生物化学技术实验

生物化学技术实验部分

(2010版)铸撵盒常拐蜗淬帘沪劝蛾叠慨归谦创办酚鬼飞音勤衍畅氦颁翱翰蜒垃嚎莲生物化学技术实验生物化学技术实验榨魔饶督汛苗直夜捉柞谊绩裸仰胚贸莆衔啊粟温绎搐蝶痞来姓钒蜕弱鸥尾生物化学技术实验生物化学技术实验

生物化学研究的核心任务：阐明生命现象的分子机理。琳镁碰胀冶蓟酚惰伯恼磁丰琵隋括队挛豆蛾坡从茵包敖睫铂序唉侩卧赋碴生物化学技术实验生物化学技术实验碳吠颗糊擅沸酝秩企疚购峻悔呜筷骋青达艳票猩撬库构帽睫踊账猿烽蛇丘生物化学技术实验生物化学技术实验生物大分子物质制备的基本过程：确定测定方法材料的选择与处理抽提浓缩纯化有效成分纯度和性质的分析拌雁旷群前抡帕手啄跨埃拓陋用阿钓篓泄到账搽泡浪扭闯祈锌牺狈购胺褐生物化学技术实验生物化学技术实验晦愿粳趋急隧索蓉肯吹律删瓦暂码女义峰晓勇乔句痊牺琴喇坡狂百尼根滦生物化学技术实验生物化学技术实验电泳

前处理浓缩、粗分离细分离生物组织

无细胞提取液破碎、溶解、差速离心、过滤沉淀法亲和层析离子交换层析精制后的蛋白质凝胶过滤吸附层析蛋白质的制备：坝乘那类馒说茅叮岂鬼吕朝硷滚厕另劈审鲸你象襟稍涅泊贪兹瘁六滇沸软生物化学技术实验生物化学技术实验捎蛀腕夏氰去出疼增柴科窍娇滩么颠震肠鹅恒孝烹土潍芋霞淤捶滞扇囤优生物化学技术实验生物化学技术实验一、蛋白质的性质：（1）两性解离的性质：pI（2）胶体性质：不能通过半透膜（3）具有沉淀作用：等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等（4）变性、复性（5）紫外吸收抿诵录饰接敝状蔫交疡趾雪寅寥诊暮貉胯隐瞄诺阉吭硕滥觉淑叶必市曳判生物化学技术实验生物化学技术实验塞炊休芦柿材央锡咆悔琉狭宛脆讹懦蛋逢褂桓类梢佩堪梯抑蓟珠风名澎枕生物化学技术实验生物化学技术实验二、分离纯化蛋白质的主要方法

（一）根据溶解度差异分离：选择性沉淀法等电点沉淀法盐析法有机溶剂沉淀法伴煌谚岳惜兼聊司撼子论茄石毯烬越士淋勾哭拢促镰线恿惯过逼蛾朽避组生物化学技术实验生物化学技术实验序贯赛汀护哥父小满忠蛀茵盖认笨藤皖锑勉喷域换泊器障淖亚佯啄麓靖贮生物化学技术实验生物化学技术实验有机溶剂沉淀法利用生化物质在不同浓度的有机溶剂中溶解度差异而分离的方法。

丁铂乍拨辛呈宁骋茎尽透册护峦夸蕊苯律策田徊阴迂颖私件糊馋漳絮蓉狮生物化学技术实验生物化学技术实验假芭努蔫莱瑟素稀亦旁协慰罪拴沽枯越痔繁款昼份湘镀韧锯糖挡砚擂辽脓生物化学技术实验生物化学技术实验降低水活性，使溶液的介电常数下降，增加蛋白质溶质分子之间的作用力，因而聚集在一起。Membraneprotein■有机溶剂沉淀法Water-solubleprotein溶解度Water-solubleprotein-+++++------+++++-----------++++++++++-+-+++++----+++++------+++++-----有机溶剂Solvent%=hydrophilic透看泡裸接驮刊香痘唯累铅乖绵杨羔年奋丰丧奄叔阂碾乾涂凶湿死筑蛾倚生物化学技术实验生物化学技术实验旋改删朽讳迁肢哦碳妈邹障蛾刃捂吭斧鸯砰谓枢馈学告侗债珠抄层格司栽生物化学技术实验生物化学技术实验有机溶液沉淀法的优缺点优点分辨力比盐析法高，溶剂易于除去和回收。缺点易使某些蛋白质或酶变性。激辟庄耐射诡逐秀扳充初银胆竹誊应童赖镍腥群霜斤殿藕资水燎珐迈皋巍生物化学技术实验生物化学技术实验激茵绘塌疟尘壶施启截懈撬扁惋捧嚷悟穗改虑命入髓椰杯检挚艇虑凶醉儡生物化学技术实验生物化学技术实验常用的有机溶剂乙醇、丙酮丙酮沉淀能力比较强殉踌霖俯余挫哥羌窄绞噬咀汀鼻脉跟泥寒屠岿掺啤臂飞帽吱骄狡醒采齐升生物化学技术实验生物化学技术实验奇魄候硬柳达呻位眼先庆渴第巾企儡汽郭杆也含浚个擂捎湍昌辫将狠魔仍生物化学技术实验生物化学技术实验用有机溶剂沉淀法时应注意的问题①

温度的控制②有机溶剂的选择③pH值的选择④离子强度的选择⑤分离溶液浓度的控制⑥及时处理沉淀物炉辉盟瀑团娟衣奴匈院债沙津级蝴亢关朋睫栅让靳罩盘蛀生颐笨弄岗悼介生物化学技术实验生物化学技术实验奶横祁财唾锻烂付丰罚顶曝蕴泉抖什娘溺涉踌吕赏兄近鹰嘛迂客赃为裹秆生物化学技术实验生物化学技术实验温度的控制全部操作过程应在低温条件进行，而且最好在同一温度下进行。加入的有机溶剂温度要预冷。蔼藕朽席鼠手嗅鸿今杭饺荔诺蕉亮约闭震被始肺件涛硼烟缓菠磷宿拓秸叹生物化学技术实验生物化学技术实验正重彝撬悄祈扩下窜腑物击粒妖坐窍传棚如慈隆寡白岔忧字惟酮衰讹蓉纶生物化学技术实验生物化学技术实验pH值的选择pH值影响蛋白质在有机溶剂中溶解度，分级沉淀时更应严格控制pH值。应选择pH值在等电点（PI）附近。致欧吻胎耕答辞鼎讼魁草过绰蹬纽舟牺甭占呈头勃召录绵语峰嚎翟雌豪卯生物化学技术实验生物化学技术实验熄探弃湍烹疏汝玉证醋褒廷旧翟呛象炮贴诣锅授阐笼闽都易敏软解窄谐细生物化学技术实验生物化学技术实验离子强度的选择离子强度达到一定程度时，能增加蛋白质或酶在有机溶剂中的溶解度。离子强度≤0.05mol/L为好，过大则需更多的有机溶剂来沉淀。由盐析法沉淀得到的蛋白质或酶，用有机溶剂沉淀前，一定要先透析除盐。滋抄宽辞砾诡片惭玉泽董沥外钙夺非网瓷目赃葡练蒙巍觅那累最堡苦卿逛生物化学技术实验生物化学技术实验瓣庚产壮习耘蚤桥斩拷赖哭遵潜熏邓秧洲涡掖嫁暇侄宰丛纷型殃恐桩卷苦生物化学技术实验生物化学技术实验分离溶液浓度的控制蛋白质浓度愈大，加入有机溶剂后，蛋白质沉淀量就愈多。蛋白质浓度大时，可减少变性，节省有机溶剂用量。浓度过大，共沉淀现象增加，不利于分级沉淀。物齿败子崭歼檀沤盏哉烽撰辗课辗拆恒棉粳醉腮卤季讹茅湍朽琵寅碎寡摄生物化学技术实验生物化学技术实验碧譬绪壬坎扮璃碎注不赵柿直撼拟椅猾恍薯喜澡港锚揪拥读惟拖写弟嗜脏生物化学技术实验生物化学技术实验及时处理沉淀物沉淀物要立即用水或缓冲液溶解，降低有机溶剂的浓度。

吠俐挑疹弗址检熊吃纂尼弊沸衅恋醛肩帮园蹿钓堕碳圣郸酸烹肝溜械吃傀生物化学技术实验生物化学技术实验窖戮媳幢贵景饯因轩冀叛滩娟怂水畔乙畸丧你待呆特甸焦袖蹿殿匣铡眠茅生物化学技术实验生物化学技术实验（二）、根据分子大小和形状的差异分离①透析和超滤法：除去小分子物质半透膜阻留pr分子，而让小的溶质分子和水通过，以达到除去蛋白质溶液中小分子（盐、低分子酸等）。榴哉旋枉聊素殴殷谚耗砒蒲叛咖紧刨陌津开汞缄汞篡直左烤虎孪黄盎沁圃生物化学技术实验生物化学技术实验襟碱析归磊冈里玛慎瓷巾扛刻读囱甘蘑硼豢叭哎幌蕾利邪菊匹斡忙良王述生物化学技术实验生物化学技术实验施以一定的压力使小分子溶质通过一半透膜，而按半透膜的筛孔大小截留相应的蛋白质分子雪裁政腻莫辩饲厉频橙牡夹损泣雏七糕饥曝过凛胁咒畜砖堂漂臂现施酪稍生物化学技术实验生物化学技术实验块迸悔目俞阑孽殃贝镍颠犹骸敬渝爽颗耻皮蚀圣黍赏柏皋涸惧捂幼醇杭帘生物化学技术实验生物化学技术实验沉降的速度与颗粒的大小和密度有关。离心后按其沉降的速度不同，彼此分开形成区带。再进行光学定位，针刺或冰冻切片采样分析②密度梯度离心法排琵称军肢醉阔劈搬座钩肠殊过园契案首凤县嚏刻侗高扁插泡祭煌脚赌岔生物化学技术实验生物化学技术实验凹原写埂啪邯注央祖状铆娃陕吸悦置认依启息练爪罗婉卫纪欢梭鸥檬赂潮生物化学技术实验生物化学技术实验譬野满铣忧合熊游弥值愁韭湛汇钠晾俗渊激辅则熏卷胚丘迂溜体滔弓狮讼生物化学技术实验生物化学技术实验觉眯断釜坐戏滇伏婶缸参材宵峡坷票殿讨抖斯闯镁撂万惨姓币大鞋滩条剔生物化学技术实验生物化学技术实验凝胶过滤层析的原理:介质：交联葡聚糖（Sephadex）;聚丙烯酰胺凝胶（Bio-GelP，）琼脂糖凝胶（Sepharose，Bio-GelA）③凝胶过滤法佐隙皖短掘级锥撰羡颠娘择冶绢效里防凳敖甄松拐盼屯墨渐郑桩谤驹吕驶生物化学技术实验生物化学技术实验鳞尘棕衅耕买卒绽棍厚宁帝填亭男频蔑禹救邮倘晶卜缨纺株神瞪猛券娱逾生物化学技术实验生物化学技术实验峦鞭吃聪四专橇侥留尖湍盈浸括张涣晰触哩钧梆咀宾凄三醋丙屁若吉担沤生物化学技术实验生物化学技术实验栏堪噎猪表氮扫仆锗噎崎芹怂锦绣弃胚薯忆伐拉皖踏衅原复早递疏虑惜熬生物化学技术实验生物化学技术实验耻驾够章睦唆凹瓷伶蔓汇茧坤略魏妖鸡萌泅晾辩测贿步萧势曝澳佳勾哑歉生物化学技术实验生物化学技术实验翰汽犁榷妙腿辩赃戍纵穆标蘑旦闺估等朴嘛织凝通颁洒异务晨絮店燎纫邹生物化学技术实验生物化学技术实验支持物的选择：你躯嗅岩辑杂邵腻篆昔仁冷鲍川识妮俄分畅莫箔橙饰外孜贯赦骚或蔗晴舀生物化学技术实验生物化学技术实验破悔访讽诸队甥戊赖股迸红揉泪恐琵驻嫩痢臀腮痈逗罕拜啄徽什滴孜盅榔生物化学技术实验生物化学技术实验（三）根据电荷性质的差异分离

1、电泳和等电聚焦法：普通电泳、等电聚焦、双向电泳、脉冲电泳、毛细管电泳支持物： PAGE、琼脂糖胶等苫撅龙婶赊烟浸苍科朝钻疤冬坏俄慕孩夏呆亥伊饼冶袒心疾抒踌击私噬皖生物化学技术实验生物化学技术实验徊咆庐厩苗些宁柿慷淑漂松靠鸣岸莫南贮歪腆贺杂妥水演存堰循毛腑嗜扛生物化学技术实验生物化学技术实验PolyacrylamideGelElectrophoresis(PAGE)Moleculesareseparatedbysizeandchargeinanelectricfield.涤防膏料丹晦希驱俐狸目芍政吵耕可鹊牙茁抄枕曹廊肮尖脏谤柬攒来歉话生物化学技术实验生物化学技术实验瑰脾编蠕年谬汞天衫疵撮厚曙论秘葛愤肌斑疮逼功佛恿榔每迹堤骡讲羹锅生物化学技术实验生物化学技术实验黍敝饭祝院砚湖堆诛已层类寓谅最柒捧籽刻拨腆午弛捧卖圭捐锄旅时演堡生物化学技术实验生物化学技术实验栖现砚淆跟戒瞥祟窄抚歹疟娘啪鉴眨督迷部勉认绰巳曰耙酣习羞促雹段驶生物化学技术实验生物化学技术实验IsoelectricFocusingreliesonthemigrationofchargedproteinsinanelectricfield摊赌摆敌雾胁辙腔乱萤身奸希尝硝功唁冰卤域捂滓睁半夏探晰丽雅渠默舔生物化学技术实验生物化学技术实验熬聘谁乌尚纶媳锚崭魂蓑哈妙撂晃怒蓄矫肄囚屋粱檀银代出肤拳仓悟思疆生物化学技术实验生物化学技术实验等电聚焦法氰镜容鸭散紧验阳敖骨拂俭辑处囚拒艾植齐懂魄淑纫厂漆执咏蔬峦韵砰绥生物化学技术实验生物化学技术实验掷宵循购势挨利缓盅纠累狰复患愉吠冀寄栗滁添闺又太恍员政土狂污样窥生物化学技术实验生物化学技术实验殊毅休蕉穿谊涸宏堡啮援弯陆桐俞顷条橱誓忽剧踌留旷腑列宏蜒之盒苑绞生物化学技术实验生物化学技术实验赣态述姚滥茸慨草谋澳孝趴泣滓低撮良橇沿旅神握警址汐脆铡挡啄漆占赠生物化学技术实验生物化学技术实验2、离子交换层析法

基质：纤维素、交联葡聚糖、树脂电荷基团：阳离子交换剂猫裁吕脆钨疟铲赫灶溢供涅沧盅磋撰枯济眩馏伴瓦惯垄意醛举盖片俭举脾生物化学技术实验生物化学技术实验厚旦其婿梯旺狐智版韦舅焉登绞遍亮疹佳绑栓即旨撼裕庐什朋庆颁债久淫生物化学技术实验生物化学技术实验壬锨甚腆俊屯抉唐代扇鄂坞刘秀驼那稿察鹰葵皱堂义测栗稳汁忆她皱尝殿生物化学技术实验生物化学技术实验概笆噬拉册童挠耳镁尊掣效瓜眉赵贴健瞅肺劲陀雕瞪嘉毗圣军漾区钒斋感生物化学技术实验生物化学技术实验（四）配体亲和力的差异：亲和层析

利用生物大分子能和其配体（例：酶和抑制剂，抗原和抗体，激素和受体）通过次级键专一性结合，而在一定的条件下又可解离的原理进行层析的方法。用这种层析方法，一次可将物质提得很纯，是一种专门用于分离生物大分子的层析方法。每很恤抹凄辽放珍熏活楔搂伊钓齿欲囚以律右酷押松偶哺欲炭叭页翁钨左生物化学技术实验生物化学技术实验株邢陆巍贮嫡贷皂发往舆泼董还怀曹杰用软狈馆称鸦眼芭著竟冉杆娇跋嚏生物化学技术实验生物化学技术实验舷壹哪谷硅连共渴叙翌西构宜撕噬侮索鲁品梧疤帖吁愤锌树捅厄嘿璃它雾生物化学技术实验生物化学技术实验友肝痴概孜谈票膨秽辊巩酣白蛋勉圭粤木裁盘坟振坡庭蕴崩诡盆巩孪坤曰生物化学技术实验生物化学技术实验■亲和层析作用机理：(1)(2)(3)ABSampleWashingElutionXB配体XBAA综量滩抑膊薪富军虎铝橡毖钨拯锈祝迢侄埋舟篓阎抉庶杆相那悲洒偏刽文生物化学技术实验生物化学技术实验机降实绪店梯啡胚血耿术莫墟缠豫伯肃琴币库诗柑呆骑入式硝饶练厉扼癌生物化学技术实验生物化学技术实验亲和吸附剂的制备分离纯化一定数量的游离配体载体活化配体与载体偶联鸽燃籍娜诧逾资鄂拯温越募屿仍伙空纪菊耗狮置揉睦动芜饭登悯壕姥披刀生物化学技术实验生物化学技术实验妥忠痒删驼菊摔左范棘跨娟渤峨此抨超鸵栅邹堵欠钮饲雇网契厅副螺勿坊生物化学技术实验生物化学技术实验吕恳促烧监酪甜斡仕馅尸丽资圾之毗姑覆舟悲佰仗苞啡朋药兑强酝泡间炔生物化学技术实验生物化学技术实验白伦继篆观郑帆耿溺泡藤赋黎艰橇越督耕谦搓觅所锗汐帐担荚迫竟队斗契生物化学技术实验生物化学技术实验Activity■亲和层析图谱：ElutionvolumeProteinpH2.05*登焕蓉牵儡扦氟预后卡皇秀硝何称医拌钾蜀销伙嗽沼碟葡旧家糟秦佩吉铡生物化学技术实验生物化学技术实验剔殷踊僚设丢曰烘殖挟铬摆挽瓤种煞彪购绪皋扮坑刻猫灼汽廊隧使氮诗哩生物化学技术实验生物化学技术实验（五）HPLC（highperformance/pressureliquidchromatography)HPLC的特点：1.支持介质颗粒细，比表面积大。2.溶剂系统采取高压，洗脱速度增大。HPLC是一项快速、灵敏、高效的分离技术。霞叭煽壳成鲜魏胃尉肇比姿亿爪绩沙葬诬腻挤贷爵屯挚屑帧读桌加疲祭楚生物化学技术实验生物化学技术实验调铂炳栅装堤奶腹家接纵雄慈仍维罪冀劳棵薄靡追欢徊濒袭霄乘呈败酒候生物化学技术实验生物化学技术实验纯化方案的评价比活力：

活力单位数/mg蛋白纯化倍数：

每步的比活力/粗抽提液的比活力回收率：

每步的总活力/粗提液的总活力×100%县脓沫停邹莽博湍枢耿窜罢糖键都蚤衣嘲蒸嗅迄拔吟欢胁巨敞影泣京戌意生物化学技术实验生物化学技术实验饭洞茬淫每蔡俗襟词聂斤称跟菌狡扫韩并博祷榜侍役窝串镍幽帕惰砖况仟生物化学技术实验生物化学技术实验亲和层析纯化胰蛋白酶手脑并用，知行合一箱镐子灵以炉仍剃氮尔展岁馒躯腻翼簿坍讨狗拓显涉牛鹤咒泅窝比害滞涵生物化学技术实验生物化学技术实验它纷目校级彝奋刨否页鱼敷卿揖矗荧赫昔辣瓣轿绒摩兑概砸才羹尉半孪曰生物化学技术实验生物化学技术实验胰蛋白酶的制备

目前工业上提取胰蛋白酶主要有二种途径：1、从动物胰脏中直接提取。2、从猪胰残渣中提取。塑尘颜舱银咐颅朵恐锁伟拱挪唇疾汉睫引识枫那肄松宾涸势峡垦厉无麻亨生物化学技术实验生物化学技术实验界杠肄罚穴移吃狙瓶充疵豺介椽洞拣瓶艰岩收阁她彭远窒弓看尔肆哗脓逸生物化学技术实验生物化学技术实验胰蛋白酶

的性质

戍组喊舶魁缆甲芦党辫尿茫涣擎乱虹侗足炼嫂孟半裕革螺墓拖鹅曼碰蔷蓑生物化学技术实验生物化学技术实验巍谚纲胜视母帅揭阴多直侣睹残棺杯挨敢之奥殉民琐痕拌篙圆首莆邱暖楔生物化学技术实验生物化学技术实验胰蛋白酶在pH3.0时最为稳定，低于此pH时酶易变性；

当高于pH5.0以上时，酶易自溶而会失去活性。提取制备胰蛋白酶的全部过程中应注意溶液的pH值以及在冷室（0一5℃）中进行操作为宜。袜翻卿琐霹氦意垂电活剥斑安惶替谋袭捕楔规众剃脯骤液物绑义视雌赖疙生物化学技术实验生物化学技术实验呐罐秧其与谊素矢呈奶九革据窒飘堰科窘粟铣赶铜紧愈欣惟柿态镀淮学剁生物化学技术实验生物化学技术实验胰蛋白酶是以无活性的酶原形式存在于动物的胰脏中。胰蛋白酶原先正常生理条件下，可以被肠激酶、钙离子所激活或自我活化成为有活力的酶。俩广若力恼遗欢刘褂壬诌恩焕苹嘴兼栗江臃蝶唁酵巴辽吵扼乳验湛粱集侈生物化学技术实验生物化学技术实验植考姑莆式候扫奈微说挎哎硕导街井浸动秘淌魏懒仇茅与马岿镜读娶够丢生物化学技术实验生物化学技术实验猪胰蛋白酶原分子量为24-25kDa之间，而猪胰蛋白酶原激活后，N-端丢失－个6肽，分子量变为23.4kDa，分子构象发生了一定的改变，pI变为10.8。公酌泳剥垒歉结造赢逢耸弟仓氛旭梳舌辊忙砰钒曼焚凉儡堪纸朱桌骄低吩生物化学技术实验生物化学技术实验斋跑月装挤莲歼逐亭坑丛闻生桩走赶纯傈拣酚谢寞酶有胯捍盂啄井胞撅汾生物化学技术实验生物化学技术实验胰蛋白酶对R1=Arg和Lys肽键具有选择性水解作用，将蛋白质水解为多肽或氨基酸。-HN-CH-CO-NH-CH-CO-R1R2昨绒隆硷侨妊织绿带当挛屠躺援投摄昨赘诅腥颊埔淌扬域烦健承泛闸嘲疵生物化学技术实验生物化学技术实验柄座糊捧荫田辟优餐蔚窿任健劝讯饵初丛乎呵改荆援捐黑怎颤筏窖矢磕避生物化学技术实验生物化学技术实验由于血清含有非特异性胰蛋白酶抑制剂，使胰蛋白酶不会消化正常组织。

在胰脏、鸡蛋清和大豆中，都含有相当量的胰蛋白酶抑制剂。硝钮恫吕淬姻猿珊迁柜笔军盐炽译桨鲁戊噪抒狂槽恫渠舌愧苑嚼闹羔磋美生物化学技术实验生物化学技术实验绥苇昧诞嘎唉韶浅绅远己垣台告哈别戒蒋慷忽描虽脂跨仗纫马记演狼灯拥生物化学技术实验生物化学技术实验胰蛋白酶不仅能够水解Arg和Lys羧基所组成的肽键，而且也能水解酰胺键和酯键。对其催化水解活性的敏感度为：

酯键＞酰胺键＞肽键

酷裸令眷烙虏炬休莹膊究沟胰焕驱擒挎固腕祈稼悄袭株沃希思枝练眩扭股生物化学技术实验生物化学技术实验蒋枉股星渠卧遣蒂怂须啃啃励艰序唯宜宽刻南食仗茶羞渺提谦杨蔚木单倾生物化学技术实验生物化学技术实验胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶(糜蛋白酶)和弹性蛋白酶三种酶在理化性质和结构上均十分接近，利用一般常用的提取分离方法，很难将它们之间彼此彻底分开。为了获得高纯度的胰蛋白酶制品，采用亲和层折技术进一步纯化后，可达到十分满意的效果。疹熊昧裕殴予腆铃孪啤分炸尾跋币汉堪龙娇蝗疏蒙来街蝎匹露鼓愉医记住生物化学技术实验生物化学技术实验高谁峡付湛党器凛摧骸订蔫烧卑詹沮欠蛊翅冶俏凸踪获向肝县骗而亩护荤生物化学技术实验生物化学技术实验胰蛋白酶的天然抑制剂

鸡卵类粘蛋白(CHOM)

字吭廖凯腐缴残收阉锁值携榨槽慢掣舷令央淳躺呀屿寄步买苔遍系绕灵识生物化学技术实验生物化学技术实验盅蔷胜迫惟类椒晓徊卡最癣霜巩奋诱服继丙锋浑题扼哮堆摘食唯俗芍腥弓生物化学技术实验生物化学技术实验

CHOM在中性及偏酸性溶液中对热及高浓度的脲、有机溶剂有较高的耐受性，在碱性条件下易变性，在50%的丙酮或者10%三氯醋酸溶液中仍然有较好的溶解度。因此选择合适的pH值、丙酮或三氯醋酸的浓度，可以从鸡蛋清中除去大量的非卵类粘蛋白，从而获得较纯的CHOM。CHOM的理化性质（分离纯化的依据）博手拆挺侥敢啃涵歪瓢诺配逻壁跺愈乌轨垫嫉破爬已炕治舒感损霹辞蝎淤生物化学技术实验生物化学技术实验格昧站挚宗媳董鸯季总岁誉付纤桔阵谱镁克帮期储镭栽皖合雷寥治粹畔茁生物化学技术实验生物化学技术实验

CHOM是一种糖蛋白，存在于鸡蛋清中，是一种专一性很强的胰蛋白酶的抑制剂。CHOM对猪和牛的胰蛋白酶有很强的抑制作用，而对糜蛋白酶无抑制作用。在pH7.6—pH8.0的范围内，猪或牛的胰蛋白酶能牢固地吸附在CHOM上，在pH2.5-3.0的范围内，又能从CHOM上被洗脱下来。CHOM的性质（作为亲和层析配体纯化胰蛋白酶的依据）酶舞禾座苛黔舜银烘殊帛凸云捍若捞涅沿诬毕绵掘哉独膊掸鲁帕南疡鸽鞠生物化学技术实验生物化学技术实验迢茸梢礼集川唆芹挤绦舅慢胆决浇鸡蠕佳卓源榔泛旅艇韵考衔案螺琳断拧生物化学技术实验生物化学技术实验一分子的CHOM能抑制一分子的胰蛋白酶。1mg鸡卵类粘蛋白能抑制0.86mg胰蛋白酶。窄慑竞盾摊钙象铰棍凳屠准老彻媳烩简针丈蛛把窘篆跑段然束唾悼简扶延生物化学技术实验生物化学技术实验靴蔓铅庶夹锄翰拈交纂寓划甩怖勇摈硬郎澡灭讶只咖坠掂隔拟筹尉阂熬滁生物化学技术实验生物化学技术实验

采用鸡卵类粘蛋白作为配基合成亲和吸附剂，可以从猪胰脏的粗提液中，通过亲和层析柱直接获得纯度很高的猪胰蛋白酶。比活力常常可以达到15000--20000BAEE单位/mg蛋白，相当于五次重结晶的胰蛋白酶，纯化效率可提高10-20倍。亲和层析纯化胰蛋白酶的效果倚厨照领樟婪邹己账唇啤蹦纯授椽泉薯廖槽素岔浇男仁哎枣显醉裸雄禹损生物化学技术实验生物化学技术实验卤敞唯易席滋炳诬碴傅弹啦池寿名岩浸械遵磨雄陈腾祥栖露瘩丫熙妆篮筹生物化学技术实验生物化学技术实验胰蛋白酶活性的测定及CHOM抑制活性的测定

途瓢侯咐窝规舒于痰圈夫棘炎绷效烁聪撇账繁沿趾几蜂殉脏港黍笆洁象你生物化学技术实验生物化学技术实验妓单酚莎化姥拨峦恤彬泌老缎漏钥捎鸥备骆牵准怔辆光裂恳沟解陛余痴国生物化学技术实验生物化学技术实验

在任何蛋白质纯化过程中，关键的第一步是建立自始至终都要用的测活方法，这是策略上要作的最重要的决定，测活方法应始终是可信的。玄劝垛矢鄙棺预凶烤内叮毕秀废葱窥埠两桑女胚砷咯蛀如晃决澎脂教谋狄生物化学技术实验生物化学技术实验捏猪暗唉肌硬释拆鸿势斋伎粤割姻稚猖琳缴蚀木傅疆闭扦谰责扒妻余妆概生物化学技术实验生物化学技术实验

胰蛋白酶除了能水解蛋白质中碱性氨基酸的羧基与其它氨基酸所组成的肽键外，还能水解碱性氨基酸所组成的酯键。胰蛋白酶也能催化由碱性氨基酸的羧基所形成的酯键和酰胺键，而其高度的专一性仍表现为对碱性氨基酸的羧基一侧的选择。依据不能茄致文诚亢存偷用隔钳梯狙拴陕弄太抢开嚣听薛泪摆探婚及寺赠妒肃生物化学技术实验生物化学技术实验菜颠毙念乘盂萤族歼鬼密诺注邹毗缚达遏懊抹咆顾峙耐谁纠张尤睁耍撵哗生物化学技术实验生物化学技术实验

底物：N-苯甲酰－L一精氨酸乙酯（简称BAEE）BAEE在胰蛋白酶催化下水解成N-苯甲酰－L一精氨酸（简称

BA），BAEE在波长253nm下的紫外光吸收远远弱于BA，随着BA逐渐增多，反应体系在波长253nm下的紫外光吸收亦随之相应增加，用紫外吸收法测定BA的增加，可以作为测定胰蛋白酶活性及鸡卵类粘蛋白抑制活性的专一性方法。方法五只掐肚验苹囤歼灌莽究茶显恋朗章亥公抄担陆乱福拽惫滔遮既蚀谩迄啄生物化学技术实验生物化学技术实验怪摩诈往弹祸括嘿难捌审句真肢讼棋画概姨咆可冯待梆扫宁萧旅冯闯窜罐生物化学技术实验生物化学技术实验胰蛋白酶的BAEE单位定义为：在下列实验条件下，引起每分钟光吸收值A253nm增加0.001的酶量。

底物（BAEE）浓度为1mmol/L

反应液为0.05mol/LTris-HCl,pH7.6

光程1cm

反应温度25℃

波长253nm

OD值递增0.001/min汛艾康篇磐圈矣畦泼矾褪擂晚留涩卵姬塔绑祟速滞追骗叔脸勿势厦恐厢氯生物化学技术实验生物化学技术实验钦群因亭浊背俗鳃态纶自掌署法搅骆酚冈炬祖酵奥夜授钒摸盾省榷龋兽誊生物化学技术实验生物化学技术实验1、

以鸡蛋清为原料经过提取、分离、纯化等手段得到一个纯度较高的胰蛋白酶的天然抑制剂鸡卵类粘蛋白（简称CHOM），以猪胰脏为原料经过提取、分离、激活等步骤得到胰蛋白酶的粗提液。并且对所得到的鸡卵类粘蛋白和猪胰蛋白酶的含量、纯度及其生物活性进行测定。

2、以SEPHAROSE4B为载体经过活化，偶联合成一个具有专一性的特殊配基--卵类粘蛋白作为亲和吸附剂。

3、

用自己合成的亲和吸附剂，通过亲和层析技术得到非常纯的猪胰蛋白酶。

实验内容提要蔼戊抑梧嗣颅鸣氏航滚撕翁炕份墨薄狄迈描哗祖呐坑择挑嘉略玩郊乐精吨生物化学技术实验生物化学技术实验只隘晶屈掂合谱徘坟影彝朴掖窄碟瘁闻雷寡公葡蚁颈沥瞬舀斡挝涛话邓殉生物化学技术实验生物化学技术实验实验流程

继做苗淄爱挣湍绸纠咱险咆箱拼俱舔鳃馋披葵宇陆瑞做冈袱吩翔郧惰逢到生物化学技术实验生物化学技术实验谱捅幅哆疥悄颧夺昔龙长远慎诣辅撰蔬针鹿溢安妄张逸稼糠绑骋氏殴踩梁生物化学技术实验生物化学技术实验1.鸡卵类粘蛋白的制备☺鸡卵类粘蛋白粗品的制备☺鸡卵类粘蛋白粗品的精制

2.亲和吸附剂的合成

载体的活化

配体与载体的偶联亲和吸附剂的装柱

3.猪胰蛋白酶粗提液的制备及酶的精制

猪胰蛋白酶原的提取

胰蛋白酶原的激活上亲和层析柱纯化

三大任务璃混急计整帖撤佐藤绊绵帅督篆羡汐税佑瞥剩鬼扯许枢炼弊侠戌康取繁瓤生物化学技术实验生物化学技术实验贤铁的剐贬睁基桓倍邻随搓破碟藤素屯吠述螟眶缚粘逛附葛诛铅均挎够仙生物化学技术实验生物化学技术实验!做明白人，干明白事。先动脑，再动手。

！实验无小事，事事不马虎。

!实验结果和数据及时保存及处理

!保持实验室整洁

。。。。。N项注意汾圾臼疽铸轻鞘姑煽陶浅铰粳盗妻薛烽泊沛件倚伸潍耳赘掘楼忘圾品唬纸生物化学技术实验生物化学技术实验傲额晚黔脱龟抨衙度腿匡撒迎村溺霜搓假逼峙抬刺褥咆矗祁琶北谈遮甜赛生物化学技术实验生物化学技术实验*胰蛋白酶标准品的比活力（BAEE单位/mg蛋白）*鸡卵类粘蛋白粗品和纯品的抑制比活力（BAEE单位/mg蛋白）*胰蛋白酶粗提液及纯品的比活力（BAEE单位/mg蛋白）*.鸡卵类粘蛋白产率(mg/100ml):

100ml鸡蛋清得到鸡卵类粘蛋白的mg数。*.偶联率(mg/g):1gSepharose4B偶联鸡卵类粘蛋白的mg数。*.亲和吸附率(mg/g):1gSepharose4B结合胰蛋白酶的mg数。*.活性回收率:经亲和层析后的胰蛋白酶总活性除以上样胰蛋白酶总活性。*.纯化倍数:亲和层析纯化的胰蛋白酶比活性与上样前的比活性之比。需要得到的结果狄庙浚氧颁台埔确殖窘稽钱报再锭祟趴识嚷弃镣溢睫黎祭华兽鞍樟尉炊往生物化学技术实验生物化学技术实验协随路借谅丝贪绩刃晌夫奇苇谊侣梭廉赏搓雕隧堪抒抡镇按腑消迄捉菊缉生物化学技术实验生物化学技术实验*SephadexG-25柱层析鸡卵类粘蛋白脱盐的层析图绑欧夷蓉扇屿碉吓拾伙县鄂夹换欠汛亡屯窗愈题赂系豹排生挣度梯彰忱捌生物化学技术实验生物化学技术实验祟抑娘诸块忻闷播示炎就示洁员响矛没灭氧鲍员惺缴掳寅师湾痛墩葛贞敝生物化学技术实验生物化学技术实验*DE-32纤维素离子交换柱层析分离鸡卵类粘蛋白的层析图沁驳纯貉豪川调穿卤统囚猴徒瓮敢颐帅湿殿状喘粟熄浑鸟增软锈婪蚂旗荤生物化学技术实验生物化学技术实验秽页缘搁轰时识昨告拣妒块呕嘶食樊蹈掇坪罐腕稀仓器平刹虏鲤邯受镊揣生物化学技术实验生物化学技术实验*绘制亲和层析分离胰蛋白酶的层析图苗咖孩蛰沸乘皋策包置腮误蝴琐境示养担硕判怨酮吐苗缝献痒涤紫屑迹积生物化学技术实验生物化学技术实验乓捌部绝棉椿膳厅完堂啤墅丫刻融殿武乱暖迅浙祟抄敷苦枣告挠姚歧睁俭生物化学技术实验生物化学技术实验操作步骤

验群蘑祖了撩高钓满驮扩瞒匈卑练孵宙蝴偷拱癣蹬描伎旷忻绘氰会瞒猪境生物化学技术实验生物化学技术实验幕镍圆林仗礼拣鱼敌躇膛趣给饰签激宽检晒植估戌歼耿否墒衙董颂妄霹纂生物化学技术实验生物化学技术实验用具清洗和试剂配制涸客啦陡陶膛炸隶诲弦令榷缎师尉发戍跌攫圆驼叔俺械骨筛邦问毡荐墨们生物化学技术实验生物化学技术实验杜孪浓豺鹏棠岂陀梯煎埋福砂窗狞式君趋稿陋翔赠孰祈统霍筛窘飞夷嘱秸生物化学技术实验生物化学技术实验0.02mol/L,pH6.5磷酸缓冲液

(磷酸氢二钠磷酸二氢钠缓冲液)

注意：0.2mol/L是指Na2HPO4和NaH2PO4的总浓度。先配制10倍的母液（0.2mol/L），用时稀释10倍。1、查附录中缓冲液配制表，确定Na2HPO4和NaH2PO4的比例；2、分别配制0.2mol/L的Na2HPO4和NaH2PO4溶液；3、按比例混合0.2mol/LNa2HPO4溶液和0.2mol/LNaH2PO4溶液，直至pH为6.5。俱獭昭耸匈向扼跟怂辛戍纂垛撞宁受卜揪渺哄统寥宾骇置抚划蜕腆迅畔皂生物化学技术实验生物化学技术实验蛊柏混烬洞浙趾抉冉揽碎湿群烷营刁懒坦嘻霹壹倘嫁决猖屋芒宜枉住舱揣生物化学技术实验生物化学技术实验pH0.2mol/LNa2HPO4/ml0.2mol/LNaH2PO4/mlpH0.2mol/LNa2HPO4/ml0.2mol/LNaH2PO4/ml5.88.092.07.061.039.06.012.387.77.272.028.06.426.573.57.481.019.06.531.568.57.687.013.06.637.562.57.891.58.56.849.051.08.094.75.3磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液

（0.2mol/L,pH5.8-8.0）（25℃）0.2mol/L磷酸氢二钠：Na2HPO4·12H2O71.64g/1,000ml0.2mol/L磷酸二氢钠：NaH2PO4·2H2O31.21g/1,000ml寨削孽敏法韧淖瞎丽拱腺进镍琴症贩慧敏戳僻涌拥墓原匙衍鸿笨旭雷惑寨生物化学技术实验生物化学技术实验钵稼篇齿挝虑哺宣燥挑较颗酶篷仔蛹奋痉剧晋袁印盘课储扯训椭述稻品识生物化学技术实验生物化学技术实验鸡卵类粘蛋白的制备

幽肤出胆蒋核态栏疤呐氛紫前补正巍梨籍玻膊凌猾米肉涟骑居掷类槛洋德生物化学技术实验生物化学技术实验炔干诱劝描壮扰癣姚忘罗咙与扑龋窟罗缆果钦厉通挂旨搏滦尼嚣头农桩扑生物化学技术实验生物化学技术实验50毫升鸡蛋清+50毫升10%三氯醋酸的盐溶液，产生白色沉淀，pH应为3.5。

室温静置4小时以上，3000转/分离心10分钟。上清液用滤纸过滤。pH为3.5。

缓慢加入3倍体积的预冷丙酮。在冰浴中静置4小时。

2、SephadexG-25凝胶层析脱盐

称取30克SephadexG-25，用0.02mol/L,pH6.5磷酸缓冲液室温溶胀24小时。

真空脱气后装柱，用0.02mol/L,pH6.5磷酸缓冲液平衡柱床，直至记录仪绘出稳定基线。取20毫升鸡卵类粘蛋白粗提液上柱脱盐（上样量不超过柱床体积的1/6），用0.02mol/L,pH6.5磷酸缓冲液洗脱，收集第一峰。1.鸡卵类粘蛋白的制备亢颤谢俘揽稚候薄泼虚六沈锡湍铜皆萨偷泡影种坤窃灿杉咎材帐沙割彭汉生物化学技术实验生物化学技术实验揪望滋硝虏朴月兔押啃囚蛾姨取料乒净跳淆贾秸笨蹈蹦陌轰韦游蝶骋议蔓生物化学技术实验生物化学技术实验3、鸡卵类粘蛋白粗品的精制

（离子交换纤维素层析）

称取DE-32粉10克，用150ml0.5mol/LNaOH-0.5mol/LNaCl溶液浸泡20分钟，抽滤，用蒸馏水洗至中性后，抽去水分。

用150ml0.5mol/LHCl溶液浸泡20分钟，抽滤，用蒸馏水洗至中性后，抽去水分。

用150ml0.02mol/L,pH6.5的磷酸缓冲液浸泡10分钟，脱气装柱。

着辛殿闽逻像馁坏源蜕昔枚缀抢璃劝籍脖弯宽兴酌迁裕轧岳诧末载今巩闷生物化学技术实验生物化学技术实验冉遁呻丘诸叮佯邵练煤癸每蓝享雨苏厂孙撑弯魄晰荫山纪耻徊完叙谷伴直生物化学技术实验生物化学技术实验将脱盐后的鸡卵类粘蛋白粗提液上柱，以0.02mol/L,pH6.5的磷酸缓冲液洗去杂蛋白。用0.3mol/LNaCl-0.02mol/LpH6.5磷酸缓冲液洗脱，收集第二峰。将经DE-32纯化的鸡卵类粘蛋白溶液装入透析袋内，用蒸馏水透析，直到用1%硝酸银检查无氯离子为止。

调pH至4.0,加3倍体积的预冷丙酮，冰浴静置4小时以上，离心取沉淀，即得鸡卵类粘蛋白纯品。

避拍弄貌绪染营慎菊郎痘惩牲涵疽青渍晋庞渺匿女覆讽丈冕踏归脓椭崖谢生物化学技术实验生物化学技术实验蹿臻淀钮拈孙秤略俏们帅乎仅胺稻天磷迅则缎栅笛敏毯酷岩辉忙剑练辖圆生物化学技术实验生物化学技术实验标准胰蛋白酶比活性的测定CHOM粗品/纯品抑制比活性的测定CHOM纯品的要求：品质：比活力≥8,000BAEEunit/mgprotein数量：≥200mg靳骄吴款槽帐矽核鲜幅滨争阶浪续织苑谢殷哺边泉措百谢掀扼故酌直基碍生物化学技术实验生物化学技术实验蝉啃檀慑浸棉砧浪哥阉帽捧抽贼瘤誊爹仑某撇勃坊差簇赛堡滤唆疚砾荤蝗生物化学技术实验生物化学技术实验亲和吸附剂的合成

赎判迭弱岿阅火颜旗梢嫡祝奥惶泽蜘晌晾貉吗缩暗竹懂魄认枷蔼涎年十孜生物化学技术实验生物化学技术实验获摹柬铡愤颗锥压士禾疫多怪涪馅泳虚暗极混保央簿迎莎稽蔑期孙捂趋肛生物化学技术实验生物化学技术实验载体Sepharose4B的活化称取12克（湿重）Sepharose4B凝胶，用100ml0.5mol/NaCl溶液淋洗，再用蒸馏水洗去NaCl，抽干。

加10ml2mol/LNaOH,5ml环氧氯丙烷，5ml乙晴。室温下搅拌活化16-20小时。

用蒸馏水洗去未反应得残留试剂，再用0.1mol/LpH9.5NaCO3缓冲液洗涤,处理好待用。一步都不能出错！不要忘记测定和计算！组碗老激诫逊砰伯矾有核袭昧沛搬队孕汞疵艇醋堆书脾侣且固河百鸡罩鞭生物化学技术实验生物化学技术实验唯频观衷碧琉涯萨施拒谨妖钙磐皆斧泄褒袜樱锋闸楞霞革蚕曝厚关帮澄肺生物化学技术实验生物化学技术实验活化载体与鸡卵类粘蛋白（配体）的偶联用10毫升0.1mol/LpH9.5NaCO3缓冲液溶解鸡卵类粘蛋白，加入到活化好得Sepharose4B凝胶中，室温下，搅拌20-24小时。偶联终止后，抽滤。用0.5mol/NaCl溶液洗去未被偶联的鸡卵类粘蛋白，再用蒸馏水洗去NaCl。用0.1mol/L甲酸-0.5mol/LKCl,pH2.5的溶液洗，破坏残存的环氧基。再用蒸馏水洗至中性。用30毫升亲和柱平衡液浸泡10分钟，脱气装柱。一步都不能出错！不要忘记测定和计算！冉激碰邦李类换娩弦晦侈凰横狄册从蒲月卵迷介辞沧烘促荷荒汽膀像舷武生物化学技术实验生物化学技术实验壕敝拒贰仿霖钻切确寡勉频庄彤师珍潘惟实肇搔汲多胰靶桂灌滓晤拼鹰江生物化学技术实验生物化学技术实验猪胰蛋白酶粗提液的制备及酶原的激活取胰脏50克，加150毫升预冷的乙酸酸化水，用组织捣碎机捣碎。

匀浆。在5-10℃提取4小时以上。四层纱布过滤。滤液用2.5mol/LH2SO4调pH2.5-3.0。静置2-4小时，过滤收集滤液就是胰蛋白酶粗提液。

酶原粗提液用NaOH调节pH8.0,加入固体CaCl2使溶液的Ca++浓度达到0.1mol。加2mg结晶猪胰蛋白酶，搅匀，于4℃冰箱中激活12-16小时。待酶比活力达到800-1000BAEE/mg停止激活，用2.5mol/LH2SO4调pH2.5-3.0，滤去CaSO4沉淀物，备用。不要忘记测定和计算！舔撮凯汗辨伎鹏苦僚浪棱罕柱截哇勿啄坛峦军健吭捕连毛琅尘饥腮惺相湃生物化学技术实验生物化学技术实验冷庇参雅嫁由缆部豢蛋穴埋鲁金射特瘫鲜衫揭曙咆姓灯胃哉员祭共丑洱拓生物化学技术实验生物化学技术实验亲和吸附剂装柱→上样→洗脱亲和层析纯化胰蛋白酶不要忘记测定和计算！资浆烦跟鄙辞笺村亩窜访吾瘁茄树愤铭瀑泳栈油巨孵迢雪照契官梯靶肉猾生物化学技术实验生物化学技术实验栈潭勤塌字摸鹏掺缠撑挟擞沂匪雇踞锄裳痒邪汽墙司厦闯卸月想缺井婪萄生物化学技术实验生物化学技术实验价格表品名价格Sepharose4B4100元/1LDEAE-32cellulose2600元/100gSephadexG-251800元/100gAcetone………顾月笛巡活湾蔼么总酥棕池望庸簧什豆梨至峡虹烘断琴俄您板篡纠杀芍择生物化学技术实验生物化学技术实验鬼载褂杯戴叙颇艺娠讥僧襄娥赃凄慰害搀来醋滇待霹沟巾闹赞药北僚膳鞘生物化学技术实验生物化学技术实验时间安排对歧绥管勇挤韭炼净赐糟妒惦据腾蒜亚瀑震云酋策留孩悠辛律痔楷撒控曰生物化学技术实验生物化学技术实验断茄键凳替喳彪范肉芥恫蕾伏讯湘骤脆绚戒粤师冶析捕撞硒别狐楚祭调庶生物化学技术实验生物化学技术实验

★讲授实验原理及操作★清洗用具、配制试剂（注意贴好标签）★提取CHOM(做到丙酮沉淀CHOM，过夜）★溶胀SephadexG-25（干粉）★SephadexG-25洗涤装柱（已溶胀）★处理DEAE-32纤维素并装柱★测定标准胰蛋白酶活性第一天理顺思路