临床常见真菌检验（微生物学检验技术课件）

第十五章

真菌及检验

真菌形态检验技术一、标本采集常见标本类别

◆浅部感染：毛发、皮屑、指甲等◆深部感染：脓、痰、血液、脑脊液、宫颈分泌物等注意事项◆标本来源适宜

◆用药前采集标本

◆严格无菌操作◆标本量充足◆立即送检

一、标本采集检验程序一、标本采集二、直接镜检镜检的意义：①有诊断意义，如浅部真菌病等；②通过真菌的形态，可确定某些致病性真菌的属或种,如假丝酵母菌的厚膜孢子等。镜检的局限性：①阴性结果不能排除真菌感染；②有假阳性结果。因此，对直接镜检可疑结果应作复查或用其他检验方法鉴定。直接采取标本制片、显微镜下直接观察，若发现真菌菌丝或孢子存在时，即可初步判定为真菌感染。标本KOH溶液加热镜检常用方法：二、直接镜检菌丝孢子革兰染色法

乳酸酚棉兰染色法荧光染色法墨汁染色法糖原染色三、染色镜检

真菌培养技术一、基本条件2.培养基沙保弱培养基常用；无选择性选择性培养基放线菌酮-氯霉素琼脂鉴别培养基马铃薯葡萄糖琼脂等1.常用工具一、基本条件培养基名称培养基用途沙氏培养基真菌的常规培养放线菌酮-氯霉素琼脂真菌的常规培养玉米粉吐温-80琼脂观察白假丝酵母菌的厚膜孢子马铃薯葡萄糖琼脂

观察真菌菌落色素，用于鉴别尿素琼脂生化反应鉴别培养（红色癣菌和石膏样癣菌）心脑浸液葡萄糖血琼脂深部真菌培养二、培养方法分离培养

分离培养；观察菌落

保存菌种

观察结构、生长发育过程平皿培养法斜面培养法小培养法二、培养方法分离培养小培养法：三、检查方法分离培养三、生长现象（1）生长速度：菌落在7～10天内出现者，为快速生长；3周只有少许生长者为慢速。

（2）菌落大小

（3）表面形态（4）菌落性质：酵母型、酵母样型和丝状菌落。（5）菌落颜色：丝状菌落表面和底层颜色不同。（6）菌落边缘

（7）菌落底部菌落观察：

真菌鉴定方法鉴定1.生化反应鉴定糖(醇)类发酵试验同化碳源试验同化氮源试验明胶液化试验尿素分解试验2.免疫学检查鉴定3.其他鉴定试验芽管形成试验:

待检菌→动物血清→37℃、2~4h

→镜检观察芽管厚膜孢子形成试验：待检菌→吐温-80玉米粉琼脂

→37℃→观察厚膜孢子鉴定3.其他鉴定试验动物接种病理组织检查核酸检测真菌毒素检测常见病原性真菌第三节一、浅部感染真菌浅部感染真菌——是指寄生或腐生于角蛋白组织（表皮角质层、毛发和甲板等）的真菌。主要有：表皮癣菌、毛癣菌、小孢子癣菌。生物学性状一、浅部感染真菌生物学性状一、浅部感染真菌临床意义传播方式：接触致病特点：侵犯表皮表面角质层，机械刺激和增殖致病理改变。一、浅部感染真菌微生物检验标本：病变部位标本。检验方法：

直接镜检分离培养荧光检查二、深部感染真菌——深部感染真菌是指可引起机体深部组织和内脏疾病的一群真菌。深部感染真菌致病性真菌条件致病真菌组织胞浆菌、球孢子菌等白假丝酵母菌、新隐球菌等二、深部感染真菌白假丝酵母菌G+、椭圆形，出芽繁殖，可形成假菌丝；酵母样菌落，在玉米培养基上可形成厚膜孢子；1.生物学性状二、深部感染真菌白假丝酵母菌2.临床意义条件致病菌，机体抵抗力下降或菌群失调是其侵入机体的主要原因。皮肤：腋窝等部位

粘膜：鹅口疮、口角糜烂、外阴与阴道炎等内脏感染：肺炎、支气管炎、脑膜炎等二、深部感染真菌白假丝酵母菌3.微生物学检验直接镜检：假菌丝可帮助诊断。分离培养：标本→沙保弱培养基→培养鉴定：

芽管形成试验

厚膜孢子形成试验TTC试验

糖发酵、糖同化试验二、深部感染真菌白假丝酵母菌3.微生物学检验二、深部感染真菌新型隐球菌1.生物学性状G+、球形菌体，有宽厚荚膜，无假菌丝；

酵母型菌落。二、深部感染真菌新型隐球菌2.临床意义外源性感染，肺是主要入侵途径；多数症状不明显，自愈；严重者呈暴发性感染，死亡；经血行传播至中枢神经及其它组织，引起慢性脑膜炎；二、深部感染真菌新型隐球菌3.微生物学检验脑脊液离心沉淀涂片墨汁负染镜检鉴定：糖同化试验

酚氧化酶试验（新型隐球菌黑色菌落）

脲酶试验二、深部感染真菌其他真菌曲霉菌二、深部感染真菌其他真菌毛霉菌G试验GM试验G试验又称1,3-β-D葡聚糖试验，检测的是真菌的细胞壁成分1,3-β-D葡聚糖，人体的吞噬细胞吞噬真菌后，能持续释放该物质，使血液及体液中含量增高。1,3-β-D葡聚糖可特异性激活鲎变形细胞裂解物中的G因子，引起裂解物凝固，故称G试验。G试验真菌细胞壁成分1,3-β-D葡聚糖G因子，活化G因子凝固酶原，凝固酶显色，光度法测定G试验G试验适用于除隐球菌和毛霉菌外的所有深部真菌感染的早期诊断较好的敏感性和特异性，假阳性率较低只能提示有无真菌侵袭性感染，并不能确定为何种真菌感染，这是此方法的缺陷。G试验--假阳性（1）使用纤维素膜进行血透，标本或患者暴露于纱布或其他含有葡聚糖的材料（2）静脉输注免疫球蛋白、白蛋白、凝血因子或血液制品；（3）链球菌血症；G试验--假阳性（4）操作者处理标本时存在污染。另外，使用多糖类抗癌药物、放化疗造成的粘膜损伤导致食物中的葡聚糖或定植的念珠菌经胃肠道进入血液等也可能造成假阳性。GM试验--侵袭性曲霉菌感染的早期诊断检测的是半乳甘露聚糖（glactomannan,GM），半乳甘露聚糖是广泛存在于曲霉和青霉细胞壁的一种多糖，菌细胞壁表面菌丝生长时，半乳甘露聚糖从薄弱的菌丝顶端释放，是最早释放的抗原，可以通过酶联免疫吸附试验法进行检测。GM试验曲霉菌感染部位主要集中在肺部，从而引起肺部侵袭性曲霉，诊断曲霉菌在肺部是定植还是侵袭性生长，关键在于其是否合成GM，GM试验是诊断侵袭性曲霉感染的微生物检查证据之一。GM试验GM试验对其他真菌检测无效，且敏感性和特异性受诸多因素影响，以下情况可出现假阳性：（1）使用使用半合成青霉素尤其是哌拉西林/他唑巴坦；（2）新生儿和儿童；（3）血液透析；（4）自身免疫性肝炎等；（5）食用可能含有GM的牛奶等高蛋白食物和污染的大米等。以下情况可出现假阴性：（1）释放入血循环中的曲霉GM（包括甘露聚糖）并不持续存在而是会很快清除；（2）以前使用了抗真菌药物；（3）病情不严重；（4）非粒细胞缺乏的患者。

临床注意事项

1）G试验和GM试验检测的物质不同，代谢规律存在差异，影响因素也有较大差别，二者不能互相取代。二者联合应用可以提高对侵袭性真菌病的诊断能力。

2）GM试验和G试验均存在假阳性结果，可以通过多次检测来降低假阳性率。因此，G试验和GM试验阳性的病例仍需结合临床表现综合判断是否存在真菌感染。

临床注意事项3）我国的侵袭性真菌病指南