定病原体级支气管鲍特杆菌BordetellabroncO●●●金黄色葡萄球菌Staphylococcusaureus●仙台病毒SendaiVirus(SV)●小鼠肺炎病毒PneumoniaVirusofMice(PVM)●呼肠孤病毒Ⅲ型ReovirustypeIⅢ(Reo-3)●全部蠕虫AllHelminths●卡氏肺孢子虫PneumocystiscariniiO兔脑原虫EncephalitozooncuniculiO鞭毛虫Flagellates●纤毛虫Cilliates●●36.1外观要求外观健康、行为体征正常。6.2病原学检测项目东方田鼠病原学检测项目见表1。7检测程序对受检实验东方田鼠应在当日按细菌、真菌、病毒和寄生虫要求联合取样检测，检测程序见图1。48检测方法病原检测项目沙门菌皮肤病原真菌按照GB/T14926.6实验动物支嗜肺巴斯德杆菌按照GB/T14926.12实验动物嗜肺巴斯德杆菌金黄色葡萄球菌按照GB/T14926.14实验动物金黄色葡萄球菌弓形虫按照GB/T18448.2实验动物弓形虫检测方法兔脑原虫按照GB/T18448.3实验动物兔脑原虫检测方法卡氏肺孢子虫按照GB/T18448.4实验动物卡氏肺孢子虫按照GB/T18448.6实验动物蠕虫检测方法按照GB/T18448.10实验动物肠道鞭毛纤毛虫按照GB/T18448.10实验动物肠道鞭毛小鼠肺炎病毒呼肠孤病毒Ⅲ型按照GB/T14926.41实验动物无菌动物生9监测规则每3个月至少检测一次。9.2采样要求选择8周龄以上实验东方田鼠用于检测。5同一实验东方田鼠生产繁殖单元或种群，根据种群规模确定取样数量，具体见表表3实验东方田鼠不同繁殖单元或种群取样数量群体数量(只)取样数量(只，雌雄各半)小于100不少于6不少于10大于500不少于20a)对于寄居于呼吸道的病原体，应采集气管分泌物或气b)定位于肠道的病原体，应采集回盲部内容物或粪便；c)定植于皮肤的病原体，应采集皮9.3.2采样方法a)血液、皮肤、气管分泌物、回盲部内容物、粪便：按GB/T14926.42进行；部鼠毛，用酒精消毒皮肤后解剖，暴露胸腔和腹腔，剪取相应器样品应保持新鲜，采样后原则上应立即进行细菌接种或提取核酸用于病原体的PCR扩增。不能立即接种的组织、拭子样品等须置于无菌试管2-8℃保存或存于运输培养基中，24h内完成接种；不能立即提取核酸的标本，在2～8℃条件下保存不应超过24h,超过24h保存的用于提取DNA的样品应置于-20℃以下冰箱，用于提取RNA的样品应置于-80℃以下冰箱，于2周内完成核酸提取。在被检样品中，如有1个样品1项指标不符合该等级要求，则判定该批次实验东方田鼠不合格；根据检测结果，出具检测报告。报告应包括但不限于：被检动物批次、检6附录A(规范性)实验东方田鼠病原体PCR检测方法A.1材料扩增引物序列见表A.1,引物加灭菌去离子水配制成10μmol/L,-20℃以下保存。表A.1PCR引物序列、产物长度、扩增部位及扩增条件引物序列P1:5'-AACAGGATTAGATAP2:5'-TGACGGGCGGTGTGTA容物95℃变性30s,55℃30s,20个循环P3:5'-GTGCTAGGTGTTGGGP4:5'-TACTTTACGTAGCCTGT95℃变性30s,55℃30s,20个循环P1:5'-AGCGTTTGCTTCACTTTP2:5'-GGGCATTTCCTCCCTAA95℃变性30s,55℃30s,35个循环络丛脑膜炎P1:5'-AGTGATGAGTCCTTCACATCP2:5'-GGATCCTAGGCATTTGATTG30s,35个循环P1:5'-ACGAGGGGCAGCTTGTGATAGP2:5'-GACATCCTCATATGAGCTGTCP1:5'-CCACATTGGTCTCGTGTCAGATTC5'-CATCATTCACGAAATC呼肠孤病毒Ⅲ型P1:5'-CAGTCGACACATTTGTGP2:5'-GCGTACTGACGTGGAT小鼠肺炎病毒P1:5'-GGATCTTTCTAGTCCTTCTGP2:5'-CATCTCTAATCAATGCAATCTPCR仪、高速离心机、电泳仪、紫外分光光度A.2方法A.2.1采样及标本处理7心管中，加入1mLPBS(pH7.4)充分匀浆，备用。A.2.2样品保存不能立即提取核酸的标本，在2~8℃条件下保存不应超过24h,超过24h保存的用于提取DNA的样品应置于-20℃以下冰箱，用于提取RNA的样品应置于-80℃以下冰箱，于2周内完成核酸提取。A.2.2核酸提取核酸提取按说明书进行。核酸样品经紫外分光光度OD260/280比值在1.6～1.8之间为合格。制备好的核酸应尽快进行下一步PCR反应，若暂时不能进行PCR反应，DNA样品应置于-20℃以下冰箱保存，RNA样品应置于-80℃以下冰箱保存，2周内完成PCR扩增。A.2.3逆转录(仅限RNA病毒适用)RNA逆转录体系见表A.2。反应体系的配制应在冰浴上进行，反应条件为：37℃反转录反应15min,85℃反转录酶失活反应5s。反应产物即为cDNA,应立即进行下一步PCR反应，若不能立即进行PCR,cDNA样品应置于-20℃以下冰箱保存。表A.2RNA逆转录反应体系用量(μL)2PrimeScriptRTEnzymeMixIRandomPrimer6mers(100μmol4总体积A.2.4PCR体系PCR反应体系见表A.3。反应体系的配制应在冰浴上进行，每次反应同时应设阳性对照、阴性对表A.3PCR反应体系用量(μL)2×TaqPlusMasterMix(Dye118总体积A.2.5反应程序895℃预变性5min;PCR反应条件及循环